敵敵畏對斑馬魚的遺傳毒性和生殖毒性作用表現(xiàn)

蒲韻竹，王 卓，王麗星，陳怡君，鐘玉緒，李 前，付愛玲，趙寶全

(1.西南大學藥學院，重慶 400715;2.軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所，北京 100850)

農(nóng)副產(chǎn)品上殘留的農(nóng)藥，具有長期殘留性和生物蓄積性等特點[1]，其被食用后雖不會導致急性中毒，但也會造成人類和動物有機體的損傷，甚至導致人類和動物的不孕不育，或者對后代產(chǎn)生影響[2]。敵敵畏是一種高效廣譜的有機磷類農(nóng)藥，其生殖毒性和遺傳毒性已有一些報道。Dirican等[3]發(fā)現(xiàn)敵敵畏可導致雄性小鼠精囊質(zhì)量減輕，精子活力降低。Zhang等[4]發(fā)現(xiàn)高濃度敵敵畏對鯽魚精子運動顯著縮短，精子軌跡為曲線或原地不動。同時Farooq等[5]發(fā)現(xiàn)非致死濃度下敵敵畏可導致雌性鯉魚性腺指數(shù)降低。Wang等[6]研究發(fā)現(xiàn)敵敵畏可導致中國倉鼠卵巢細胞染色體的畸變。Nan等[2]研究發(fā)現(xiàn)非致死濃度下敵敵畏可導致泥鰍紅細胞細胞核出現(xiàn)微核。

斑馬魚與人類基因組相似度高達87%，與人類有著相似的毒性特征和信號傳導通路，同時斑馬魚各器官和組織在解剖學、生理學和分子水平上已被證實與哺乳動物類似，這意味著利用斑馬魚所得毒性實驗結(jié)果在多數(shù)情況能適用于人類[7]。斑馬魚遺傳背景清晰，對有害物質(zhì)非常敏感[8]，可用于評價化合物毒性，已被國家標準化組織、美國環(huán)境保護局、經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(OECD)，以及中國農(nóng)業(yè)部和環(huán)保部等各國和國際標準組織認定的生態(tài)毒性測試的標準魚類[9]，斑馬魚被稱為是21世紀新型毒性評價模型[10]，目前已有研究者將斑馬魚用于評價納米材料的亞急性毒性[11]。本實驗以斑馬魚為動物，敵敵畏為藥物，研究斑馬魚用于評價生殖毒性和遺傳毒性可靠性，旨在建立斑馬魚亞急性條件下的生殖毒性和遺傳毒性的快速評價模型，為農(nóng)藥及環(huán)境化合物毒性評價提供有效依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器

敵敵畏乳油，質(zhì)量分數(shù)77.5%，購自天津市華宇農(nóng)藥有限公司;姬姆薩染色液(Giemsa)，購自國藥集團公司;碘化丙啶(propidium iodide，PI)，購自Sigma公司;SYBR-14，購自Invitrogen公司;Tricaine methane sulfonate(MS-222)，為北京愛普華美生物科技有限公司產(chǎn)品。熒光顯微鏡:日本Olympus;AEG-120精密電子天平:日本島津;斑馬魚循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng):北京愛生科技有限公司。

1.2 動物及分組給藥

AB系斑馬魚由北京大學生命科學學院提供，本實驗室循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)馴養(yǎng)，雄雌各半，體長25～35 mm。循環(huán)養(yǎng)殖水根據(jù) Brand等[12]的方法配制:每1000 L去離子水中含75 g碳酸氫鈉，18 g海鹽和8.4 g硫酸鈣，水溫(28～29)℃，pH 值7.2左右，總硬度 62 mg·L－1(以 CaCO3計)，電導率485 μS。光照/黑暗周期為 14 h∶10 h。斑馬魚每日喂食2次人工孵化的鹵蟲幼體。

根據(jù)敵敵畏對斑馬魚急性毒性實驗，其96 h LC50為19.18 mg·L－1，在此基礎上，設定敵敵畏 0，0.97，2.92，4.87 mg·L－1組，每組隨機選取大小相當?shù)陌唏R魚成魚24尾(雄雌各半)，采用換水實驗，2 L塑料盒中放6尾魚(雄雌分開)，每24 h更換一次實驗溶液，連續(xù)染毒7和14 d。所有組斑馬魚每2 d喂食1次。

1.3 性腺指數(shù)測定

分別于敵敵畏持續(xù)染毒7 d和14 d，各濃度組隨機選取12尾斑馬魚(雄雌各半)，用0.01%的MS-222麻醉劑，麻醉約2 min后，將魚放入水中沖洗，用吸水紙吸去體表的水，電子天平稱量其體質(zhì)量。用大頭針將麻醉后的雄魚或雌魚固定在塑料泡沫板上，在體式顯微鏡下，用解剖剪將其腹腔剪開，用鑷將精囊或卵巢取出，放入1.5 ml離心管中稱質(zhì)量。計算性腺指數(shù)[13]。性腺指數(shù)=性腺質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100。

1.4 雄性班馬魚精子質(zhì)膜完整性檢測

精囊稱質(zhì)量后，按照1∶20加入HBSS緩沖液〔(g·L－1)NaCl 8.0，KCl 0.4，CaCl2·2H2O 0.16，MgSO40.01，Na2HPO4·12H2O 0.15，KH2PO40.06，NaHCO30.35，C6H12O61.0，pH 7.5)中，用槍頭充分破碎精囊，待精子充分釋放后將精囊膜挑出，制成精子懸液。取 100 μl精子懸液到0.5 ml EP管中，加入 1 μl SYBR-14染料(終濃度為100 nmo·lL－1)，4℃避光培育5 min，取出再加入10 μl PI(終濃度為 12 μmol·L－1)，再 4℃避光培育5 min[14]。利用SYBR-14/PI對斑馬魚精子進行染色，在熒光顯微鏡下觀察精子質(zhì)膜完整性?；罹映示G色熒光，死精子呈紅色熒光。用10×20倍顯微鏡觀察并拍照，用Image-Pro Plus6.0軟件統(tǒng)計精子總數(shù)量及SYBR-14染色精子數(shù)量，并計算精子質(zhì)膜完整性百分比。每尾魚觀察至少3個視野。精子質(zhì)膜完整性(%)=SYBR-14染色精子數(shù)/精子總數(shù)×100%。

1.5 血細胞微核實驗測定微核率

分別于敵敵畏持續(xù)染毒7和14 d后，各濃度組隨機選取8尾斑馬魚(雄雌各半)，斷尾取血，制成血涂片，涂片晾干后，甲醇固定15 min，用pH 6.8磷酸緩沖液稀釋的Giemsa液(體積比9∶1)染色10 min，pH 6.8磷酸緩沖液沖洗，晾干。血涂片置于10×100顯微鏡下觀察、照相，并用Image-Pro Plus6.0軟件進行統(tǒng)計，每張涂片隨機觀察2000個細胞，計算微核率(‰)。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果與分析

2.1 敵敵畏對斑馬魚性腺指數(shù)的影響

由表1可見，與正常對照組相比，持續(xù)染毒7 d后，敵敵畏2.85 和4.65 mg·L－1組的雄性和雌性斑馬魚體質(zhì)量和雌魚性腺質(zhì)量顯降低(P＜0.01)，敵敵畏4.65 mg·L－1組雌魚性腺指數(shù)顯著降低(P＜0.01)。持續(xù)染毒14 d 后，敵敵畏0.95，2.85和4.65 mg·L－1組雄性和雌性斑馬魚體質(zhì)量和性腺質(zhì)量及雌性性腺指數(shù)均小于正常對照組(P＜0.01)，提示隨著染毒濃度的增加，雌雄兩性斑馬魚體質(zhì)量和性腺質(zhì)量顯著降低。在同一濃度下，敵敵畏0.95，2.85 和4.65 mg·L－1染毒14 d，雌魚性腺指數(shù)明顯低于染毒7 d組(P＜0.01)。提示敵敵畏對斑馬魚體質(zhì)量和性腺質(zhì)量有顯著影響。

Tab.1 Effect of dichlorvos on gonadosomatic index(GSI)in zebrafish

2.2 敵敵畏對雄性斑馬魚精子數(shù)量及精子質(zhì)膜完整性影響

由表2可見，與正常對照組相比，持續(xù)染毒7 d，敵敵畏4.65 mg·L－1組雄性斑馬魚的精子總數(shù)顯著減少(P＜0.01)，持續(xù)染毒 14 d，敵敵畏 0.95，2.85 和 4.65 mg·L－1組精子總數(shù)顯著減少(P＜0.01)。敵敵畏2.85 和4.65 mg·L－1染毒14 d 后精子總數(shù)明顯低于同濃度染毒7 d組(P＜0.01)。

Tab.2 Effect of dichlorvos on number of sperm

表3結(jié)果顯示，與正常對照組相比，敵敵畏2.85和4.65 mg·L－1染毒 7 d，雄性斑馬魚精子質(zhì)膜完整率顯著降低(P＜0.01);持續(xù)染毒14 d，敵敵畏0.95 mg·L－1染毒組精子質(zhì)膜完整率也顯著降低(P＜0.01)。相同染毒濃度，染毒14 d精子質(zhì)膜完整率顯著低于染毒7 d組(P＜0.01)。

Tab.3 Effect of dichlorvos on sperm membrane integrity of male zebrafish

2.3 敵敵畏對斑馬魚血細胞細胞核的影響

斑馬魚紅細胞除形成微核以外還形成核內(nèi)空泡、核質(zhì)外凸等異?，F(xiàn)象。敵敵畏對斑馬魚紅細胞微核率結(jié)果如表4所示。與正常對照組相比，敵敵畏4.65 mg·L－1持續(xù)染毒7 d，斑馬魚紅細胞微核率顯著上升(P＜0.01)，敵敵畏2.85和 4.65 mg·L－1持續(xù)染毒14 d的微核率顯著上升(P＜0.01)，而敵敵畏0.95 mg·L－1組與正常對照組相比無統(tǒng)計學差異。提示敵敵畏毒性隨著濃度的增加而變大，同樣隨著時間的增加毒性也增加。

Tab.4 Effect of dichlorvos on micronuclei rate in zebrafish

3 討論

目前國內(nèi)評價有機磷農(nóng)藥對魚類生殖毒性，常采用鯽魚[4]，孔雀魚[15]和金魚[16]等魚類。本實驗利用斑馬魚雌性性腺指數(shù)及雄性精子膜完整性來評價斑馬魚生殖毒性，旨在建立簡單、快速評價有機磷農(nóng)藥生殖毒性的可能性。由于雄魚用于配子產(chǎn)生的能量少于雌魚[17]，所以常用性腺指數(shù)來評價雌魚的性腺發(fā)育與毒性情況[18]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，敵敵畏染毒后14 d雌魚性腺指數(shù)顯著降低。Farooq等觀察11月份到次年4月份期間敵敵畏非致死濃度下對雌性鯉魚卵巢指數(shù)的影響，發(fā)現(xiàn)隨觀察月份的增加，卵巢指數(shù)不斷增加，4月份的卵巢指數(shù)是11月份的3倍，說明鯉魚的性腺指數(shù)不僅與給藥濃度有關(guān)還與實驗時間有關(guān)。而斑馬魚可全年產(chǎn)卵，得到的實驗結(jié)果可不受實驗時間影響。雄性生殖精子膜完整性是精子活動力、精子新陳代謝的基礎，也是完成與受精過程有關(guān)活動的基礎[19]。本實驗結(jié)果顯示，敵敵畏能降低雄魚精子數(shù)量，且死亡精子增多;隨著濃度及時間的增加，敵敵畏能顯著降低雄魚精子質(zhì)量，這與Dirican等[3]用小鼠得到敵敵畏影響雄性精子質(zhì)量結(jié)果一致。Zhang等[4]利用鯽魚精子評價有機磷農(nóng)藥的生殖毒性，但鯽魚精子體外直接接觸有機磷農(nóng)藥的給藥方式無法模擬現(xiàn)實情況下染毒方式及作用結(jié)果。與鯽魚相比，采用斑馬魚成本低，個體小，飼養(yǎng)空間小，同時采用精子質(zhì)膜完整性來評價精子質(zhì)量，可以在不激活精子的情況下，通過熒光顯微鏡、熒光染料及圖像分析軟件，便能簡單、快捷的評價化合物對雄性斑馬魚的生殖毒性。

魚類血細胞微核實驗是一種有效的體內(nèi)遺傳毒性檢測方式，可用于在線監(jiān)測水質(zhì)及環(huán)境毒物評價[20]。微核形成可用于的檢測染色體異常，是遺傳毒性評價的重要依據(jù)[21]。常用的魚類有鯉魚[22]，鯽魚[23]，泥鰍[2]和黃鱔[24]等。本實驗選擇斑馬魚一方面由于其遺傳背景清楚，對于進一步機制研究有一定優(yōu)勢，另一方面斑馬魚的血紅細胞體積較大，經(jīng)吉姆薩染色后，其細胞質(zhì)和細胞核在顯微鏡下結(jié)構(gòu)清晰，易于觀察微核。正常斑馬魚血細胞多呈橢圓形，其主核位于細胞正中間，主核多數(shù)呈卵圓形，少數(shù)呈圓形。斑馬魚在敵敵畏處理后，其造血系統(tǒng)的干細胞發(fā)生顯著的變化，細胞染色體發(fā)生斷裂而產(chǎn)生的斷片或殘留的染色體在胞漿內(nèi)形成微核，斑馬魚紅細胞因敵敵畏的誘發(fā)出現(xiàn)的核變異中，主要包含了微核和核異常。本實驗結(jié)果表明，隨敵敵畏作用時間和濃度的增加，斑馬魚微核率顯著上升。Nan等用敵敵畏6.409 g·L－1染毒泥鰍9 d的微核率為 2.138‰，本實驗用敵敵畏4.65 mg·L－1染毒斑馬魚7 d，微核率為8.7‰，并且染毒14 d后微核率升高3倍。雖然泥鰍對敵敵畏敏感，染毒劑量低，但是微核形成率沒有斑馬魚高，同時斑馬魚取材方便，剪尾取血后不會死亡，魚尾可在幾天內(nèi)重新長出，這對于長期研究及監(jiān)測毒物的遺傳毒性研究了提供便利條件。

本實驗通過觀察敵敵畏對斑馬魚生殖和遺傳毒性的作用表現(xiàn)，說明斑馬魚具有做為研究藥物及毒物的遺傳及生殖毒性作用模型的可能。

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