辛伐他汀對膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞核因子－κB、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達(dá)的影響及意義

張立濤 李素彥 許 寧 趙鶴齡(河北省人民醫(yī)院急診科，河北 石家莊 05005)

膿毒癥早期就已存在心肌器質(zhì)性損傷，且發(fā)生率很高，其機(jī)制復(fù)雜，其中一氧化氮(NO)在膿毒癥心肌損傷過程中發(fā)揮了重要作用。核因子(NF)-κB是一種廣泛存在于體內(nèi)細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB信號通路的過度活化與人類疾病的發(fā)生關(guān)系密切。膿毒癥時NF-κB活性的增高調(diào)控iNOS的在心肌細(xì)胞中表達(dá)增加，可能是心肌損傷發(fā)生的機(jī)制之一。他汀類藥物即3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑是一種廣泛應(yīng)用的降脂藥物，并可以減少患冠心病的風(fēng)險。除此之外，他汀類藥物尚有與降低血脂無關(guān)的多種生物作用，這種多效性包括:抗炎作用、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗凝血、穩(wěn)定血管內(nèi)皮等，膿毒癥患者的功能異常往往就表現(xiàn)在以上幾個方面，因此理論上他汀類藥物可以改善膿毒癥患者的預(yù)后。本實驗，觀察膿毒癥模型大鼠心肌細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)與NF-κB的表達(dá)，并評價辛伐他汀對二者表達(dá)的影響及意義，進(jìn)一步探討辛伐他汀的心臟保護(hù)性作用。

1 材料與方法

1.1 動物模型制備 30只雌性Wistar大鼠，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，體重250～270 g。采用盲腸結(jié)扎穿孔法(CLP)〔1〕建立膿毒癥模型。麻醉前禁食8 h，以10%水合氯醛(350 mg/kg)，腹腔注射麻醉后，將大鼠固定在實驗臺上。常規(guī)消毒腹部皮膚，于腹部皮膚正中做切口，長約2 cm，打開腹腔后小心分離盲腸，避免損傷腸系膜血管。盲腸如有糞便，則輕輕將其擠向與其相連的大腸，在盲腸與小腸及大腸交界處，用4-0號絲線環(huán)形結(jié)扎盲腸，避免結(jié)扎回腸和盲腸系膜血管。結(jié)扎完畢后仔細(xì)檢查，保持腸道通路暢通。在與腸系膜相對的盲端腸壁漿膜面用18號針頭穿刺三次，擠出適量腸內(nèi)容物，并留置一寬約0.2 cm，長約3 cm橡皮引流條貫通盲腸，以防針孔閉合，輕輕將腸管放回原處，逐層縫合，關(guān)閉腹腔。

1.2 動物分組及處理 雌性Wistar大鼠30只，正常喂養(yǎng)，經(jīng)1 w適應(yīng)期后利用隨機(jī)數(shù)字表分為正常組(N組)10只，造模組(CLP組)10只，辛伐他汀組(S組)10只。S組開始喂養(yǎng)辛伐他汀20 mg/kg(舒降之，默沙東，批號:國藥準(zhǔn)字H19990366)，用生理鹽水配成等濃度藥液灌胃(5 mg/ml)，每天1次，持續(xù)2 w。正常組和造模組用生理鹽水灌胃(4 ml/kg)，每天1次，持續(xù)2 w。2 w后造模組及辛伐他汀組行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)，各組于術(shù)后48 h分別取大鼠左心室心肌組織，置入10%中性甲醛溶液固定，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋。

1.3 試驗方法 iNOS一抗為兔抗大鼠IgG多克隆抗體，抗體稀釋比例為1∶200。NF-κB p65一抗為小鼠抗大鼠IgG單克隆抗體，抗體稀釋比例為1∶80。DAB顯色，以PBS代替一抗作陰性對照。

1.3.1 標(biāo)本HE染色 石蠟切片二甲苯脫蠟至水→蘇木素染色5 min，流水沖洗數(shù)次→1%鹽酸酒精分化20 s，1/400氨水返藍(lán)，間以流水沖洗1 min→伊紅染色5 min，流水沖洗30 s→梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片→光鏡下讀片。

1.3.2 S-P三步法免疫組織化學(xué)法染色 石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育15 min→蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min→盛有枸櫞酸鹽酸緩沖液的高壓鍋中進(jìn)行高壓抗原熱修復(fù)10 min→3%H2O2室溫孵育 5～10 min，PBS沖洗，2 min×3次→5% ～10%山羊血清封閉，室溫孵育10 min，傾去血清，滴加一抗，37℃ 孵育2 h→PBS沖洗，2 min×3次→滴加1%BSAPBS稀釋的生物素標(biāo)記二抗，37℃ 孵育10～30 min→PBS沖洗，2 min×3次→滴加PBS稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵蛋白素，37℃ 孵育15 min→PBS沖洗，2 min×3次→DAB顯色，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水透明、封片。

1.3.3 染色結(jié)果的判定 iNOS陽性染色為在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒沉著。NF-κB p65陽性染色為在細(xì)胞質(zhì)(部分在細(xì)胞核)內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒沉著。陽性細(xì)胞必須具備:①細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰;②陽性顆粒定位、定性好;③著色明顯高于背景。評分標(biāo)準(zhǔn):參照Soslow〔2〕的評分方法，應(yīng)用美國多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)分析:每張切片隨機(jī)取5個(×200)高倍視野，采用陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比雙重判定進(jìn)行評分，并將二者評分乘積作為最終評分進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SAS8.0統(tǒng)計軟件分析。等級資料采用多個樣本比較的Kruskal-Wallis H檢驗及兩獨立樣本比較的Wilcoxon秩和檢驗。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的一般情況 CLP組大鼠術(shù)后表現(xiàn)出無活力，反應(yīng)差，發(fā)紺，立毛和呼吸急促的特點。打開腹腔后可見血性腹水，可聞及惡臭味，并發(fā)現(xiàn)部分大鼠腸管水腫，盲腸發(fā)黑，可見膿苔。相比之下，S組大鼠表現(xiàn)相對較輕。

2.2 HE染色結(jié)果 N組大鼠心肌纖維結(jié)構(gòu)正常。CLP組大鼠心肌纖維水腫，疏松，間質(zhì)充血水腫，部分可見淀粉樣變性。心內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞部分腫脹，局部脫落，缺損。而S組心肌的組織病理學(xué)改變相比CLP組較輕，見圖1。

2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

2.3.1 iNOS的表達(dá) N組大鼠心肌細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)微量。CLP組大鼠心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見較多棕黃色或棕色顆粒沉著，與N組相比明顯增加(P＜0.05)。S組大鼠心肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒與CLP組相比明顯減少并有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，與N組相比無明顯差異(P＞0.05)。見圖2，表1。

2.3.2 NF-κB的表達(dá) N組大鼠心肌細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)微量。CLP組大鼠心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見棕黃色或黃色顆粒沉著，部分細(xì)胞核黃染，與N組相比明顯增加(P＜0.05)。S組大鼠心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)棕黃色顆粒與CLP組相比明顯減少并有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，與 N組相比無明顯差異(P＞0.05)。見圖3，表2。

表1 各組大鼠心肌組織iNOS(n，n=10)

表2 各組大鼠心肌組織NF-κB表達(dá)(n，n=10)

圖1 各組大鼠心肌組織病理學(xué)點(HE，×200)

圖2 各組心肌組織iNOS表達(dá)(DAB，×200)

圖3 各組大鼠心肌組織NF-κB表達(dá)(DAB，×200)

3 討論

3.1 膿毒癥模型的建立 建立標(biāo)準(zhǔn)化的膿毒癥動物模型是探索膿毒癥病理生理學(xué)機(jī)制和防治措施的重要環(huán)節(jié)，在膿毒癥研究領(lǐng)域具有舉足輕重的作用。膿毒癥動物模型目前常用的有內(nèi)毒素誘導(dǎo)、細(xì)菌注射、腹膜炎模型即盲腸結(jié)扎穿孔模型等方法。用CLP方法造模，炎癥部位是否被大網(wǎng)膜包裹關(guān)系到膿毒癥動物模型的成功與否，并與實驗者手術(shù)方法(如穿孔大小、盲腸結(jié)扎程度)和動物的種系、年齡、性別有關(guān)，人為控制存在一定困難，但是該模型操作起來相對簡便，通過外科手術(shù)而引起腹腔感染，與臨床上化膿性闌尾炎穿孔形成的腹膜炎相似。本實驗采用CLP法復(fù)制大鼠膿毒癥模型，使有菌的腸內(nèi)容物污染腹腔造成彌漫性腹膜炎，誘發(fā)廣泛的全身性炎性反應(yīng)。根據(jù)術(shù)后大鼠的表現(xiàn)及處死后解剖所見，符合膿毒癥動物模型的基本要求〔3〕，因此，利用此模型進(jìn)行研究更具說服力，更貼近臨床。

3.2 膿毒癥時心功能異常的特征與機(jī)制 Waisbren等〔4〕最早在臨床發(fā)現(xiàn)由于膿毒癥所導(dǎo)致的心臟功能異常的現(xiàn)象，雖然膿毒癥患者心輸出量大致正常，但是每搏量和射血分?jǐn)?shù)明顯降低〔5〕，一旦膿毒癥患者出現(xiàn)心臟功能異常，其死亡率會明顯增加。Natanson等〔6〕對犬膿毒癥模型的研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥時其心臟的收縮與舒張功能都受到明顯抑制。目前，大量臨床〔7，8〕與基礎(chǔ)〔9〕研究證明，心肌收縮力的降低與順應(yīng)性的下降是膿毒癥時心臟功能異常的主要原因。雖然右心室與左心室在結(jié)構(gòu)及功能上有一定的差異，但在膿毒癥過程中其功能障礙與左心室表現(xiàn)基本相似〔10〕。雖然關(guān)于膿毒癥時心臟功能異常機(jī)制的研究取得巨大進(jìn)展，但其確切機(jī)制至今仍不明確，這其中涉及多種因素，包括:心肌抑制物、細(xì)胞因子、一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素-1(ET-1)和前列腺素類物質(zhì)的作用等，其中大量研究發(fā)現(xiàn)高水平的NO可以抑制心肌收縮功能。

NO在心血管系統(tǒng)內(nèi)發(fā)揮著復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng)。其可以在不同的生理和病理生理條件下調(diào)整心臟的功能。許多實驗表明高劑量的NO對心肌收縮功能具有抑制作用。Brady等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)給豚鼠腹腔注射內(nèi)毒素，4 h后取出心臟，測定心室肌細(xì)胞的收縮性，發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞收縮力明顯下降。這種作用可被一氧化氮合酶(NOS)抑制劑N-硝基-L精氨酸甲酯(L-NAME)所逆轉(zhuǎn)，提示內(nèi)毒素激活NOS可產(chǎn)生NO，而抑制心肌收縮力。另外作者〔12〕給正常的豚鼠離體心室肌細(xì)胞直接應(yīng)用NO及NO供體硝普鈉，也出現(xiàn)了心肌細(xì)胞收縮功能的減退，直接證明了NO對心肌收縮功能的抑制作用，并認(rèn)為這與NO影響心肌細(xì)胞環(huán)鳥苷酸的產(chǎn)生有關(guān)。Kelm等〔13〕則證實高劑量的NO對心肌收縮力的影響與其抑制心肌細(xì)胞能量產(chǎn)生有關(guān)。

NO是在NOS催化左旋精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樽笮习彼岬倪^程中合成的。NOS有三個亞型，包括神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)。iNOS在體內(nèi)分布較廣，已證實心肌組織中許多成分如心肌細(xì)胞、心臟微血管的內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及心內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞都有分布。Wagner等〔14〕發(fā)現(xiàn) iNOS可以在細(xì)胞因子如 IL-1β、TNFα、IFNγ、IL-6 等的刺激下經(jīng)由細(xì)胞內(nèi)NF-κB系統(tǒng)與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控合成，并產(chǎn)生大量NO。本實驗通過應(yīng)用免疫組化的方法對膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn):造模后48 h，心肌細(xì)胞的NF-κB和iNOS的蛋白表達(dá)明顯增加，因此認(rèn)為與CLP后炎癥因子激活NF-κB系統(tǒng)使iNOS表達(dá)增加有關(guān)，并因此造成模型大鼠心肌細(xì)胞受損。

3.3 他汀類藥物抗膿毒癥作用 他汀類藥物抗膿毒癥作用機(jī)制較為復(fù)雜，同時也是多方面的，包括抗炎、抗凝血、調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫、改善內(nèi)皮細(xì)胞功能、抗氧化應(yīng)激反應(yīng)等效應(yīng)。Merx等〔15〕采用CLP法復(fù)制小鼠膿毒癥模型，結(jié)果表明，經(jīng)過他汀類藥物預(yù)處理的小鼠平均存活率是對照組的4倍。Chaudhry等〔16〕發(fā)現(xiàn)西立伐他汀可以明顯降低由脂多糖所誘導(dǎo)的小鼠促炎因子TNF-α和IL-6的釋放，加快細(xì)菌清除，提高小鼠的生存率。他汀類藥物同時可以改善膿毒癥時腎臟〔17〕和心臟功能〔18〕。

Huang等〔19〕在對LPS和IFN-γ刺激后的小鼠巨噬細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，洛伐他汀、阿托伐他汀、氟伐他汀、普伐他汀可以抑制巨噬細(xì)胞iNOS的表達(dá)，并認(rèn)為這與他汀類藥物可以抑制NF-κB活性和STAT-1磷酸化有關(guān)。Wagner等〔14〕對細(xì)胞因子刺激后的大鼠胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀可以減弱內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB和STAT-1的核轉(zhuǎn)運，使iNOS的表達(dá)減少。Madonna等〔20〕對經(jīng)TNF-α和IL-1刺激后的大鼠心臟胚胎細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀可以提高NF-κB的抑制物IκB水平，并減少其細(xì)胞核內(nèi)NF-κB含量，因此減少iNOS mRNA及iNOS蛋白的表達(dá)。本實驗中經(jīng)辛伐他汀預(yù)處理的大鼠在造模后48 h，心肌細(xì)胞的NF-κB和iNOS的蛋白表達(dá)較造模組明顯減少，考慮與辛伐他汀抑制NF-κB的活性，進(jìn)而降低iNOS在心肌細(xì)胞的表達(dá)有關(guān)，因此理論上20 mg/kg辛伐他汀可以減少膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞NO的產(chǎn)生，起到心肌保護(hù)性作用。

本研究主要通過免疫組化的方法研究辛伐他汀對膿毒癥大鼠的心肌保護(hù)性作用，受研究方法與樣本數(shù)所限，結(jié)果存在一定局限性。同時20 mg/kg的辛伐他汀的劑量只是參考相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行的探索性實驗，因此其他劑量與種類的他汀類藥物的實驗效果有待進(jìn)一步研究。

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