銅離子對PrP 轉(zhuǎn)基因線蟲的影響

朱淼，高躍，李忠義，鞠傳靜，3，孟軻音，王雄，郝雯麗，萬家余，陳志寶

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所；3.吉林大學(xué)第四醫(yī)院；4. 吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部畜牧獸醫(yī)學(xué)院）

當(dāng)Prion 朊蛋白感染機體，我們稱海綿狀腦病或者朊病毒疾病。朊病毒疾病是具有傳染性及致命性的一種神經(jīng)系統(tǒng)變性混亂疾病，細(xì)胞內(nèi)的朊蛋白（PrPC） 發(fā)生錯誤折疊后會轉(zhuǎn)化為朊蛋白的亞型（PrPSC）[1]，其組織病理學(xué)表現(xiàn)為：中樞神經(jīng)會發(fā)生海綿性病變及淀粉樣沉淀，并伴有空泡出現(xiàn)，膠質(zhì)細(xì)胞增生等現(xiàn)象。PrP 的基因（PRNP）有20 多個突變位點，該位點突變后與朊病毒神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。其中，PRNP 基因的102 位點突變（P102L）可導(dǎo)致吉斯綜合征（Gerstmann-Straussler syndrome，GSS）的發(fā)生[2-4]。目前，對銅離子與朊蛋白的研究已經(jīng)有了一些進展，Morrillas[5]等發(fā)現(xiàn)PrP 在細(xì)胞膜上有特定的構(gòu)想，能與銅離子特異性結(jié)合；Pauly 和Harris 發(fā)現(xiàn)銅離子可以調(diào)節(jié)細(xì)胞膜上的PrP 的含量[6]；Qin 等[7]通過實驗發(fā)現(xiàn)當(dāng)銅離子達到一定濃度時，能夠促進PrPC向PrPSC轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)為β 折疊變多以及抗蛋白水解酶（PK）能力提高，由此可以推斷銅離子達到一定濃度時，可能是引起PrP 致病的重要因素之一。

新秀麗線蟲是已經(jīng)被研究最為清楚的模型動物之一，其對周圍環(huán)境變化較為敏感。由于其作為獨立的個體生物，具有結(jié)構(gòu)簡單，生命周期短，在實驗室易于培養(yǎng)等優(yōu)點，使其成為國內(nèi)外研究神經(jīng)損傷模型的首選，例如帕金森疾病模型[8]，阿爾茨海默病模型[9]等。實驗主要用于研究不同濃度的銅離子對PrP線蟲模型的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

氯化銅CuCl2（分析純）溶于雙蒸水配成濃度為10-2mol·L-1溶液后，使大腸桿菌OP50 配成終濃度分別為10-6mol·L-1，10-4mol·L-1及10-3mol·L-1三種濃度，放在4 ℃條件下保存。Western Blot 實驗中的一抗為PrP 抗小鼠單克隆抗體1F11/E9，實驗室購于Abcam 公司，二抗是山羊抗小鼠商品化抗體，實驗室購自Sigma 公司，貨號SAB4600238。配制M9 Buffer高壓后使用。Bacto Agar 和Bacto Peptone 都是購自BD 公司，Cholesterol 是購自SIGMA 的產(chǎn)品。M-280是購自Invitrogen 公司，基因組DNA 試劑盒是購自AxyPrep，BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天，生化培養(yǎng)箱型號HSP-250，冰箱型號BCD-279/HC，恒溫培養(yǎng)振蕩器型號ZHWY-200B，顯微鏡型號分別為ZSA301 和SZX16。顯微注射儀eppendorf FemtoJet express。

1.2 構(gòu)建轉(zhuǎn)PrP 基因?qū)嶒灳€蟲

選取飼喂較好的L4 年齡段的野生性N2 線蟲，用礦物油固定在干燥的2%瓊脂糖平板上，用微量加樣針分別抽取20 uL 的質(zhì)?；旌衔铮╠at-1 PrP+dat-1 GFP），利用顯微注射儀小心地移動顯微注射針和倒置顯微鏡載物臺注射線蟲腺管的有絲分裂區(qū)域，小心地用拾取針挑取在礦物油中游動的線蟲，除去礦物油并放入OP50 培養(yǎng)液中，一個h 后將該蟲移入另一個新鮮OP50 培養(yǎng)基皿中以去除殘留的礦物油。

1.3 試驗線蟲的品系和來源

N2 為野生型線蟲，質(zhì)粒dat-1-PrP102Mut 和質(zhì)粒dat-1-PrPWt 為實驗室保存的，其中線蟲W101 是轉(zhuǎn)入質(zhì)粒dat-1-PrPWt 的線蟲，線蟲W102 是轉(zhuǎn)入質(zhì)粒dat-1-PrP102Mut 的線蟲。在沒有特別說明的情況下，線蟲都是生長在涂布有大腸桿菌OP50 的NGM培養(yǎng)基上，培養(yǎng)箱溫度為20 ℃，相對濕度為40%[10-11]。

1.4 線蟲PCR 鑒定和Western Blot 檢測

先將質(zhì)粒dat-1-PrP102Mut 和dat-1-PrPWt 顯微注射到線蟲N2 體內(nèi)，待注射的線蟲產(chǎn)下第一代子代，通過PCR 鑒定子代線蟲的PrP 基因，確定基因的成功轉(zhuǎn)入，首先取W101，W102 和N2 各一條分別作為模板，引物：上游5′-GATGCTGGTTCTCTTTGTG G-3′，下游5′-CCACTATCAGGAAGATGAGG-3′，經(jīng)PCR 擴增后，進行核酸電泳檢測，得到清晰的約750 bp 的核酸條帶。同時通過超聲破碎提取子代線蟲的全蛋白，然后在李奇等人濃縮蛋白方法[12]的基礎(chǔ)上加以改進，采用M-280 磁珠免疫共沉淀法將線蟲中的PrP 表達蛋白進行濃縮，然后用Western Blot 進行檢測。得到清晰的PrP 表達的一組介于20～37 kb的蛋白條帶。

1.5 食物敏感性實驗

實驗采用了PRNP 的102 位點突變的基因轉(zhuǎn)入線蟲體內(nèi)（W102），與轉(zhuǎn)入正常PRNP 的線蟲（W101）及野生型線蟲（N2）做對比，研究在不同濃度銅離子情況下，對三種線蟲的影響。首先對W101，W102，N2三種線蟲進行同步化處理，先將含有不同濃度氯化銅的大腸桿菌OP50 和不含氯化銅的大腸桿菌OP50分別鋪到NGM 板上，再挑選成年健壯的線蟲，用Picker 粘取食物，將三種線蟲分別粘到四種含有不同食物（分別是不含氯化銅的OP50 和含有氯化銅終濃度為10-6mol·L-1，10-4mol·L-1，10-3mol·L-1的OP50）的NGM 板上，生化培養(yǎng)箱中放置4 h 后，將其燙死，再過52 h 后，將其后代定為第0 d（D0）的線蟲，并每隔一天用Picker 將線蟲挑到一個新的板子上。分別在第0 d（D0），第2 d（D2），第4 d（D4），第6 d（D6）統(tǒng)計在不同食物中飼喂的三種線蟲食物敏感性。具體做法如下：用M9 Buffer 沖洗每種線蟲，將其放入食物的NGM 板子板上約一分鐘左右，觀察其在有實物中20 s 內(nèi)的擺動次數(shù)，并記錄。再以同樣的方法統(tǒng)計線蟲在無食物的NGM 板上20 s 內(nèi)的擺動次數(shù)（每條線蟲只能用一次）。每組線蟲有三個重復(fù)，每個重復(fù)有40 條線蟲。食物敏感性=（無食物中的擺動次數(shù)-有食物的中的擺動次數(shù)）/無食物中的擺動次數(shù)。

1.6 線蟲生命周期實驗

分別將三種線蟲W101，W102，N2 放到4 種含有不同食物（分別是不含氯化銅的OP50 和含有氯化銅終濃度為10-6mol·L-1，10-4mol·L-1，10-3mol·L-1的OP50）的NGM 板上，然后對三種線蟲進行同步化處理，方法如上，得到D0 期的同步線蟲，并每隔一天用Picker 將線蟲挑到一個新的板子上。并統(tǒng)計其死亡數(shù)。如果線蟲不擺動，將其所在的NGM 板敲擊桌面幾次，如果此時線蟲不動，再用頭發(fā)輕輕觸碰線蟲頭部，如果線蟲依然不動，則認(rèn)為該線蟲死亡。每組線蟲重復(fù)取40 條。

1.7 線蟲產(chǎn)卵數(shù)統(tǒng)計實驗

分別將三種線蟲W101，W102，N2 放到4 種含有不同食物（分別是不含氯化銅的OP50 和含有氯化銅終濃度為10-6mol·L-1，10-4mol·L-1，10-3mol·L-1的OP50）的NGM 板上，培養(yǎng)一段時間后，挑選每組的成年健壯線蟲，生化培養(yǎng)箱中放置24 h，將其燙死，再在生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，在顯微鏡下統(tǒng)計后代數(shù)目。每組重復(fù)取40 條線蟲。

2 結(jié)果

2.1 PrP 轉(zhuǎn)基因線蟲W101 和W102 的構(gòu)建

實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過PCR 鑒定發(fā)現(xiàn)，N2 沒有目的條帶，W101 和W102 均在750 Kb 處出現(xiàn)條帶（如圖1-A）。經(jīng)過Western Blot 檢測發(fā)現(xiàn)，N2 沒有目的條帶，W101，W102 及陽性對照鼠腦均出現(xiàn)PrP 的三條帶，但線蟲的PrP 位置與小鼠PrP 位置不同（如圖1-B）。

2.2 不同濃度的銅離子對PrP 轉(zhuǎn)基因線蟲的食物敏感性的影響

研究采用不同濃度銅離子處理W101，W102，N2三種線蟲，分別觀察其對三種線蟲的食物敏感性的影響。通過實驗發(fā)現(xiàn)，飼喂不含CuCl2的OP50 的三種線蟲，線蟲W102 在D0，D2，D4，D6 四個時期的食物敏感性都比同時期的另兩種線蟲W101 和N2 低，而W101 比同時期的N2 低，并且隨著年齡的增加，線蟲W101 和W102 對食物的敏感性都明顯在降低，在D6時降至最低（圖2-A）；當(dāng)W101，W102，N2 三種線蟲飼喂含有CuCl2濃度為10-6mol·L-1的OP50 時，在D0，D2 和D4 時期與飼喂不含CuCl2的OP50 組的線蟲做對比，發(fā)現(xiàn)在10-6mol·L-1濃度時，對三種線蟲的食物敏感性幾乎沒有影響；在成蟲的衰老期D6 期，線蟲W101 和W102 對食物的敏感性明顯下降，并且W102 和W101 相比下降更顯著。（圖2-B）

圖1 PCR 擴增和Western blot 分析Fig.1 Electrophoretic profile of PCR and analysis by Western blot

當(dāng)W101，W102，N2 三種線蟲飼喂含有CuCl2濃度為10-4mol·L-1的OP50 時，W101 對食物OP50 的敏感性，與CuCl2濃度為10-6mol·L-1相比，下降更顯著。發(fā)現(xiàn)三種線蟲在D0，D2，D4，D6 四個時期的食物敏感性都分別有所下降，但從D4 至D6 時期，W102 和W101 對食物的敏感性下降趨于明顯，并且W102 和W101 相比下降更為明顯。（圖2-C）當(dāng)W101，W102，N2 三種線蟲飼喂含有氯化銅濃度為10-3mol·L-1的OP50 時，發(fā)現(xiàn)三種線蟲在D0，D2，D4，D6 四個時期的食物敏感性急劇下降，而且野生型線蟲N2 對食物敏感性的下降隨著年齡的增加也變得更為顯著，并且早從D2 時期開始，在三種線蟲對食物敏感性都嚴(yán)重遲鈍的情況下，W102 和W101 相比下降的更顯著，直至線蟲在成蟲第D6 時期，對食物的反應(yīng)降至只有3.85%，基本喪失對食物的敏感性。（圖2-D）

圖2 食物敏感性試驗Fig.2 Basal slowing response

2.3 不同濃度的銅離子對PrP 轉(zhuǎn)基因線蟲的生命周期的影響

研究采用不同濃度銅離子處理W101，W102 和N2 三種線蟲，觀察其對三種線蟲生命周期的影響。通過實驗發(fā)現(xiàn)，飼喂不含氯化銅的OP50 的三種線蟲，線蟲W101 比野生型線蟲N2 生命周期有所縮短，而W102 縮短更為明顯，平均生命存活僅為13 d（圖3-A）；當(dāng)飼喂含有CuCl2濃度為10-6mol·L-1的OP50 時，W101，W102 存活率均明顯下降，W101 的存活率從第12 d 開始下降，W102 平均生命周期縮短至12 d（圖3-B）。當(dāng)飼喂含有CuCl2濃度為10-4mol·L-1的OP50 時，發(fā)現(xiàn)三種線蟲的生命周期都比飼喂CuCl2濃度為10-6mol·L-1食物的線蟲有所減少，W101 和W102 的存活率從10 d 開始下降，并且生命周期縮短（圖3-C）。當(dāng)飼喂含有CuCl2濃度為10-3mol·L-1的OP50 時，線蟲W101，W102 和野生型N2 的生命周期均開始明顯縮短，特別是PrP 突變性線蟲W102 的生命周期縮短至7～8 d（圖3-D）。

圖3 生命周期試驗Fig.3 The experiment of life span

2.4 高濃度的銅離子處理線蟲使其產(chǎn)卵數(shù)減少

研究采用不同濃度銅離子處理W101，W102，N2三種線蟲，觀察其對三種線蟲產(chǎn)卵數(shù)的影響。通過實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飼喂CuCl2濃度為10-6mol·L-1對三種線蟲幾乎沒有影響，只有W102 稍微有些下降。當(dāng)CuCl2濃度為10-4mol·L-1時，發(fā)現(xiàn)三種線蟲產(chǎn)卵數(shù)都有所下降，但W101 和W102 下降較為明顯。當(dāng)CuCl2濃度達到10-3mol·L-1時，三種線蟲的產(chǎn)卵數(shù)量都達到最低，其中W102 平均每天產(chǎn)卵數(shù)降到30 只以下（圖4）。

圖4 產(chǎn)卵數(shù)試驗Fig.4 The experiment of oviposition quantity

3 討論

有研究報道銅離子參與了阿爾茨海默癥的病理發(fā)生，但是實驗中用了很高的銅離子濃度，高濃度的銅（10-3mol·L-1）在成蟲后第8 d 顯著地加重了阿爾茨海默癥線蟲模型（Abeta 線蟲）的癱瘓行為，低濃度的銅（10-4mol·L-1）卻減少了Abeta 線蟲的癱瘓行為，更低的銅濃度（10-6mol·L-1）卻沒什么效果。同時研究發(fā)現(xiàn)用不同濃度的銅離子處理野生型線蟲N2，卻沒有觀察到癱瘓行為，這說明銅和阿爾茨海默癥關(guān)鍵蛋白Abeta 要發(fā)揮顯著的行為效果需要一個緩慢的時間，也證實了同濃度的高低影響Abeta 發(fā)揮毒性程度[13]。由于阿爾茨海默癥和朊病毒疾病為蛋白引起的神經(jīng)退行性疾病，以此為實驗依據(jù)，選擇了相應(yīng)濃度的銅離子對朊病毒疾病的線蟲模型進行實驗，對重金屬銅離子在朊病毒發(fā)病過程中產(chǎn)生的影響進行深入的研究。

動物的食物敏感性受機體的多巴胺神經(jīng)元來支配[14]，當(dāng)線蟲的食物敏感性下降，間接證明多巴胺神經(jīng)元損傷。通過觀察銅離子對PrP 轉(zhuǎn)基因線蟲的食物敏感性試驗說明，首先高濃度的CuCl210-3mol·L-1會降低線蟲對食物的敏感性，其原因可能是由于銅離子重金屬本身產(chǎn)生的細(xì)胞毒性對多巴胺神經(jīng)元通路造成損傷，并且隨著飼喂銅離子濃度的下降，線蟲的食物敏感性逐漸恢復(fù)正常。其次，通過該實驗發(fā)現(xiàn)線蟲的食物敏感性的降低與朊蛋白PRNP 也有一定的關(guān)系，在相同銅離子濃度情況下，野生型PRNP 轉(zhuǎn)基因線蟲W101 比自然野生型線蟲N2 食物敏感性下降多，表明朊蛋白表達可能會造成機體多巴胺神經(jīng)元通路的損傷，從而降低其對食物的敏感性，而線蟲W102 對食物的敏感性下降最為明顯，說明當(dāng)PRNP 的102 位點突變時，多巴胺的神經(jīng)損傷會更為明顯。第三，通過實驗發(fā)現(xiàn)，隨著年齡增加，線蟲對食物敏感性也會逐漸下降，這說明多巴胺神經(jīng)元的損傷和退化與年齡因素有關(guān)，再次印證朊蛋白疾病本身是一種神經(jīng)退行性疾病的說法。

通過實驗可以發(fā)現(xiàn)，高濃度銅離子會減少線蟲的壽命及產(chǎn)卵數(shù)，這可能是因為銅離子本身具有毒性的作用。此外，從數(shù)據(jù)中還可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PRNP 的102 位點突變時，數(shù)量減少得會更為明顯，由此可以猜想，當(dāng)PRNP 的102 位點突變時，可能對機體的存活產(chǎn)生影響，此時如果給予高濃度的銅離子時，將會產(chǎn)生疊加損傷的作用。

總之，在高濃度銅離子作用下，線蟲的食物敏感性，生長周期及產(chǎn)卵數(shù)量都會降低，可能是由于高濃度的銅離子會產(chǎn)生毒性作用，但從實驗結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，在高濃度銅離子作用下，轉(zhuǎn)入PRNP 的102 位點突變基因的線蟲SGC226 受到的損傷更為嚴(yán)重，表明PrP的發(fā)病機制與銅離子有一定的聯(lián)系，在銅離子濃度較高時，二者可能對線蟲產(chǎn)生疊加損傷作用。近幾年，越來越多的實驗發(fā)現(xiàn)PrP 與銅離子的關(guān)系密切[15-16]，實驗主要是希望能夠通過研究朊蛋白與銅離子，年齡，PRNP 的102 位點突變及多巴胺神經(jīng)的關(guān)系，為未來朊病毒疾病的治療提供一個的線索。此外，線蟲模型由于其實驗室操作簡單，生命周期短，繁殖迅速等特點，已經(jīng)成為研究許多疾病模型的首選，相信轉(zhuǎn)基因PrP 線蟲模型將對未來研究朊病毒疾病將具有實際的意義。

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