雞胚脾臟石蠟切片制作及H.E.染色方法改良的探討

王 鐵，王子旭，陳耀星

（中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 海淀100193）

石蠟切片和H.E.染色，是組織學的最基本的技術之一，至今已使用了100多年［1］。石蠟切片是目前組織標本制作的方法之一，其特點是可進行多種染色，細胞及組織層次感好，且能長期保存完好的組織形態(tài)［2］。石蠟切片制作和染色過程中涉及的因素很多［3］，各個環(huán)節(jié)均需要操作者根據(jù)所制作的組織不同嚴格篩選試驗條件［4］。已有大量文章進行石蠟切片方法學的研究，如組織固定不充分，會導致切片灰染［5］，脫蠟不徹底導致染色不良［6－7］，伊紅復染時，要根據(jù)使用次數(shù)調節(jié)復染的時間［8］等，但并沒有專門針對胚胎組織石蠟切片制作方法探討的相關文章。本文選取脾臟為代表器官，目的是通過摸索制作雞胚脾臟石蠟切片中脫水、透明、浸蠟、切片與染色的最佳條件，探討制作優(yōu)質雞胚組織石蠟切片的方法。

1 材料與方法

1.1 樣本獲取 選用AA肉雞受精卵16枚進行孵化，孵化期采用人工智能控溫控濕，溫度保持為37℃，濕度為50%～60%。分別在15胚齡（E15）和21胚齡（E21）摘取完整的雞胚脾臟（n＝8）。取材后用4%多聚甲醛固定。

1.2 石蠟切片制作試驗 雞胚脾臟組織較?。s0.02g，最大直徑約2mm），無需修塊，整體脫水包埋。根據(jù)雞胚胚齡的不同，分別設立四種脫水及透明方法，把脫水及透明分為進入乙醇濃度95%前和進入乙醇濃度95%后兩個階段，每個階段分為快組（F）和慢組（S），每個胚齡共分為前快后快（F/F）、前慢后快（S/F）、前快后慢（F/S）和前慢后慢（S/S）四組。脫水、透明及浸蠟時間按照時間設置操作如表1所示。石蠟切片機切片，厚度為3～4μm，展片機水浴展片并烤干，常規(guī)H.E.染色。

表1 雞胚脾臟脫水、透明、浸蠟流程

1.3 H.E.染色試驗 根據(jù)最佳脫水及透明時間制作石蠟切片；脫蠟至水；室溫20℃以上，用蘇木精分別浸染20min、45min、3.5h；分色及藍化，其中染色3.5h的一組用兩次分色法，即短暫分色一次后自來水藍化10min，然后二次分色至細胞質無色；常規(guī)脫水，伊紅浸染，封片。

2 結果與分析

2.1 石蠟切片制作試驗結果 15胚齡的雞胚脾臟，前階段低濃度乙醇脫水時間對切片質量影響不大。后期高濃度乙醇脫水及二甲苯透明的時間較短為好（見中插彩版圖1B），時間較長組織因過度脫水，組織收縮嚴重，體積明顯縮小，因過度失水導致組織變脆、切片有龜裂現(xiàn)象且著色較淺（見中插彩版圖1CD）。21胚齡的雞胚脾臟，前階段低濃度乙醇脫水時間較長為好，時間過短則導致組織脫水不徹底，因影響了后期的透明和浸蠟，鏡下細胞結構受損，透明時因二甲苯吸水作用較大，組織皺縮并出現(xiàn)龜裂現(xiàn)象（見中插彩版圖1EG）。后期高濃度脫水及二甲苯透明時間較長為好（見中插彩版圖1F），時間較短則透明不夠，石蠟浸潤不均勻，著色效果不好（見中插彩版圖1H）。

2.2 H.E.染色試驗結果 因胚胎細胞著色效果差，蘇木精浸染20min、45min、均難以達到理想效果，經蘇木精浸染3.5h并使用兩次分色后，效果較為明顯（見中插彩版圖2）。

3 討論

胚胎組織與生長期組織有一定區(qū)別，胚胎細胞多處于有絲分裂期，細胞核大且H.E.染色時蘇木精著色效果較差。有研究表明，可將切片脫蠟至水后進行加熱處理，可以改善著色效果［9］。但加熱有可能改變組織抗原，進而影響免疫組化的效果。有研究表明，延長染色時間或加溫染蘇木素，再經2次或2次以上分色可提升染色效果［10］。本試驗發(fā)現(xiàn)，蘇木精浸染20min、45min，均難以達到理想效果，經蘇木精浸染3.5h并使用兩次分色后，效果較為明顯。胚胎組織含水量大，組織塊柔軟細嫩，脫水時間不宜過長，常規(guī)脫水方法會導致組織變硬［11］，過分脫水會導致組織萎縮、變脆、龜裂［12］。本試驗從30%酒精開始脫水，并適當縮短了脫水及透明的時間，并與常規(guī)脫水、透明的方法作比較，發(fā)現(xiàn)在雞胚15胚齡高濃度乙醇脫水及二甲苯透明的時間較短為好，時間較長組織因過度脫水，組織收縮嚴重，體積明顯縮小，組織因過度失水而變脆、切片有龜裂現(xiàn)象且著色較淺；雞胚21胚齡時低濃度乙醇脫水時間較長為好，時間過短則導致組織脫水不徹底，因影響了后期的透明和浸蠟，鏡下細胞結構受損，透明時因二甲苯吸水作用較大，組織皺縮并出現(xiàn)龜裂現(xiàn)象。后期高濃度乙醇脫水及二甲苯透明時間較長為好，時間較短則透明不夠，石蠟浸潤不均勻，著色效果不好。

［1］ 閆國和，古德全，林遠，等.制作鼠組織優(yōu)質石蠟切片方法的探討［J］.第三軍醫(yī)大學學報，2002，24（7）：876－877.

［2］ 陳勤，周君，胡冠宇.石蠟切片免疫組化過程中存在的問題及解決方法［J］.安徽大學學報（自然科學版），2009，33（2）：85－88.

［3］ 楊捷頻.常規(guī)石蠟切片方法的改良［J］.生物學雜志，2006，23（1）：45－46.

［4］ 任成林，張富梅，王鵬.幾種蘇木精－－伊紅染色液的改進和使用［J］.河北北方學院學報（自然科學版），2006，22（1）：62－63.

［5］ 陳華絮，楊素嬌.兔卵巢組織石蠟切片技術的改良［J］.生物學雜志，2007，24（5）：59－60.

［6］ 侯春春，徐水.淺析影響石蠟切片質量的關鍵因素［J］.中國農學通報，2009，25（23）：94－98.

［7］ 榮瑋，劉海燕.關于石蠟切片在染色中脫蠟的探討［J］.解剖學雜志，2006，29（1）：92－93.

［8］ 馬恒輝，周曉軍.H.E.染色常見問題與對策［J］.臨床與實驗病理學雜志，2008，24（4）：4－8.

［9］ 田玉旺，李琳，朱紅艷，等.熱處理法在常規(guī) H.E.染色發(fā)灰組織切片中的應用［J］.臨床與實驗病理學雜志，2009，25（2）：221－222.

［10］陳宣世，劉俊才，陳勇，等.H.E.染色兩次分化法在病理制片技術中的應用與探索［J］.重慶醫(yī)學，2010，39（22）：3109－3110.

［11］李紅芬，鄭肇巽，馬品耀，等.H.E.染色原理和試劑配制及染色過程中的若干問題的探討［J］.醫(yī)學信息（上旬刊），2011，24（4）：1985－1986.

［12］朱莉艷.石蠟切片龜裂的原因分析［J］.浙江中西醫(yī)結合雜志，2008，18（10）：634－635.