VND3207及其代謝產(chǎn)物在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)

王曉楠，關(guān) 華，周平坤，蔡 耘，3，錢小紅

(1.北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院分子蛋白質(zhì)組研究室，北京 100124;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100405;3.北京蛋白質(zhì)組研究中心，北京 102206)

隨著科學(xué)技術(shù)的現(xiàn)代化，輻射與人們工作與生活聯(lián)系更加緊密，在合理開發(fā)和利用資源的同時(shí)，也需要對(duì)過量的輻射進(jìn)行有效地防護(hù)與治療。Jansson等[1]發(fā)現(xiàn)，天然化合物香草醛(香蘭素，vanillin)作為食品添加劑不但對(duì)機(jī)體和培養(yǎng)細(xì)胞安全無毒[1]，而且能夠抑制X線、γ線和紫外線誘導(dǎo)的染色體畸變，減輕 DNA 損傷[2－5]，但其抗輻射作用的濃度相對(duì)較高，活性偏低[6]。據(jù)此，在前期研究的基礎(chǔ)上篩選出毒性低、輻射防護(hù)作用更好的香草醛衍生物丁香醛(3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛，syringaldehyde，4-hydroxy-3，5-dimethoxybenzaldehyde，VND3207)。

VND3207作為一種香草醛衍生物，具有防護(hù)高能粒子輻射損傷的抗輻射作用。藥效學(xué)研究表明，VND3207能夠穩(wěn)定細(xì)胞基因組，減輕和修復(fù)α/γ射線誘導(dǎo)的DNA原初損傷，并對(duì)細(xì)胞凋亡具有良好的防護(hù)作用，而且在100倍的有效濃度下(0.5 mmol·L－1)幾乎沒有明顯的細(xì)胞毒性，照射前和照射后給藥均有效[6－7]。其藥理作用機(jī)制可能與清除輻射產(chǎn)生的自由基并激活A(yù)kt信號(hào)通路有關(guān)[8]。VND3207作為防護(hù)電離輻射損傷的抗輻射新藥，需要對(duì)其藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，為藥物的安全性和有效性提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。因此，本研究建立了一種快速、準(zhǔn)確、靈敏、專屬的液質(zhì)聯(lián)用定量分析方法，用以同時(shí)測(cè)定大鼠血漿樣品中原型藥物VND3207及其代謝產(chǎn)物的濃度，并按照藥代動(dòng)力學(xué)定量分析的要求，對(duì)上述方法進(jìn)行了相應(yīng)的方法學(xué)確證。將該方法應(yīng)用于VND3207臨床前藥代動(dòng)力學(xué)研究，闡明了VND3207及其代謝產(chǎn)物丁香酸和丁香醇在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)過程和參數(shù)，并為丁香酸具有活性代謝物的潛質(zhì)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

香草醛標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào):20111011，純度＞99%;VND3207標(biāo) 準(zhǔn)品，批 號(hào):20110805，純 度＞99.98%，均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所提供;3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲酸，又名丁香酸(syringic acid)標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào):110905，純度＞98%，購(gòu)自北京偶合科技有限公司;3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醇，又名丁香醇(syringic alcohol)標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào):10119558，純度＞97%，購(gòu)自美國(guó) ALFA化學(xué)試劑公司，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。乙腈，色譜純和依地酸(乙二胺四乙酸)二鉀，購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。純凈水，購(gòu)自娃哈哈公司。甲酸，質(zhì)譜分析純，購(gòu)自Fluka公司。羧甲纖維素鈉，化學(xué)純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Fig.1 Chemical structures of VND3207(A)，syringic acid(B)，syringic alcohol(C)and vanillin(D).

1.2 儀器

4000 Q TRAP PLC/MS/MS Systems三級(jí)四級(jí)桿-離子阱混合型質(zhì)譜儀，配有電噴霧(ESI)離子源和Analyst 1.5數(shù)據(jù)處理軟件，購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司;1260 Infinity型高效液相色譜儀(G1312C二元梯度泵、G1322A在線真空脫氣機(jī)、G1367E WPS自動(dòng)進(jìn)樣器、G1330B控溫模塊和G1316A柱溫箱)，購(gòu)自美國(guó)Agilent Technologies公司;Model 11 Plus注射泵，購(gòu)自美國(guó) Harvard Apparatus公司;Sorvall Legend Micro 17型離心機(jī)，購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司;3K30臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，購(gòu)自德國(guó) Sigma公司;SANANT SPD 2010 Speed Vac濃縮儀，購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.3 動(dòng)物、給藥及血樣采集

健康 SD大鼠6只，SPF級(jí)，雄性，體質(zhì)量210～230 g，分籠用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK-(軍)2007-004。用0.5%羧甲纖維素鈉水溶液配成VND3207混懸液給藥，空腹 ig給予0.7 ml，VND320770 mg·kg－1。分別于給藥前和給藥后1，5，10，15，25，40 min，1，1.5，2，3，4，6，8和 12 h 大鼠尾靜脈采集全血 0.5 ml，20 μl 2%EDTA水溶液抗凝，1858×g離心10 min取上清液，血漿保存于－80℃待測(cè)。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及質(zhì)控樣品的配制

用乙腈-水(1∶1，V/V)分別配制 VND3207，丁香酸，丁香醇和香草醛儲(chǔ)存液，然后將VND3207，丁香酸，丁香醇儲(chǔ)存液按比例混合，用乙腈-水(1∶1，V/V)稀釋成濃度為:0.01，0.02，0.1，0.5，2.5，5和10 mg·L－1的溶液作為標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，香草醛用乙腈-水(1∶1，V/V)配制成 1 mg·L－1的溶液作為內(nèi)標(biāo)工作液。最后將20 μl樣品工作液和10 μl內(nèi)標(biāo)工作液加入到80 μl空白血漿中，配制成濃度為2，4，20，100，500，1000 和2000 μg·L－1的血漿樣品作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用VND3207、丁香酸和丁香醇4，100 和 1000 μg·L－1為質(zhì)控樣品，進(jìn)行方法學(xué)確證。

1.5 血漿樣品預(yù)處理

標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品，質(zhì)控血漿樣品和待測(cè)血漿樣品各取 100 μl，分別加入 10 μl內(nèi)標(biāo)工作液和300 μl乙腈沉淀蛋白，渦旋震蕩 1 min，15000 × g離心10 min，取350 μl上清液常溫濃縮，移除全部溶劑，然后加入 30 μl甲酸-乙腈-水(0.1∶5∶95，V/V)重溶樣品，渦旋震蕩1 min，15000×g離心5 min，取上清液10 μl進(jìn)行定量分析。

1.6 HPLC-MS/MS法測(cè)定 VND3207及其代謝產(chǎn)物的血藥濃度

1.6.1 色譜條件

色譜柱為 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18column(2.1 mm ×50 mm，5 μm);流動(dòng)相 A 為甲酸-水溶液(0.1∶100，V/V)，流動(dòng)相 B 為甲酸-乙腈溶液(0.1∶100，V/V)，流速 400 μl·min－1，流動(dòng)相(A∶B)洗脫梯度 0～0.5 min，95∶5～20∶80;0.5～2.5 min，20∶80～5∶95;2.5～3.5 min，5∶95;3.5～4 min，5∶95～95∶5，4～9 min，95∶5其中樣品洗脫時(shí)間為4 min，色譜柱平衡時(shí)間為5 min，柱溫為室溫。

1.6.2 質(zhì)譜條件

ESI離子源，掃描方式為正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。定性離子反應(yīng)分別為質(zhì)荷比(mass-tocharge，m/z)183.0→123.1(VND3207)，m/z 199.0→155.1(丁香酸)，m/z 167.1→123.1(丁香醇)，m/z 153.1→125.1(內(nèi)標(biāo));定量離子反應(yīng)分別為 m/z 183.0→155.1(VND3207)，m/z 199.0→140.1(丁香酸)，m/z 167.1→78.1(丁香醇)，m/z 153.1→93.0(內(nèi)標(biāo));駐留時(shí)間為200 ms;碰撞氣壓力N2為設(shè)為“Medium”;氣簾氣壓力為20 psi;氣體1壓力為65 psi;氣體2壓力N2為50 psi;離子噴霧電壓為5500 V;溫度為650℃;入口電壓為10 psi;出口電壓為10 psi;去簇電壓為45 V(m/z 183.0→123.1，183.0→155.1，153.1→93.0)，57 V(m/z 199.0→155.1，199.0→140.1)，47 V(m/z 167.1→123.1，167.1→78.1)，50 V(m/z 153.1→125.1);碰撞電壓為 15 V(m/z 183.0→123.1，153.1→93.0)，19 V(m/z 183.0→155.1)，13V(m/z 199.0→155.1)，20V(m/z 199.0→140.1)，22V(m/z 167.1→123.1，167.1→78.1)，15 V(m/z 153.1→125.1)。

1.6.3 HPLC-MS/MS法測(cè)定VND3207及其代謝產(chǎn)物的方法學(xué)考察

以VND3207、丁香酸和丁香醇的色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)(Y)，以VND3207、丁香酸和丁香醇的質(zhì)量濃度與內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度比為橫坐標(biāo)(X)，權(quán)重因子為 1/X2，進(jìn)行線性回歸，得VND3207、丁香酸和丁香醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

用大鼠空白血漿配制VND3207、丁香酸和丁香醇4，100，1000 μg·L－1質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度進(jìn)行5樣本分析，連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算準(zhǔn)確度、日內(nèi)精密度與日間精密度。

分別用空白血漿和空白基質(zhì)配制VND3207、丁香酸和丁香醇4，100 和1000 μg·L－1的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度進(jìn)行5樣本分析，根據(jù)基質(zhì)加入前后和樣品提取前后質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)的色譜峰面積比，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)與提取回收率。

用大鼠空白血漿配制VND3207、丁香酸和丁香醇4，100 和1000 μg·L－1的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度進(jìn)行5樣本分析，分別考察VND3207、丁香酸和丁香醇4，100 和1000 μg·L－1在 10℃自動(dòng)進(jìn)樣器中放置6 h;血漿樣品在室溫放置3 h、血漿樣品在－80℃冷凍保存30 d、血漿樣品反復(fù)凍融2次以及血漿樣品4℃冷藏保存35 d的穩(wěn)定性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程由權(quán)重1/X2最小二乘法校正求得。血藥濃度的擬合計(jì)算由Analyst 1.5數(shù)據(jù)處理軟件完成。血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)及藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的計(jì)算由Office Excel 2007軟件完成，相關(guān)圖表由Orign 6.0軟件繪制。

2 結(jié)果

2.1 HPLC-MS/MS的方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1 VND3207、丁香酸和丁香醇的專屬性與特異性

根據(jù)VND3207、丁香酸、丁香醇和內(nèi)標(biāo)的一級(jí)和二級(jí)全掃描質(zhì)譜結(jié)果，分別確定定性和定量離子對(duì)。VND3207、丁香酸、丁香醇和內(nèi)標(biāo)的色譜峰保留時(shí)間分別為 2.79，2.68，2.60 和 2.78 min，表明VND3207、丁香酸和丁香醇不受血漿內(nèi)源物質(zhì)干擾，本方法具有一定專屬性與特異性。

2.1.2 VND3207、丁香酸和丁香醇的校正標(biāo)準(zhǔn)曲線

VND3207、丁香酸和丁香醇定量標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為2～2000 μg·L－1，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程分別為Y=0.00541X+0.0108(r=0.9918)，Y=0.00157X+0.00231(r=0.9980)，Y=0.000294X+0.000442(r=0.9955)，最低定量下線均為2 μg·L－1。

2.1.3 VND3207、丁香酸和丁香醇的準(zhǔn)確度與精密度

VND3207、丁香酸和丁香醇 4，100和1000 μg·L－1定量的準(zhǔn)確度在 91.2%～110.7% 之間，日內(nèi)和日間精密度CV＜15%，方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合生物樣品血藥濃度分析的要求。

2.1.4 基質(zhì)效應(yīng)與提取回收率

表1結(jié)果表明，基質(zhì)對(duì)VND3207和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)有增強(qiáng)作用，對(duì)丁香酸和丁香醇的質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)有抑制作用。采用乙腈蛋白沉淀法處理血漿樣品提取回收率較高，除 VND32074 μg·L－1提取回收率為(68.7±4.1)%外，VND3207，丁香酸和丁香醇的提取回收率均＞92%，均CV＜15%。

Tab.1 MatrixeffectandrecoveryofVND3207，syrangic acid and syringic alcohol in plasma of rats

2.1.5 穩(wěn)定性

如表2所示，VND3207、丁香酸和丁香醇4，100和 1000 μg·L－1在 10℃自動(dòng)進(jìn)樣器中放置 6 h;血漿樣品在室溫放置3 h、血漿樣品在－80℃冷凍保存30 d血漿樣品反復(fù)凍融2次以及準(zhǔn)確度均在(87.5±9.4)%～(117.6±5.7)%(－80℃保存30 d丁香醇除外)。受試品4，100 和1000 μg·L－1質(zhì)控樣品定量分析的濃度分別為VND3207:3.8±0.1，105.1±2.6 和(932.2±20.3)μg·L－1，丁香酸:3.9±0.7，94.5±3.2 和(919.4±40.0)μg·L－1，丁香酸:4.1±0.3，103.3±3.1 和(957.5±34.0)μg·L－1;準(zhǔn)確度均在 (91.1±3.3)%～(105.3±2.6)%以上穩(wěn)定性的考察能夠覆蓋樣品從采集到檢測(cè)的時(shí)間，由檢測(cè)結(jié)果分析，血漿樣品在－80℃冷凍保存30 d后VND3207具有較好的穩(wěn)定性，而丁香醇的含量明顯降低，丁香酸的含量有所增高，因此應(yīng)在血漿樣品采集后盡快進(jìn)行檢測(cè)，不易長(zhǎng)期保存。

Tab.2 Stability of VND3207，syringic acid and syringic alcohol in plasma of rats

2.2 VND3207及其代謝產(chǎn)物的血藥濃度和藥代動(dòng)力學(xué)

測(cè)定大鼠單次 ig給予VND320770 mg·kg－1后1，5，10，15，25，40 min，1，1.5，2，3，4，6，8和12 h血漿中VND3207及其代謝產(chǎn)物丁香酸和丁香醇的平均血藥濃度-時(shí)間曲線(圖2)，計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(表3)。

血漿中原型藥物VND3207及其代謝產(chǎn)物丁香酸和丁香醇分別于3.2，13.3 和6.8 min達(dá)到最大峰濃度 1.44±0.88，28.82±12.23 和(0.33±0.14)mg·L－1，清除半衰期分別為 78.0±44.6，114.4±17.9 和(66.0±23.8)min，平均駐留時(shí)間分別為31.5±10.2，85.5±21.4 和 (39.5±7.7)min，VND3207在體內(nèi)吸收和消除的速率快，體內(nèi)駐留時(shí)間短。

Fig.2 Concentration-time profiles of VND3207(A)，syringic acid(B)and syringic alcohol(C)in plasma of rats.VND320770 mg·kg－1was ig given rats，and blood samples were collected and VND3207，syringic acid，and syringic alcohol concentrations in plasma were determined by HPLC-MS/MS.±s，n=6.

Tab.3 Pharmacokinetic parameters of VND3207，syringic acid and syringic alcohol in rat plasma after VND320770 mg·kg －1was ig given to rats

3 討論

VND3207作為防護(hù)電離輻射損傷的抗輻射新藥，對(duì)其藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究具有重要意義。在本研究中，首先對(duì)比了固相萃取法[9－10]，乙酸乙酯萃取法[11]，環(huán)己烷萃取法[12]和乙腈蛋白沉淀法對(duì)復(fù)雜基質(zhì)樣品中香草醛衍生物的提取效率。結(jié)果表明，乙腈蛋白沉淀法具有較好的提取特異性和較高的提取回收率，且成本低、操作簡(jiǎn)便，因此，采用乙腈蛋白沉淀法作為血漿樣品制備方法。參考香草醛衍生物液質(zhì)聯(lián)用分析方法的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[13－14]，優(yōu)化了不同流動(dòng)相的組成、配比、pH值、流速、洗脫梯度等色譜條件，最終獲得最佳的色譜峰形和檢測(cè)靈敏度。

在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)室開展了VND3207及其代謝產(chǎn)物的藥代動(dòng)力學(xué)初步研究。結(jié)果表明，大鼠口服給藥后VND3207被機(jī)體快速吸收，而達(dá)到血液循環(huán)的藥量明顯低于給藥劑量，同時(shí)在血漿中檢測(cè)到大量VND3207的氧化代謝產(chǎn)物丁香酸和少量的還原代謝產(chǎn)物丁香醇?？赡苁怯捎赩ND3207從胃腸道吸收后經(jīng)過門靜脈進(jìn)入肝，在肝豐富的酶系作用下產(chǎn)生原藥的首過效應(yīng)，從而將大量的VND3207氧化為代謝物丁香酸。與原型藥物VND3207相比，丁香酸在大鼠體內(nèi)的AUC較高，T1/2和MRT時(shí)間更長(zhǎng)、cmax濃度更大，前期藥效學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在被照射前30 min口服給予VND3207，仍具有較好的抗輻射作用，而口服給藥25 min后VND3207的血藥濃度已降為(105.1±64.6)μg·L－1，遠(yuǎn)比代謝產(chǎn)物丁香酸(23416.7±11193.3)μg·L－1的血藥濃度低，因此，推測(cè)代謝產(chǎn)物丁香酸極有可能成為潛在的活性代謝物。由于丁香酸在大鼠體內(nèi)的暴露量大于原藥暴露量的10%，因此，對(duì)其藥效學(xué)活性和藥動(dòng)學(xué)評(píng)價(jià)的相關(guān)研究工作已經(jīng)開展，實(shí)驗(yàn)結(jié)論有待確定。

本實(shí)驗(yàn)首次建立了同時(shí)準(zhǔn)確測(cè)定大鼠血漿中VND3207及其代謝產(chǎn)物的液質(zhì)聯(lián)用定量分析方法，并將該方法應(yīng)用于VND3207及其代謝產(chǎn)物的藥代動(dòng)力學(xué)研究。初步的研究結(jié)果對(duì)新藥研發(fā)過程中給藥劑量的確定，藥物制劑的研究，藥物代謝途徑的探討等都具有參考價(jià)值。

致謝:感謝軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所藥學(xué)研究室程遠(yuǎn)國(guó)研究員協(xié)助完成動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

[1]Jansson T，Zech L.Effects of vanillin on sister-chromatid exchanges and chromosome aberrations in human lymphocytes[J].Mutat Res，1987，190(3):221-224.

[2]Sasaki YF， Imanishi H， Watanabe M，Ohta T，Shirasu Y.Suppressing effect of antimutagenic flavorings on chromosome aberrations induced by UV-light or X-rays in cultured Chinese hamster cells[J].Mutat Res，1990，229(1):1-10.

[3]Imanishi H， Sasaki YF， Matsumoto K， Watanabe M，Ohta T，Shirasu Y，et al.Suppression of 6-TG-resistant mutations in V79 cells and recessive spot formations in mice by vanillin[J].Mutat Res，1990，243(2):151-158.

[4]Liu GA，Zheng RL.Protection against damaged DNA in the single cell by polyphenols[J].Pharmazie，2002，57(12):852-854.

[5]Maurya DK， Adhikari S， Nair CK， Devasagayam TP.DNA protective properties of vanillin against gamma-radiation under different conditions:possible mechanisms[J].Mutat Res，2007，634(1-2):69-80.

[6]Huang R，He XP，Xu QZ，Wang Y，Huang B，Zhou PK.Protection of vanillin derivative VND3207 on genome damage and apoptosis of human lymphoblastoid cells induced by γ-ray irradiation[J].Radiat Prot(輻射防護(hù))，2009，29(4):225-231.

[7]Chen QQ， Wang L， Shang ZF， Liu XD，Wang Y，Zheng H， et al. Radioprotection of vanillin derivative VND3207 against genomic DNA damage of human fibroblastoid cells induced by α particles[J].Sci Technol(科技導(dǎo)報(bào))，2010，28(4):31-36.

[8]Zheng H，Chen ZW，Wang L，Wang SY，Yan YQ，Wu K，et al.Radioprotection of 4-hydroxy-3，5-dimethoxybenzaldehyde(VND3207)in culture cells is associated with minimizing DNA damage and activating Akt[J].Eur J Pharm Sci，2008，33(1):52-59.

[9]Danielle R，Kevin R，Shimon L.Determination of phenolic compounds in olives by reversed-phase chromatography and mass spectrometry[J].J Chromatogr A，1999，832:87-96.

[10]Adahchour M，Vreuls RJ，van der Heijden A，Brinkman UA.Trace-level determination of polar flavour compounds in butter by solid-phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry[J].J Chromatogr A，1999，844(1-2):295-305.

[11]Mahler S，Edwards PA，Chisholm MG.HPLC identification of phenols in Vidal Blanc wine using electrochemical detection[J].J Agric Food Chem，1988，36:946-951.

[12]Valdez JS，Martin DK，Mayersohn M.Sensitive and selective gas chromatographic methods for the quantitation of camphor，menthol and methyl salicylate from human plasma[J].J Chromatogr B Biomed Sci Appl，1999，729(1-2):163-171.

[13]Dinelli G，Carretero AS，Di Silvestro R，Marotti I，F(xiàn)u S，Benedettelli S，et al.Determination of phenolic compounds in modern and old varieties of durum wheat using liquid chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry[J].J Chromatogr A，2009，1216(43):7229-7240.

[14]Abdul HL，Shahabuddin M，Aisha N，Khalid MK，Arfa Y.Determination of free phenolic acids and antioxidant activity of methanolic extracts obtained from fruits and leaves of Chenopodium album[J].Food Chem，2011，126:1850-1855.