矢車菊素在體外緩解脂肪變性的L02肝細(xì)胞的氧化損傷

屠 迪，易金娥，鄔 靜，文利新，2，薛立群

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410128；2.長(zhǎng)沙綠葉生物科技有限公司，湖南 長(zhǎng)沙410128）

隨著集約化飼養(yǎng)的發(fā)展，高能量日糧與極低運(yùn)動(dòng)量所誘發(fā)的氧化應(yīng)激對(duì)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的影響越來(lái)越嚴(yán)重，如何減少或緩解畜禽體內(nèi)的氧化應(yīng)激已經(jīng)成為現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)的重大課題。大部分具有抗氧化清除自由基的植物提取物均有緩解機(jī)體氧化損傷促進(jìn)機(jī)體健康的能力。矢車菊素（Cyanidin，CY）是花青素（Anthocyanidin）的一種，廣泛存在于植物中，屬黃酮類（flavonoids）化合物。CY是純天然的抗氧化劑，目前對(duì)CY的研究主要集中與抗腫瘤、調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)等方面，此前的研究表明CY可以有效調(diào)節(jié)高能量日糧造成的脂代謝障礙，而其對(duì)脂代謝障礙時(shí)肝細(xì)胞氧化損傷的影響未見(jiàn)報(bào)道。CY對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞具有保護(hù)作用，該保護(hù)作用可能與其抗氧化能力有關(guān)。在體外CY通過(guò)下調(diào)TNF－α水平并減少活性氧（ROS）從而降低細(xì)胞的凋亡率［1］，抵抗TNF－α及雙氧水所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［2］，并有效抵抗紫外線誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞凋亡［3］。作者前期的研究發(fā)現(xiàn)，在體外CY有效降低脂代謝障礙肝細(xì)胞凋亡率，上述作用可能與CY的抗氧化應(yīng)激作用有密切關(guān)系。因此，本試驗(yàn)采用人肝L02肝細(xì)胞制作脂代謝障礙模型并研究CY對(duì)此模型抗氧化能力的影響，為CY在脂代謝障礙過(guò)程中抗氧化應(yīng)激研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)用CY、軟脂酸（PA）和DMSO，購(gòu)自Sigma公司；RPMI1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清（FBS）由杭州四季青公司生產(chǎn)，試驗(yàn)用L02人肝細(xì)胞系，購(gòu)自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 首先參考熊清芳所述方法適當(dāng)調(diào)整后制作脂代謝障礙模型［4］，具體方法為：在含有5%CO2飽和濕度條件下，以RPMI1640為培養(yǎng)基，培養(yǎng)體內(nèi)含有 30mg/mL PA、0.5%DMSO 和10%FBS的條件下培養(yǎng)24h使L02細(xì)胞發(fā)生明顯的脂肪變性。將L02細(xì)胞分為4組，1組為模型對(duì)照組，2、3、4組試驗(yàn)組。模型建立后更換造模培養(yǎng)基1次，各組培養(yǎng)體系內(nèi)分別添加終濃度為0、0.01、0.1、1mg/mL的矢車菊素繼續(xù)培養(yǎng)12h。

1.3 樣品處理 試驗(yàn)結(jié)束后，用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，連同培養(yǎng)基一起收集后3 000r/min離心10min，收集沉淀細(xì)胞；采用RIPA強(qiáng)裂解液4℃裂解30min，每10min顛倒一次裂解液；4℃條件下12 000r/min離心5min，取上清液4℃待測(cè)。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法 測(cè)定各組細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH－Px）活性，丙二醛（MDA）含量以及總抗氧化能力（TAOC）。其中SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定；GSH－Px活性采用二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）法測(cè)定；MDA含量采用硫代巴比妥酸顯色法測(cè)定；TAOC采用FRAP（化學(xué)比色法）測(cè)定。采用考馬斯亮藍(lán)（BCA）法測(cè)定樣品中總蛋白含量?？偟鞍?、MDA、SOD、GSH－Px與 T－AOC測(cè)定試劑盒，均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.5 數(shù)據(jù)分析和處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用t檢驗(yàn)分析組間差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 CY對(duì)模型細(xì)胞SOD活性的影響 由圖1可知，各試驗(yàn)組細(xì)胞中SOD活性較對(duì)照組均有所升高，并隨著CY劑量的增加而增強(qiáng)，呈明顯的量效遞增關(guān)系。與對(duì)照組相比，第3組細(xì)胞內(nèi)SOD活性升高顯著（P＜0.05）而第4組L02細(xì)胞內(nèi)SOD活性升高極顯著（P＜0.01）。

2.2 CY對(duì)模型細(xì)胞GSH－Px活性的影響 由圖2可知，在CY的作用下，各試驗(yàn)組L02肝細(xì)胞內(nèi)GSH－Px活性均有所提高，但2、3組細(xì)胞內(nèi)GSH－Px活性升高與對(duì)照組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異，4組細(xì)胞內(nèi)GSH－Px的活性升高相對(duì)顯著（P＜0.05）。

2.3 CY對(duì)模型細(xì)胞內(nèi) MDA含量的影響 由圖3可知，各試驗(yàn)組中MDA含量較對(duì)照組均有降低，并隨著CY計(jì)量的增加呈現(xiàn)量效遞減關(guān)系。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組2細(xì)胞內(nèi)的MDA含量降低顯著（P＜0.05），3、4試驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi) MDA含量降低極顯著（P＜0.01）。

2.4 CY對(duì)T－AOC的影響 由圖4可知，各試驗(yàn)組L02肝細(xì)胞內(nèi)T－AOC較對(duì)照組均有升高，并隨著CY劑量的增加呈現(xiàn)明顯的量效遞增關(guān)系。與對(duì)照組相比，3組L02肝細(xì)胞內(nèi)T－AOC水平升高顯著（P＜0.05），4組L02肝細(xì)胞內(nèi) T－AOC水平升高極顯著（P＜0.01）。

3 討論

SOD和GSH－Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的、重要的催化過(guò)氧化氫分解的酶。SOD可調(diào)節(jié)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡，其活性高低反映了機(jī)體清除氧自由基能力的強(qiáng)弱，在機(jī)體抗氧化損傷、抗衰老與免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮重要作用［5］。GSH－Px是H2O2防御系統(tǒng)成員，可以清除活細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物，在保護(hù)細(xì)胞免受自由基損傷的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，CY可以顯著提高模型細(xì)胞內(nèi)SOD和GSHPx水平，因此我們推斷CY可以通過(guò)清除脂肪變性細(xì)胞內(nèi)蓄積的過(guò)氧化氫，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化性。

MDA是不飽和脂肪酸過(guò)氧化產(chǎn)物之一。MDA含量可間接反映機(jī)體內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化水平，并作為氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物，并且和多種疾病的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，是疾病早期嚴(yán)重程度的一個(gè)重要的標(biāo)志物［6－7］。特別是在脂肪變性的肝細(xì)胞內(nèi)，其水平保底直接反應(yīng)細(xì)胞的過(guò)氧化水平［8］。生物膜中的不飽和脂肪酸易被自由基攻擊而發(fā)生過(guò)氧化，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，這些變化勢(shì)必影響細(xì)胞基本生命活動(dòng)導(dǎo)致肝細(xì)胞功能障礙［9］。本試驗(yàn)中，CY可降低脂肪變性肝細(xì)胞內(nèi)MDA含量，這表明CY可以通過(guò)降低脂質(zhì)過(guò)氧化程度，增強(qiáng)脂肪變性肝細(xì)胞的抗氧化能力。

T－AOC代表細(xì)胞抗氧化能力的總和，是反應(yīng)細(xì)胞抗氧化能力的重要指標(biāo)［10］。其強(qiáng)弱與細(xì)胞所處狀態(tài)有密切聯(lián)系，當(dāng)T－AOC降低時(shí)，會(huì)引起脂肪變性肝細(xì)胞的炎癥反應(yīng)［11］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CY能夠顯著提高脂肪變性L02細(xì)胞內(nèi)T－AOC水平，隨著CY計(jì)量的增加T－AOC水平逐漸升高，呈現(xiàn)顯著的量效遞增關(guān)系。此結(jié)果說(shuō)明L02肝細(xì)胞內(nèi)的各類抗氧化物質(zhì)合成均得到增強(qiáng)，進(jìn)而增強(qiáng)L02肝細(xì)胞的抗氧化能力。

4 結(jié)論

CY可以提高脂肪變性的L02肝細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH－Px活性和T－AOC水平，并降低細(xì)胞內(nèi)MDA的含量進(jìn)而增強(qiáng)L02肝細(xì)胞的抗氧化能力，降低脂肪變性所引起的氧化損傷。

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