厄洛替尼對(duì)人胰腺癌細(xì)胞凋亡及survivin蛋白表達(dá)的影響

王 原 陳 紅 房 芳 楊照環(huán) 王海波 劉華群

(河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院消化科，河北 唐山 063000)

胰腺癌早期癥狀隱匿，超過70%的胰腺癌患者確診時(shí)已是中晚期，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后惡劣〔1〕。有報(bào)道胰腺癌組織中表皮生長因子受體(EGFR)的陽性率接近50%，參與了胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。厄洛替尼為人表皮生長因子受體(HER1/EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(TKI)，廣泛應(yīng)用于治療胰腺癌的基礎(chǔ)和臨床研究。本研究從細(xì)胞水平進(jìn)一步觀察厄洛替尼對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖抑制、促進(jìn)凋亡的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。噻唑藍(lán)(MTT)購于美國Sigma-aldrich公司。RAD001用二甲基亞砜(DMSO)配制成1 mmol/L貯備液，實(shí)驗(yàn)時(shí)用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度。Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒KGA107購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，山羊抗兔SP免疫組化染色試劑盒SP-9001購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，兔抗人survivin sc-10811多克隆抗體購于美國Santa Cruz公司。

1.2 MTT比色法檢測細(xì)胞增殖變化 調(diào)節(jié)PANC-1細(xì)胞濃度，以3×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 ml，37℃孵育4 h，輕輕吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 ml DMSO，振蕩10 min選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光密度(OD)值，計(jì)算各組細(xì)胞抑制率=〔(空白對(duì)照組OD值－各實(shí)驗(yàn)組OD值)/空白對(duì)照組OD值〕×100%。

1.3 胰腺癌PANC-1細(xì)胞凋亡的檢測 收集厄洛替尼作用24、48、72 h及空白對(duì)照組的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107個(gè)/ml，取 25 μl的細(xì)胞懸液與 1 μl的 AO/EB 染液混勻。吸取上述10 μl的混合液置于一潔凈的載玻片上，蓋玻片封片后置于熒光顯微鏡下觀察。

1.4 survivin蛋白的表達(dá)情況 Western印跡檢測胰腺癌PANC-1細(xì)胞中survivin蛋白的表達(dá)情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果數(shù)據(jù)用s表示，組間比較用兩樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 厄洛替尼對(duì)胰腺癌PANC-1細(xì)胞生長的抑制情況 MTT比色法結(jié)果顯示:厄洛替尼能明顯抑制胰腺癌PANC-1細(xì)胞的生長，隨用藥時(shí)間的延長和用藥濃度的提高，抑制率明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。見圖1。

圖1 不同濃度、不同時(shí)間厄洛替尼對(duì)胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖的影響

2.2 厄洛替尼對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 12.5 μmol/L厄洛替尼作用24、48、72 h的PANC-1細(xì)胞凋亡率(%)分別為9.51±1.38，14.50±1.65，16.6±1.89。作用48 h后早期凋亡細(xì)胞開始減少，而晚期凋亡和壞死細(xì)胞上升，表明厄洛替尼通過早期誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡繼而導(dǎo)致細(xì)胞壞死。

2.3 Western印跡檢測結(jié)果 與對(duì)照組比較，厄洛替尼作用48 h后胰腺癌PANC-1細(xì)胞中survivin蛋白表達(dá)不同程度下降(P＜0.05)。

3 討論

腫瘤發(fā)生、發(fā)展和藥物抵抗的發(fā)生機(jī)制與腫瘤細(xì)胞的凋亡相關(guān)〔2〕。因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是治療腫瘤最常見的形式。厄洛替尼是一種小分子的TKI，主要通過與三磷酸腺苷競爭結(jié)合至EGFR胞內(nèi)酪氨酸激酶功能域，抑制受體自磷酸化而阻止下游信號(hào)傳導(dǎo)，從而抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，加速細(xì)胞凋亡，抑制血管生成，進(jìn)而產(chǎn)生抗腫瘤作用〔3〕。

survivin高表達(dá)于絕大多數(shù)惡性腫瘤組織中，而在正常組織中不表達(dá)。研究表明，survivin的陽性高表達(dá)能抑制胃癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖〔4〕。Vaira等〔5〕將 mTOR下游底物p70S6K-cDNA轉(zhuǎn)染入前列腺癌DU145細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)了明顯的survivin表達(dá)上調(diào);而用小干擾RNA(siRNA)沉默內(nèi)生p70S6K表達(dá)之后，出現(xiàn)survivin表達(dá)水平下降，說明survivin基因參與腫瘤的發(fā)生機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用厄洛替尼處理后的胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖明顯受到抑制，同時(shí)其survivin蛋白的表達(dá)也明顯降低。分析其機(jī)制，由于survivin表達(dá)具有細(xì)胞周期依賴性，只在細(xì)胞周期的G2/M期表達(dá)，應(yīng)用厄洛替尼后可使癌細(xì)胞阻滯于G1期，從而降低了survivin的表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡?？梢赃M(jìn)一步推測，厄洛替尼通過下調(diào)survivin的表達(dá)，進(jìn)而干擾胰腺癌的凋亡。同時(shí)，應(yīng)用厄洛替尼競爭性結(jié)合EGFR，使EGFR對(duì)VEGF的調(diào)控能力降低，從而降低了VEGF導(dǎo)致的survivin的高表達(dá)。

厄洛替尼通過下調(diào)survivin蛋白的表達(dá)來誘導(dǎo)人胰腺癌細(xì)胞PANC-1凋亡。本研究不僅可以闡明厄洛替尼對(duì)胰腺癌凋亡的調(diào)控，同時(shí)從細(xì)胞水平為其抗腫瘤浸潤提供了新的治療思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 Hanahan D，Weinberg RA.Hallmarks of cancer:the next generation〔J〕.Cell，2011;144(5):646-74.

2 崔 斐，陳 斌，陳錦章，等.凋亡抑制蛋白 Survivin和血管內(nèi)皮生長因子在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義〔J〕.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008;28(5):761-3.

3 劉顯紅，馬麗霞，張 爽，等.厄洛替尼治療吉非替尼失敗后晚期非小細(xì)胞肺癌的療效〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2011;31(24):4790-1.

4 李鳳朝，孔慶兗，楊雪梅.Survivin表達(dá)與胃癌細(xì)胞凋亡、增殖及腫瘤血管形成的關(guān)系〔J〕.實(shí)用癌癥雜志，2004;19(6)592-4.

5 Vaira V，Lee CW，Goel HL，et al.Regulation of survivin expression by IGF-1/mTOR signaling〔J〕.Oncogene，2007;26(19):2678-84.