無針噴射控釋雙生長因子藻酸鹽水凝膠對心肌梗死兔左室重塑及心功能的影響

周志益 黃 晶 任建麗 吳 奇 (重慶市第三人民醫(yī)院老年科，重慶 40000)

心肌梗死后引起的左室重塑和心力衰竭往往與心臟細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的廣泛損傷有關(guān)〔1〕。在心肌梗死區(qū)注射生物材料(如纖維蛋白、膠原等)或與細(xì)胞治療聯(lián)合應(yīng)用可能代替損傷的ECM，防止左室重塑和心力衰竭〔2，3〕。海藻酸鹽由于其為天然高分子材料，具有無毒性、可降解性及良好的生物相容性而廣泛應(yīng)用于藥物釋放體系和組織工程領(lǐng)域，其結(jié)構(gòu)與ECM相似〔4，5〕。本實(shí)驗(yàn)探討無針噴射控釋雙生長因子藻酸鹽水凝膠改善心肌梗死左室重塑和心功能的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭大白兔40只，雌雄不限，體質(zhì)量2～3 kg，平均(2.67±0.49)kg，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 儀器與試劑 無針注射器(Injex公司，美國);iE33彩色超聲診斷儀(Philips公司，荷蘭);IX71倒置顯微鏡(Olympus公司，日本);組織切片機(jī)(Leica公司，德國);海藻酸鈉(Sigma公司，美國);VEGF-A165及PDGF-BB(Sigma公司);SABC通用型免疫組化試劑盒(北京中杉金橋公司);兔抗犬CD34單克隆抗體及兔抗犬α-SMA單克隆抗體(Santa Cruz公司，美國)。

1.3 方法

1.3.1 海藻酸鈉的修飾 Sigma公司的海藻酸鈉作為高分子量海藻酸鈉(Mw=2.7×105g/mol)，以5.0 Mrad鈷60輻照4 h制備低分子量海藻酸鈉(Mw=53 100 g/mol)。用電子天平稱取高碘酸鈉2.67 g，加入去離子水50 ml配制成0.25 mol/L的溶液放置于棕色瓶中備用。分別稱取1 g高分子量及低分子量海藻酸鈉加入到100 ml去離子水中，磁力攪拌直至海藻酸鈉溶解完全，得到1%(W/V)的海藻酸鈉溶液。加入預(yù)先配置好的高碘酸鈉溶液1 ml，4℃避光攪拌反應(yīng)24 h后加入0.2 ml乙二醇終止氧化反應(yīng)15 min。然后加入0.3 g氯化鈉，充分溶解后加入200 m1乙醇使其沉淀析出，并減壓抽濾獲得白色產(chǎn)物。將產(chǎn)物用50 ml水充分溶解后裝入透析袋中透析3 d，每天換水3～4次，用電導(dǎo)率儀測定透析液透析完全后將透析液倒入塑料表面皿中，放入低溫冰箱預(yù)凍12 h，并將預(yù)凍物凍干，最終獲得部分氧化海藻酸鈉白色產(chǎn)物。

1.3.2 藻酸鹽水凝膠載體的制備及生長因子的加入 用PBS分別配制2%修飾后的高分子量及低分子量海藻酸鈉溶液，VEGF-A165及PDGF-BB按照說明書要求溶解后，將VEGFA165溶于低分子量海藻酸鈉溶液，PDGF-BB溶于高分子量海藻酸鈉溶液，以1∶1(LMW∶HMW)的體積比將兩種溶液混合。生長因子的最終濃度是每100 μl海藻酸鈉混合液含3 μg VEGF-A165或(和)3 μg PDGF-BB。無菌條件下向該溶液注入氯化鈣，使其Ca2+濃度為50 mmol/L，海藻酸鈉分子在二價(jià)Ca2+作用下側(cè)向交聯(lián)，形成控釋雙生長因子藻酸鹽水凝膠。

1.3.3 兔急性心肌梗死模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 以3%戊巴比妥鈉(1 ml/kg)耳靜脈注射麻醉后，將兔仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，四肢刺入針形電極行心電監(jiān)護(hù)。用8%硫化鈉脫毛，碘伏消毒，再以75%酒精脫碘，鋪巾，于胸骨左緣第2～4肋間斷肋，暴露縱隔及心臟，保持兩側(cè)胸膜完整，避免發(fā)生氣胸，縱行切開心包，提起左心耳，于左心耳根部下方約5 mm處用4-0帶線縫合針縫扎左室前降支。以左心室前壁心肌顏色變暗，搏動(dòng)減弱以及心電圖胸前導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)ST段抬高為結(jié)扎成功標(biāo)志。

40只實(shí)驗(yàn)兔造模成功后，隨機(jī)分成5組:生理鹽水組(無針噴射100 μl生理鹽水)、藻酸鹽凝膠組(無針噴射100 μl藻酸鹽水凝膠)、VEGF-A165凝膠組(無針噴射 100 μl VEGFA165藻酸鹽水凝膠)、PDGF-BB凝膠組(無針噴射100 μl PDGF-BB藻酸鹽水凝膠)和雙生長因子凝膠組(無針噴射100 μl含雙生長因子藻酸鹽水凝膠)。

1.3.4 形態(tài)學(xué)分析 用無針注射器于心肌梗死區(qū)及梗死周邊區(qū)每孔噴射100 μl藻酸鹽水凝膠或100 μl生理鹽水，每只實(shí)驗(yàn)兔無針噴射建立5個(gè)孔道。8 w后，各組隨機(jī)抽取3只實(shí)驗(yàn)兔經(jīng)靜脈注射10%氯化鉀處死，測量平均瘢痕厚度。

1.3.5 超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)心功能 實(shí)驗(yàn)干預(yù)24 h及8 w后，用Philips iE33超聲診斷儀進(jìn)行經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖檢查。取胸骨旁左室長軸切面M型超聲心動(dòng)圖測量左室舒張末內(nèi)徑(LVDd)、左室收縮末內(nèi)徑(LVDs)、縮短分?jǐn)?shù)(FS)及射血分?jǐn)?shù)(EF)。測量均由3個(gè)連續(xù)心動(dòng)周期平均獲得。

1.3.6 檢測CD34的表達(dá)、微血管計(jì)數(shù)及α-SMA的表達(dá)、小動(dòng)脈計(jì)數(shù) 實(shí)驗(yàn)干預(yù)8 w后，各組實(shí)驗(yàn)兔經(jīng)靜脈注射10%氯化鉀處死，常規(guī)切片、包埋。SABC法CD34及α-SMA染色，DAB顯色。根據(jù)Weidner評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)〔6〕，凡呈現(xiàn)棕色單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞群者均作為一個(gè)血管計(jì)數(shù)，肌層較厚及管腔面積大于8個(gè)紅細(xì)胞的血管不計(jì)數(shù)，每張切片選擇5個(gè)血管最多的區(qū)域，在400倍視野下進(jìn)行計(jì)數(shù)，取均值，計(jì)數(shù)微血管密度(MVD)。判定小動(dòng)脈的標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)〔7〕。每張切片選擇梗死區(qū)周圍5個(gè)血管最多的區(qū)域，在400倍視野下進(jìn)行計(jì)數(shù)，取均值，計(jì)數(shù)小動(dòng)脈密度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)分析軟件和Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以s表示，多組之間比較采用方差分析，兩兩比較使用SNK法。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)分析 凝膠組、VEGF-A165凝膠組、PDGF-BB凝膠組及雙生長因子凝膠組的平均瘢痕厚度較鹽水組的平均瘢痕厚度明顯增厚(3.7±0.2，4.8±0.3，5.2±0.3，5.6±0.3 mm vs 1.1±0.2 mm，P ＜0.05)，而凝膠組、VEGF-A165凝膠組、PDGF-BB凝膠組及雙生長因子凝膠組的平均瘢痕厚度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)心功能 應(yīng)用Philips iE33超聲診斷儀對實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行心功能評(píng)價(jià)，各組心功能比較見表1。

表1 各組兔心功能比較( s，n=8)

表1 各組兔心功能比較( s，n=8)

與其余各組8 w比較:1)P＜0.05

鹽水組 凝膠組VEGF凝膠組PDGF凝膠組 雙生長因子凝膠組P值0.2 0.004 P值 0.011 0.000 0.010 0.000 0.007 LVD(s，cm)0.91±0.02 1.19±0.03 0.90±0.03 1.12±0.01 0.88±0.03 1.03±0.02 0.89±0.04 1.05±0.02 0.88±0.04 0.91±0.031)0.744 0.000 P值 0.007 0.005 0.009 0.008 0.439 FS(%)28±1 20±2 27±2 24±1 29±2 28±2 28±2 27±2 28±2 34±21)0.776 0.000 P值 0.044 0.038 0.184 0.478 0.009 EF(%)51±2 38±2 50±2 44±2 53±2 51±1 51±2 50±2 51±2 59±21)0.474 0.000 P 24 h 8 w LVDd(cm)1.26±0.03 1.49±0.03 1.24±0.02 1.46±0.02 1.24±0.02 1.43±0.02 1.23±0.02 1.44±0.02 1.22±0.02 1.38±0.041)24 h 8 w 24 h 8 w 24 h 8 w 24 h 8 w 24 h 8 w 0.017 0.095 0.370 0.423 0.044

2.3 心肌微血管密度檢測 實(shí)驗(yàn)干預(yù)8 w后，心肌梗死周邊區(qū)心肌組織切片免疫組化CD34結(jié)果顯示單純凝膠組的微血管密度沒有明顯增加，與鹽水組微血管密度比較，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。而VEGF-A165凝膠組、PDGF-BB凝膠組及雙生長因子凝膠組的微血管密度均有所增加，與鹽水組微血管密度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，并且雙生長因子凝膠組的微血管密度增加最為明顯(圖1)。

2.4 心肌小動(dòng)脈密度檢測 實(shí)驗(yàn)干預(yù)8 w后，心肌梗死周邊區(qū)心肌組織切片免疫組化α-SMA結(jié)果顯示單純凝膠組的小動(dòng)脈密度沒有明顯增加，與鹽水組微血管密度比較，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。而VEGF-A165凝膠組、PDGF-BB凝膠組及雙生長因子凝膠組的小動(dòng)脈密度均有所增加，與鹽水組小動(dòng)脈密度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，并且雙生長因子凝膠組的小動(dòng)脈密度增加最為明顯(圖2)。

圖1 各組CD34的表達(dá)(DAB，×400)

圖2 各組α-SMA的表達(dá)(DAB，×400)

3 討論

伴隨室壁壓力增加的左室擴(kuò)展及球樣形變是心肌梗死后左室重塑的關(guān)鍵因素。注射生物材料能夠增加瘢痕厚度及穩(wěn)定心腔大小，從而減低室壁壓力〔8，9〕。研究表明〔10〕，具有生物降解性的藻酸鹽水凝膠能夠?qū)π募」Ｋ篮蟮膿p傷心肌組織提供物理支持，在心肌梗死后的左室重塑時(shí)期，植入的藻酸鹽水凝膠載體可使梗死區(qū)堅(jiān)固，從而避免左室擴(kuò)張及伸展。但是目前的研究采用直接注射心肌組織投遞藻酸鹽水凝膠支撐物，由于心臟是搏動(dòng)的器官，有針注射不可避免地增加心肌的牽拉傷，不利于心功能的改善，甚至導(dǎo)致心功能惡化。

急性心肌梗死后側(cè)支循環(huán)的開放對左室重塑及心功能的改善具有非常重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性有絲分裂原，血管再生過程中VEGF介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖以構(gòu)建新生血管的管狀結(jié)構(gòu)。PDGF則有明顯促進(jìn)血管成熟的作用。血管再生過程復(fù)雜，需要眾多因素參與其中，相互作用，共同調(diào)節(jié)。因此，聯(lián)合治療促進(jìn)血管再生已成為研究方向。VEGF與PDGF聯(lián)合應(yīng)用具有明顯的促進(jìn)血管新生、血管成熟以及增加新生血管內(nèi)徑的作用，可作為一種有效的治療性血管發(fā)生的策略〔11，12〕。

鑒于此，本研究采用無針噴射藻酸鹽水凝膠支撐物，有效地避免有針直接注射所帶來的心肌牽拉傷，同時(shí)將VEGF-A165溶于氧化的低分子量海藻酸鈉溶液，PDGF-BB溶于氧化的高分子量海藻酸鈉溶液，并混合加入鈣離子交聯(lián)為藻酸鹽水凝膠，可以實(shí)現(xiàn)修飾后的藻酸鹽水凝膠控制釋放2種生長因子，即氧化的低分子量藻酸鹽水凝膠先釋放VEGF-A165，而氧化的高分子量藻酸鹽水凝膠后釋放PDGF-BB。這樣可以通過先釋放VEGF-A165促進(jìn)血管壁內(nèi)皮細(xì)胞層生成，首先形成具有單層細(xì)胞壁的血管結(jié)構(gòu)，而后釋放的PDGF-BB則進(jìn)一步促進(jìn)血管壁平滑肌細(xì)胞層生成，最終形成有功能的小血管。本文表明無針噴射控釋雙生長因子藻酸鹽水凝膠較單生長因子凝膠組更有利于心肌梗死左室重塑及心功能的改善。

本研究存在一定的局限性。首先，本研究的觀察時(shí)間為無針噴射后8 w，應(yīng)該選用更長的觀察時(shí)間來證實(shí)無針噴射控釋雙生長因子藻酸鹽水凝膠對左室重塑及心功能的有益作用;第二，本研究沒有采用組織多普勒來評(píng)價(jià)左室舒張功能，因?yàn)楹茈y獲得所有實(shí)驗(yàn)兔的心尖切面。

總之，在心肌梗死模型中，藻酸鹽水凝膠可作為生長因子的投遞系統(tǒng)并填充梗死區(qū)提供梗死心肌組織的物理支撐。我們的研究表明無針噴射控釋雙生長因子藻酸鹽水凝膠能夠增加瘢痕厚度，改善左室重塑。生長因子VEGF-A165和PDGFBB的順序投遞能夠增加微血管密度，并誘導(dǎo)成熟小動(dòng)脈的形成，從而改善心功能，為缺血性心臟病的治療提供一種新方法。

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