粉防己堿對EC9706細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及sPLA2-Ⅱa蛋白表達(dá)的影響

段 昱，呂 品，賀付成，趙 雪

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科 鄭州 450052

磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)是一類參與脂類代謝和調(diào)節(jié)的酶類。哺乳動物體內(nèi)的sPLA2包括十余種亞型，分泌型PLA2-Ⅱa(secretory PLA2-Ⅱa, sPLA2-Ⅱa)是PLA2超家族成員之一[1]。前期研究[2]已表明sPLA2-Ⅱa蛋白及mRNA在食管鱗癌組織中表達(dá)升高，可能參與了食管癌的發(fā)生。粉防己堿(tetrandrine，Tet)是從中草藥粉防己的根塊中提取的一種生物堿，又名漢防己甲素。研究[3-4]發(fā)現(xiàn)Tet可抑制包括PLA2在內(nèi)的多種酶類的活性，并且具有一定的抗癌作用。作者采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、流式細(xì)胞術(shù)及免疫細(xì)胞化學(xué)SP法檢測Tet對食管鱗狀細(xì)胞癌EC9706細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及sPLA2-Ⅱa蛋白表達(dá)的影響，探討Tet抑制食管癌細(xì)胞增殖的相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料EC9706細(xì)胞系由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室惠贈。Tet、二甲基亞砜(DMSO)及MTT均購自Sigma公司。RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液購自美國Gibco公司。胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品。兔抗人sPLA2-Ⅱa多克隆抗體購自香港ABCAM公司。免疫細(xì)胞化學(xué)SP試劑盒購自美國ZYMED公司。Tet用DMSO助溶，然后配成100 μmol/L儲存液，存于4 ℃冰箱，使用時用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋至15 μmol/L。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)EC9706細(xì)胞單層貼壁培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液一次，胰蛋白酶常規(guī)消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3細(xì)胞增殖抑制率的MTT法檢測取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為6×104mL-1，按每孔0.2 mL接種于96孔培養(yǎng)板中，共接種60孔。培養(yǎng)24 h后，分4組處理。實驗組分別用Tet作用細(xì)胞1、3和5 d，對照組不作任何處理，每組設(shè)15個復(fù)孔。加入MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h后，每孔加100 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，于酶標(biāo)儀上測定波長492 nm處各孔的吸光度值，計算細(xì)胞增殖抑制率。

1.4細(xì)胞周期檢測細(xì)胞同1.3中分組處理，每組設(shè)7個復(fù)孔，收集細(xì)胞，胰蛋白酶消化，離心、棄上清，用PBS洗2遍，加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，4 ℃保存。細(xì)胞染色前用PBS洗2遍，細(xì)胞沉淀重懸于500 μL PBS中(包含PI 50 mg/L，RNaseA 100 mg/L)，避光染色30 min，細(xì)胞經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過濾，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期分布。

1.5sPLA2-Ⅱa蛋白表達(dá)的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測取對數(shù)生長期的EC9706細(xì)胞于24孔培養(yǎng)板中，用15 μmol/L的Tet于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1、3和5 d后取出細(xì)胞爬片(Tet作用1、3和5 d組)，以不作處理的EC9706細(xì)胞為對照組，pH 7.4 PBS沖洗，體積分?jǐn)?shù)80%的丙酮固定30 min后，4 ℃冰箱保存，用于免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。一抗兔抗人sPLA2-Ⅱa多克隆抗體按1150稀釋，PBS代替一抗作為陰性對照。所有爬片經(jīng)高壓抗原修復(fù)，其余步驟按免疫細(xì)胞化學(xué)SP試劑盒說明書操作，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，以高清圖像處理系統(tǒng)測定著色細(xì)胞的灰度值，評定sPLA2-Ⅱa蛋白表達(dá)的強弱。每組均設(shè)5個平行對照。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行分析，應(yīng)用單因素方差分析和SNK-q檢驗比較各組細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞周期及sPLA2-Ⅱa蛋白表達(dá)的差異，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1Tet對EC9706細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響見表1。MTT檢測結(jié)果顯示，經(jīng)Tet作用1、3和5 d后細(xì)胞增殖抑制率依次增高。細(xì)胞周期檢測顯示，Tet作用組G0/G1期細(xì)胞比例高于對照組，而S、G2/M期細(xì)胞比例低于對照組(P<0.05)。

表1 Tet對EC9706細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和sPLA2-Ⅱa蛋白表達(dá)的影響

除G2/M期Tet作用3 d組與5 d組差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，其余各組兩兩比較P均<0.05。

2.2Tet對EC9706細(xì)胞sPLA2-Ⅱa蛋白表達(dá)的影響見圖1、表1。sPLA2-Ⅱa蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性著色呈棕黃色，位于胞質(zhì)。與對照組比較，Tet作用不同時間后細(xì)胞著色無明顯改變，各組sPLA2-Ⅱa蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 各組細(xì)胞中sPLA2-Ⅱa蛋白的表達(dá)(SP,×200)

3 討論

Tet是千金藤屬防己科植物粉防己的主要活性成分，其化學(xué)結(jié)構(gòu)屬雙芐基異喹啉類。作為一種鈣離子拮抗劑，其消炎鎮(zhèn)痛作用已為人們所熟知。近年來，眾多研究[5-8]表明其在抑制腫瘤細(xì)胞增殖和放、化療增敏上也發(fā)揮重要作用。

PLA2在自然界中分布較廣泛，可催化水解甘油磷脂的?；ユI。根據(jù)PLA2在組織內(nèi)的分布、氨基酸序列同源性及生化功能等特征可將其分為分泌型、胞質(zhì)型和非鈣離子依賴型[9]。sPLA2-Ⅱa是PLA2家族成員之一，研究[4，10-12]表明其在食管癌、肺癌、乳癌、前列腺癌等癌組織中均呈高表達(dá)，sPLA2-Ⅱa基因還可促進(jìn)大腸癌細(xì)胞系的增殖，并參與腫瘤的發(fā)生和免疫。Dong等[13]研究發(fā)現(xiàn)sPLA2-Ⅱa的作用可能與HER/HER2-PI3K-Akt-NF-κB信號通路的激活有關(guān)，高表達(dá)的sPLA2-Ⅱa促進(jìn)了癌細(xì)胞的生長。

作者采用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)SP法檢測了Tet作用于EC9706細(xì)胞后，細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及sPLA2-Ⅱa蛋白表達(dá)的變化，結(jié)果表明Tet能夠顯著抑制EC9706細(xì)胞的增殖。Tet作用于食管癌細(xì)胞后，細(xì)胞周期發(fā)生了G1→S期阻滯，但sPLA2-Ⅱa蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

Tet與一般的細(xì)胞毒性化療藥物相比，毒副作用小，對肝腎功能無損害且無骨髓抑制，是一種有效且較安全的抗癌藥物。雖然Tet對EC9706細(xì)胞中sPLA2-Ⅱa蛋白的表達(dá)無影響，但作為酶抑制劑，Tet是否通過對sPLA2-Ⅱa酶活性的抑制來阻礙食管癌細(xì)胞的增殖以及Tet是否還存在其他抗癌機(jī)制值得深入研究。

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