人體消化道高抗逆性雙歧桿菌的篩選

郭德軍，紀(jì)振杰，張平，張洪薇，張麗萍，王長(zhǎng)遠(yuǎn)，唐彥軍，肖念平

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319）

雙歧桿菌（Bifidobacteria）是一種人體腸道共生菌，作為一種重要的益生菌，現(xiàn)廣泛用于乳品發(fā)酵，用以緩解和治療腸道紊亂。雙歧桿菌對(duì)人體健康具有多種有益的作用，包括調(diào)整腸道微生物菌群，抑制多種病原微生物的生長(zhǎng)，提高免疫力等[1-2]。雙歧桿菌最初是從母乳喂養(yǎng)的嬰兒糞便中分離得到的，是一種革蘭氏陽(yáng)性、厭氧、不運(yùn)動(dòng)的分枝桿菌[1]；新分離到的菌株多呈Y 和V 型、刀狀或棒狀，繼代培養(yǎng)后，由于培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件的不適合，它常呈現(xiàn)為直或曲棒狀、分枝狀[3]。雙歧桿菌是人體腸道的微生態(tài)調(diào)節(jié)劑，其自身的耐酸、耐膽汁鹽及腸道黏附能力，是其能否發(fā)揮益生作用的關(guān)鍵因素[4-7]，經(jīng)人工胃液、腸液篩選和黏附性測(cè)定，篩選人體消化道環(huán)境高抗逆性雙歧桿菌，為其進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

從貝飛達(dá)雙歧三聯(lián)活菌膠囊、思聯(lián)康口服四聯(lián)活菌片、麗珠腸樂(lè)口服雙歧桿菌活菌制劑及大森林康樂(lè)片等四種藥品和母乳喂養(yǎng)的健康嬰兒糞便中分離出的5 株厭氧乳酸菌，經(jīng)16SrRNA 測(cè)序比對(duì)鑒定為雙歧桿菌，分別命名為A-1、B-1、B-2、L-1、Y-1，現(xiàn)黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基和主要試劑

12%的脫脂乳、改良MRS 培養(yǎng)基、BL 培養(yǎng)基、緩沖蛋白胨水溶液（BP）、pH6.98 PBS 緩沖液、10%牛血清DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液、0.1% DAPI；胃蛋白酶、胰蛋白酶、牛膽酸鈉、0.25% 胰酶消化液等試劑，均購(gòu)于上海生工公司；Caco-2 結(jié)腸癌細(xì)胞，吉林大學(xué)人獸共患病所保藏。

溶液A：以0.01 M pH6.98 的PBS 緩沖液為基礎(chǔ)，用體積分?jǐn)?shù)為37%的鹽酸將把改良MRS 液體培養(yǎng)基的pH 值調(diào)至3.0，115 ℃滅菌15 min。

溶液B：在改良MRS 液體培養(yǎng)基中添加0.03%的牛膽酸鈉，115 ℃滅菌15 min。

1.1.3 儀器與設(shè)備

厭氧培養(yǎng)箱YQX-II 型，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；激光共聚焦顯微鏡OLS3000，日本OLYMPUS 公司；二氧化碳培養(yǎng)箱HH·CP 型01A，上海一恒科學(xué)儀器有限公司等。

1.2 方法

1.2.1 黏附性的測(cè)定

將培養(yǎng)好的結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2 用0.25%胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，加入含有無(wú)菌蓋玻片的24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1 mL，在二氧化碳培養(yǎng)箱中37 ℃條件下培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后，PBS 洗滌三次，每孔加入1/10 培養(yǎng)基體積的DAPI 溶液，37 ℃條件下避光培養(yǎng)10～20 min，使細(xì)胞染色。無(wú)菌PBS 洗滌兩次后，加入0.5 mL 雙歧桿菌菌液和0.5 mL 含10%牛血清的EMDM 細(xì)胞培養(yǎng)液，37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，無(wú)菌PBS 洗滌兩次，加10%甲醛固定10～20 min，無(wú)菌PBS 洗滌兩次后留加200 μL PBS。將固定好的細(xì)胞爬片，蓋上蓋玻片，在油鏡下觀察，然后激光共聚焦顯微鏡觀察計(jì)數(shù)10 個(gè)隨機(jī)視野中20 個(gè)細(xì)胞上黏附的細(xì)菌數(shù)，取平均值。

1.2.2 抗逆性菌株的初篩

（1）耐酸試驗(yàn)：在溶液A 中，按10%的接種量接入已活化2 代的雙歧桿菌液體培養(yǎng)物，37 ℃厭氧培養(yǎng)2 h，期間每隔30 min 取樣，進(jìn)行梯度稀釋，使用BL 平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，每個(gè)梯度重復(fù)三次取平均值。

（2）耐膽汁鹽試驗(yàn)：在溶液B 中，按3%的接種量接入已活化2 代的雙歧桿菌液體培養(yǎng)物，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h 后，樣品經(jīng)梯度稀釋，BL 平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，每個(gè)梯度重復(fù)三次取平均值。

1.2.3 抗逆性菌株的復(fù)篩

（1）菌株對(duì)模擬胃液的抗逆性試驗(yàn)

pH 值3.0 的 改 良MRS 培養(yǎng)基，115 ℃滅 菌15 min，無(wú)菌添加胃蛋白酶5 mg·mL-1。按10%接種量接入初篩抗逆性較高菌株的培養(yǎng)液。37 ℃厭氧培養(yǎng)，分別于0、30、60、90 和120 min 取樣測(cè)其活菌數(shù)，以此判斷其對(duì)胃液的抗逆性。

存活率=不同時(shí)間的活菌數(shù)的平均值/0 min 時(shí)活菌數(shù)的平均值

（2）菌株對(duì)模擬腸液的抗逆性試驗(yàn)

pH 值6.9 改良MRS 培養(yǎng)基，并分別加入的0.01%、0.02%、0.03%、0.05%、0.2% 牛膽酸鈉，115 ℃滅菌15 min 后冷卻至室溫后，添加胰蛋白酶10 mg·mL-1，配置成模擬腸液；將初篩菌株按3%的添加量添加到模擬腸液中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后測(cè)其活菌數(shù)，并計(jì)算存活率。重復(fù)三次取平均值。存活率=24 h 模擬腸液處理后的每組實(shí)驗(yàn)活菌數(shù)的平均值/0 h 每組實(shí)驗(yàn)存活活菌數(shù)的平均值。

2 結(jié)果分析

2.1 黏附性

五株雙歧桿菌對(duì)Caco-2 細(xì)胞的黏附效果見(jiàn)圖1，黏附能力見(jiàn)表1。從表中可以看出，這五株雙歧桿菌對(duì)Caco-2 細(xì)胞的均有黏附作用，黏附能力略有差異，五株菌的黏附能力大小依次為Y-1＞B-1＞L-1＞A-1＞B-2。

2.2 初篩后的結(jié)果

（1）耐酸試驗(yàn)

五株雙歧桿菌在pH3.0 的A 液中作用120 min的結(jié)果見(jiàn)圖2，從圖中可以看出，這五株菌對(duì)酸均有一定的耐受能力，耐受性最弱的是菌株是B-2 和A-1，在培養(yǎng)120 min 后存活率分別為46.3%、56.7%；而菌株Y-1、B-1、L-1 在120 min 后存活率仍為93%、95.5%、86%，其中菌株B-1 耐酸能力最強(qiáng)。

圖1 五株雙歧桿菌菌對(duì)Caco-2 細(xì)胞的黏附效果圖（10×100）Fig.1 Adhesive capability of five bifidobacterium strains on human colon cancer Caco-2 cells

表1 五株雙歧桿菌對(duì)Caco-2 細(xì)胞的黏附結(jié)果Table 1 Adhesion results of five bifidobacterium strains on human colon cancer Caco-2 cells

圖2 pH3.0 條件對(duì)5 個(gè)菌株存活率的影響Fig.2 Effect of pH3.0 on survival rate of different strains

（2）耐膽汁鹽試驗(yàn)

五株雙歧桿菌抗牛膽酸鹽篩選結(jié)果見(jiàn)圖3，從圖中可以看出，這五株菌對(duì)牛膽汁鹽均有一定的耐受能力，但是A-1 的耐受性最弱，24 h 后活菌數(shù)為＜106cfu·mL-1，L-1 的耐受性最強(qiáng)，24 h 后活菌數(shù)為＞107cfu·mL-1。

圖3 膽汁酸鹽濃度為0.3 g·kg-1 時(shí)對(duì)五株菌生長(zhǎng)的影響（培養(yǎng)24 h）Fig.3 Effect of 0.3 g·kg-1 bile concentration on survivability of different strains

考慮到雙歧活菌產(chǎn)品服用時(shí)，活菌是先到胃再到腸道，所以優(yōu)良菌株必須對(duì)這兩種環(huán)境都有較高的耐受性，因此根據(jù)上述5 種菌初篩結(jié)果，選定B-1、L-1、Y-1 三株菌進(jìn)行復(fù)篩。

2.3 復(fù)篩后的結(jié)果

（1）菌株對(duì)模擬胃液的抗逆性

菌株B-1、L-1、Y-1 在模擬胃液中作用2 h。其存活率結(jié)果見(jiàn)圖4。試驗(yàn)菌株在模擬胃液中作用2 h 后，其存活率均大約70%；Y-1 在胃液中的抗逆性最強(qiáng)，其活菌數(shù)下降速度較其他兩株菌緩慢，在120 min 后其存活率約達(dá)76%。

圖4 模擬胃液對(duì)不同菌株生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of simulated gastric fluid on survivability of different strains

（2）菌株對(duì)模擬腸液的抗逆性

菌株B-1、L-1、Y-1 在模擬腸液中作用24 h，其活菌數(shù)結(jié)果見(jiàn)圖5。在含有不同質(zhì)量濃度的膽汁鹽的模擬腸液對(duì)這三株雙歧桿菌均有不同程度的抑制作用，隨著膽汁鹽濃度增加，抑制作用隨之增強(qiáng)，但不同菌體對(duì)膽汁鹽抗性存在明顯差異。在0.01%～0.03%的膽汁鹽濃度培養(yǎng)24 h 后，試驗(yàn)菌株活菌數(shù)盡管比對(duì)照有所降低，但是比培養(yǎng)前均有一定增長(zhǎng)。在0.05%和0.20%膽汁鹽濃度時(shí)，試驗(yàn)菌株活菌數(shù)均有不同程度的下降；其中L-1 的抗逆性最好，在膽汁鹽濃度為0.2%的模擬腸液時(shí)24 h 后，其存活率為14%，其活菌數(shù)仍＞106cfu·mL-1。

圖5 模擬腸液對(duì)不同雙歧菌株生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of simulated intestinal fluid on growth of different

3 討論

雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌等益生菌具有多種益生功能[6]，其中黏附是其腸道定植的關(guān)鍵一步，只有具有高黏附能力的菌株才能較多的定植于腸道，更好的發(fā)揮其生理活性，五株雙歧桿菌的黏附能力依次為Y-1＞B-1＞L-1＞A-1＞B-2，但它們的黏附數(shù)差異較小。使用激光共聚焦顯微鏡能清楚地觀察到雙歧桿菌黏附在Caco-2 的表面及邊緣上，且黏附后的Caco-2 細(xì)胞表面的結(jié)構(gòu)未被破壞。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在不使用DAPI 對(duì)Caco-2 細(xì)胞染色，同樣也能獲得較好的黏附觀察效果。目前，對(duì)雙歧桿菌在腸道細(xì)胞上黏附機(jī)理的研究普遍認(rèn)為，雙歧桿菌是通過(guò)一種叫作黏附素的物質(zhì)而黏附到腸道細(xì)胞上的，是雙歧桿菌的黏附素與腸道細(xì)胞相應(yīng)受體之間的特異性結(jié)合過(guò)程，腸道細(xì)胞是否具有相應(yīng)的受體及受體的類型決定著雙歧桿菌是否在特定的部位黏附[7-8]。

活菌能否順利通過(guò)胃酸關(guān)，其酸耐受能力是又一個(gè)關(guān)鍵因素。胃液pH 因飲食結(jié)構(gòu)不同而波動(dòng)很大，通常約為pH3.0 左右，空腹或食用酸性食品時(shí)可達(dá)到pH1.5，食用堿性食品時(shí)可達(dá)pH4.0～5.0；食物在胃中停留的時(shí)間通常為1～2 h，所以實(shí)驗(yàn)選擇pH3.0，作用時(shí)間2 h 作為初篩標(biāo)準(zhǔn)；除了胃酸對(duì)菌體存活有影響外，腸道中的膽汁鹽能改變菌體外膜的通透性，對(duì)雙歧桿菌產(chǎn)生抑制和殺滅作用，進(jìn)而影響雙歧桿菌的存活；已知不同來(lái)源的雙歧桿菌因膽鹽脫氫酶活性不同，對(duì)膽鹽有著不同的耐受性，人體小腸中含有膽汁酸鹽濃度一般在0.03%～0.3%，一般將0.03%膽汁酸鹽質(zhì)量濃度作為篩選耐膽汁酸鹽菌體的標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)0.01%和0.02%膽汁酸鹽質(zhì)量濃度對(duì)雙歧桿菌活菌數(shù)的影響很小，當(dāng)達(dá)到0.03%時(shí)，不同菌株抗膽鹽能力出現(xiàn)明顯差異，高濃度膽汁鹽時(shí)差異更加明顯。初篩獲得抗逆性菌株再經(jīng)過(guò)模擬胃液和模擬腸液進(jìn)行胃腸道抗逆性復(fù)篩，在模擬胃液中120 min 菌株Y-1 存活率最高，約為76%，L-1 約為72%；但是在模擬腸液在菌株Y-1 的在不同質(zhì)量濃度的膽汁酸鹽的濃度存活率最弱的，Y-1 在膽汁鹽濃度為0.2%時(shí)，24 h 后其活菌數(shù)＜104cfu·mL-1，存活率為0.08%；而L-1＞106cfu·mL-1，存活率為14%；L-1 在模擬胃液的存活率與模擬腸液的存活率乘積遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Y-1 乘積。因此，選擇抗逆性最好的L-1 菌株作為進(jìn)一步應(yīng)用的基礎(chǔ)菌株。

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