β－氯氰菊酯對(duì)斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性

徐永學(xué)，劉麗麗，王 健，閆艷春

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院生物學(xué)教研室，北京 100081)

擬除蟲菊酯類(pyretbroids)農(nóng)藥是由國(guó)外公司于20世紀(jì)70年代開發(fā)的一類新型高效仿生殺蟲劑，被譽(yù)為殺蟲劑歷史上的第三個(gè)里程碑;因其具有高效、安全、殺蟲譜廣、低殘留等特點(diǎn)，被廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。近年來(lái)，擬除蟲菊酯類殺蟲劑發(fā)展十分迅速，產(chǎn)量已占據(jù)全世界殺蟲劑市場(chǎng)的30%[1]，并被我國(guó)列入替代高毒農(nóng)藥的理想品種。

一種高效氯氰菊酯β－高效氯氰菊酯(乙體氯氰菊酯，beta－cypermethrin)屬Ⅱ型擬除蟲菊酯類成農(nóng)藥，化學(xué)名為(R，S)－α－氰基－3－苯氧基芐基(1R，3R)－3－(2，2－二氯乙烯基)－2，2－二甲基環(huán)丙羧酸酯，化學(xué)式為C22H19Cl2NO3，結(jié)構(gòu)式見圖 1[2]，是氯氰菊酯經(jīng)差向異構(gòu)得到的兩對(duì)活性較高的對(duì)映體[3]。因其生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低和藥效更高以及對(duì)哺乳類動(dòng)物毒性小等優(yōu)點(diǎn)，在我國(guó)已占據(jù)了擬除蟲菊酯類農(nóng)藥市場(chǎng)份額的50%以上[4]。但由于β－氯氰菊酯對(duì)魚類具有高毒性，在許多國(guó)家其用量受到嚴(yán)格控制，如歐盟等國(guó)家都制定了最大殘留量標(biāo)準(zhǔn)。

Fig.1 Chemical structure of beta－cypermethrin.

斑馬魚是一種小型熱帶淡水魚，基因與人類基因的相似度達(dá)到87%，發(fā)育過(guò)程、器官構(gòu)造、生理功能、基因結(jié)構(gòu)等都與哺乳類動(dòng)物非常相近。作為一種新的模式脊椎動(dòng)物已被廣泛用于毒理學(xué)的研究中，經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織在1996年將斑馬魚胚胎發(fā)育方法列入測(cè)定單一化學(xué)毒性的標(biāo)準(zhǔn)方法之一，并制定了詳細(xì)的操作指南。斑馬魚胚胎應(yīng)用于毒理學(xué)研究有諸多優(yōu)點(diǎn):體外受精，體外發(fā)育而且具有光學(xué)透明性，光學(xué)顯微鏡可穿透其組織，觀察者可清楚地看到各個(gè)發(fā)育階段，毒理測(cè)試時(shí)可方便評(píng)價(jià)毒理學(xué)終點(diǎn);發(fā)育迅速，測(cè)試周期短，一般不超過(guò)1周即可完成;成魚繁殖能力強(qiáng)，一條雌魚一般每次可產(chǎn)卵100～300枚，每周可產(chǎn)卵1次，樣本數(shù)可以很大，以確保統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著性;成魚體型小，易于飼養(yǎng)管理，成本低。此外，最大優(yōu)勢(shì)在于有豐富的毒性反應(yīng)指標(biāo)(致死、亞致死、致畸)可供觀察和分析[5]，因此正逐步替代傳統(tǒng)成魚用于急性毒性實(shí)驗(yàn)等[6]。

本研究以斑馬魚胚胎為模型，觀察β－氯氰菊酯暴露所導(dǎo)致的斑馬魚胚胎發(fā)育毒性，補(bǔ)充此類農(nóng)藥對(duì)胚胎發(fā)育毒性數(shù)據(jù)的短缺，為制定更加完善的環(huán)境評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)及風(fēng)險(xiǎn)管理提供毒理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物和儀器

β－氯氰菊酯，純度＞99%，由中國(guó)廣東立威化工有限公司提供;丙酮，分析純，中國(guó)北京化工廠;一次性培養(yǎng)皿和巴斯特吸管，中國(guó)江蘇省海門市昊遠(yuǎn)實(shí)驗(yàn)儀器廠;LRH－250生化培養(yǎng)箱，中國(guó)上海一恒科技儀器有限公司;CKX41倒置顯微鏡，日本奧林巴斯公司;XMTD－6000電熱恒溫水浴鍋，中國(guó)北京六一儀器廠;TH－300梯度混合器，中國(guó)上海滬西分析儀器廠有限公司;JPBJ－608型便攜式溶解氧分析儀和PHS－3D雷磁pH計(jì)，中國(guó)上海精密科技儀器有限公司。

1.2 胚胎培養(yǎng)液

胚胎培養(yǎng)液即 Holt緩沖液，配方如下(g):NaCl 3.5，KCl 0.05，NaHCO30.025，CaCl20.1，用去離子水補(bǔ)至1 L。

1.3 斑馬魚的飼養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)用魚為AB品系斑馬魚，親本斑馬魚由北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳學(xué)與發(fā)育生物學(xué)研究中心贈(zèng)送。后經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室繁殖擴(kuò)大飼養(yǎng)，至6月齡性成熟能夠穩(wěn)定產(chǎn)卵，體長(zhǎng)4.0～5.0 cm，自然死亡率＜0.5%。

飼養(yǎng)方案按照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行，依據(jù)文獻(xiàn)[8]對(duì)發(fā)育階段分期。雌雄魚分開飼養(yǎng)，光周期嚴(yán)格控制光照/黑暗14 h∶10 h，水溫控制在 27.5～28.5℃，電導(dǎo)率為460～500 μS·cm－1，pH 6.75～7.25，溶氧＞6.0 mg·L－1。每天早、中、晚定時(shí)投喂 3 次新鮮孵化的豐年蟲無(wú)節(jié)幼體，并及時(shí)清理殘食廢物，每周檢測(cè)水質(zhì)以保證各參數(shù)穩(wěn)定。

1.4 斑馬魚的交配與收卵

在交配產(chǎn)卵的前一天晚上，選擇體型健壯、游動(dòng)靈活的健康成年斑馬魚于專用交配盒內(nèi)，親魚雌雄分開且比例為1∶1或1∶2，為保證水溫維持在28.5℃，將配魚缸置于水浴鍋內(nèi)。第二天早晨給予光照，抽隔板后30 min內(nèi)完成交配產(chǎn)卵。根據(jù)Schulte和Nagel[6]的方法收集魚卵。用巴斯特吸管將魚卵收集于一次性培養(yǎng)皿中，用新鮮的養(yǎng)魚水清洗數(shù)次以除去未受精卵、糞便等殘留物，然后轉(zhuǎn)移至光照生化培養(yǎng)箱，溫度28.5℃，發(fā)育至受精后3 h(3 hours post－fertilization，3 hpf)左右在倒置顯微鏡下挑選出正常分裂的魚卵，進(jìn)行毒性實(shí)驗(yàn)。

1.5 β－氯氰菊酯的毒性觀察

由于β－氯氰菊酯在空氣、陽(yáng)光下及在中性及微酸性介質(zhì)中相對(duì)比較穩(wěn)定，不易揮發(fā)，不易發(fā)生水解、光解等反應(yīng)，所以采用換水式對(duì)斑馬魚胚胎進(jìn)行毒性實(shí)驗(yàn)。為了排除未受精卵及先天發(fā)育異常的受精卵對(duì)毒性評(píng)價(jià)的干擾，確保對(duì)照組異常卵的發(fā)生率小于3%，選擇在3 hpf時(shí)(囊胚期)開始染毒。選用一次性培養(yǎng)皿進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)培養(yǎng)皿做一個(gè)濃度，放入30枚魚卵和40 ml溶液，β－氯氰菊酯0.05，0.1，0.15，0.2，0.6，1 mg·L－1，以及空白對(duì)照和助溶劑對(duì)照。為保證每個(gè)β－氯氰菊酯溶液濃度的準(zhǔn)確性，開始染毒前先將魚卵小心的轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，盡量去除水分之后再分別加入不同濃度的受試物溶液和對(duì)照液。然后將各培養(yǎng)皿迅速轉(zhuǎn)移到生化培養(yǎng)箱中，溫度恒定在28.5℃。顯微鏡下進(jìn)行觀察直至96 hpf，期間及時(shí)清除死亡的胚胎，并記錄現(xiàn)象。

用丙酮作溶劑配制 β－氯氰菊酯 0.1 kg·L－1儲(chǔ)液，然后用培養(yǎng)液Holt緩沖液稀釋配成不同濃度的β－氯氰菊酯溶液，丙酮濃度不超過(guò)1%。β－氯氰菊酯溶液在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天臨時(shí)配用，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每12 h更換一半受試物溶液，以保證溶液中各參數(shù)的穩(wěn)定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 β－氯氰菊酯對(duì)斑馬魚形態(tài)學(xué)的影響

與正常對(duì)照組比較，丙酮對(duì)照組斑馬魚胚胎在整個(gè)觀察期(96 hpf)內(nèi)發(fā)育進(jìn)程非常同步且未觀察到任何毒性反應(yīng)，而 β－氯氰菊酯 0.05，0.1，0.15，0.2，0.6 和1 mg·L－1組胚胎在24 hpf以前形態(tài)上未觀察到明顯異常，從48 hpf以后表現(xiàn)出不同程度的毒性反應(yīng)癥狀，如體軸彎曲、心包囊腫等(圖2D2－E3);β－氯氰菊酯0.2，0.6 和1 mg·L－1組的部分胚胎在48 hpf即有明顯體軸彎曲畸形反應(yīng)(圖2D2)，β－氯氰菊酯0.05，0.1 和0.15 mg·L－1組在72 hpf才逐漸出現(xiàn)(圖2C3);而心包囊腫在48 hpf時(shí)未觀察到，至 72 hpf時(shí)除 β－氯氰菊酯0.05 mg·L－1組外都開始大量出現(xiàn)(圖2D3);并且在72 hpf以后β－氯氰菊酯組胚胎全部沉于容器底部呈抽搐狀態(tài)失去游動(dòng)能力，而正常對(duì)照組胚胎孵化脫膜后呈懸狀貼在容器壁上，在72 hpf時(shí)已能夠自由游動(dòng)。此外，與正常對(duì)照組相比，β－氯氰菊酯0.2，0.6 和1 mg·L－1組幼魚在72 hpf時(shí)胸鰭發(fā)育受到嚴(yán)重抑制且黑色素減少體色偏黃(圖2E3)。

Fig.2 Effect of beta－cypermethrin on morphological development of zebrafish embryos at 24 hpf，48 hpf and 72 hpf.A:normal control;B:acetone control;C，D and E:beta－cypermethrin 0.1，0.2 and 1 mg·L －1groups，respectively.1 －3:24，48 and 72 hpf，respectively.Arrows indicate pericardial edema in response to beta－cypermethrin stress.

2.2 β－氯氰菊酯對(duì)斑馬魚24 hpf自主抽動(dòng)的影響

斑馬魚胚胎發(fā)育至24 hpf時(shí)尾部表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抽動(dòng)。圖3結(jié)果顯示，正常對(duì)照組胚胎為(0.72±0.19)min－1，β－氯氰菊酯1 mg·L－1組胚胎為(3.83±1.07)min－1。此外，與正常對(duì)照組相比，β－氯氰菊酯0.05，0.1 和0.15 mg·L－1組平均胚胎抽動(dòng)次數(shù)無(wú)太大變化但波動(dòng)程度明顯增強(qiáng)，而β－氯氰菊酯0.2，0.6 和1 mg·L－1組胚胎抽動(dòng)次數(shù)及劇烈程度隨著β－氯氰菊酯組濃度的升高都顯著增強(qiáng)，且類似抽搐狀。

2.3 β－氯氰菊酯對(duì)斑馬魚48 hpf孵化率的影響

斑馬魚胚胎從48 hpf開始脫膜孵化，是胚胎發(fā)育過(guò)程的一個(gè)重要時(shí)期，常被用于毒性評(píng)價(jià)的重要毒理學(xué)終點(diǎn)，諸多文獻(xiàn)報(bào)道了孵化率與毒性之間的關(guān)系[9]。本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組胚胎48 hpf孵化率約為(15.5±1.2)%，β－氯氰菊酯 1 mg·L－1組為(98.9±4.3%)%。即β－氯氰菊酯加快了斑馬魚胚胎的孵化，且 β－氯氰菊酯 0.15，0.2，0.6和1 mg·L－1組的胚胎48 hpf時(shí)幾乎全部孵化完成，而β－氯氰菊酯0.05，0.1 和0.15 mg·L－1組胚胎的孵化率呈現(xiàn)清晰的劑量依賴關(guān)系，即在一定濃度范圍內(nèi)，β－氯氰菊酯濃度與孵化率呈正相關(guān)性趨勢(shì)(r=0.92，P＜0.05)(圖4)。

Fig.3 Effect of beta－cypermethrin on counts of spontaneous movements of zebrafish embryos at 24 hpf.C1:normal control;C2:acetone control.±s，n=3.*P＜0.05，compared with normal control group.

Fig.4 Effect of beta－cypermethrin on percentage of hatching in zebrafish embryos at 48hpf.C1:normal control;C2:acetone control.±s，n=3.*P＜0.05，compared with normal control group.

2.4 β－氯氰菊酯對(duì)斑馬魚48 hpf心率的影響

心率是斑馬魚胚胎毒性測(cè)試實(shí)驗(yàn)中一個(gè)非常重要的亞致死毒理學(xué)終點(diǎn)。正常對(duì)照組48 hpf胚胎10 s心臟跳動(dòng)約30.0次，β－氯氰菊酯組胚胎心率加快達(dá)到34.7次，且各β－氯氰菊酯組數(shù)值相近，但是72 hpf以后，隨著心包囊腫的發(fā)生，有些個(gè)體心跳明顯減弱，血液循環(huán)減慢，出現(xiàn)了嚴(yán)重異常。正常對(duì)照組胚胎心率與Kimmel等[8]報(bào)道的非常一致。

2.5 β－氯氰菊酯對(duì)斑馬魚體軸彎曲的影響

圖5 結(jié)果顯示;β－氯氰菊酯 0.05 mg·L－1組在72 hpf和96 hpf畸形率分別是 6.6%和 10%，β－氯氰菊酯1 mg·L－1組分別是97.8%和 100%;同一濃度β－氯氰菊酯，96 hpf胚胎畸形率明顯高于72 hpf的畸形率;不同濃度β－氯氰菊酯組之間比較，濃度越高畸形率越高，呈現(xiàn)一定的時(shí)間劑量依賴性(r=0.87，P＜0.05)。β－氯氰菊酯 0.6 和1 mg·L－1組胚胎在72 hpf時(shí)幾乎全部畸形且部分個(gè)體出現(xiàn)嚴(yán)重的心包囊腫;發(fā)育至96 hpf時(shí)畸形加劇。

Fig.5 Effect of beta－cypermethrin on cumulative spine malformation rate in zebrafish embryos at 72 hpf and 96 hpf.C1:normal control;C2:acetone control.±s，n=3.*P＜0.05，compared with normal control group.

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以丙酮作助溶劑，為避免助溶劑丙酮的毒害作用影響，控制β－氯氰菊酯溶液中丙酮濃度不能超過(guò)1%，經(jīng)過(guò)多次預(yù)實(shí)驗(yàn)和觀察，最終確立了β－氯氰菊酯濃度:0.05，0.1，0.15，0.2，0.6 和1 mg·L－1。在此濃度范圍內(nèi) β－氯氰菊酯能夠完全溶解，但是未能引起斑馬魚胚胎致死，因此，本研究未探討β－氯氰菊酯對(duì)斑馬魚胚胎的劑量－致死效應(yīng)關(guān)系，而主要對(duì)亞致死、致畸毒理學(xué)終點(diǎn)進(jìn)行了觀察探討。

對(duì)于毒理學(xué)終點(diǎn)的觀察，為方便定量與清晰的原則，主要選擇了在5個(gè)重要且清晰的發(fā)育時(shí)間點(diǎn)(8，24，48，72和 96 hpf)進(jìn)行仔細(xì)觀察，包括24 hpf自主抽動(dòng)、48hpf孵化率及心率、72和96 hpf色素沉積、體軸彎曲及心包囊腫等，并重點(diǎn)記錄了24 hpf自主抽動(dòng)次數(shù)、48 hpf孵化率以及72和96 hpf體軸彎曲個(gè)體比例。胚胎發(fā)育正常與否的判斷主要參考Kimmel等的描述。

Kimmel等發(fā)現(xiàn)，斑馬魚自主抽動(dòng)是由于肌肉系統(tǒng)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元系統(tǒng)接點(diǎn)發(fā)育引起，不受機(jī)體控制的活動(dòng)，是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)未發(fā)育完全的表現(xiàn)。早在2002年，Drapeau等[11]對(duì)斑馬魚運(yùn)動(dòng)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)這種活動(dòng)最早起始于14體節(jié)時(shí)期，至20體節(jié)時(shí)期達(dá)到高峰，隨后隨著神經(jīng)系統(tǒng)的完善而逐漸減弱。本實(shí)驗(yàn)中，正常對(duì)照組斑馬魚胚胎在24 hpf時(shí)自主抽動(dòng)次數(shù)平均每分鐘不到1次，表明神經(jīng)系統(tǒng)已發(fā)育到相對(duì)完善的時(shí)期，而β－氯氰菊酯組胚胎活動(dòng)遠(yuǎn)強(qiáng)于正常和溶劑對(duì)照組，表明神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育受到抑制，β－氯氰菊酯對(duì)斑馬魚胚胎具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性。

孵化過(guò)程是生化與機(jī)械力共同作用的結(jié)果。生化作用主要依賴孵化酶即Zn－金屬蛋白酶對(duì)卵膜的降解作用;經(jīng)酶作用后，胚胎尾部的抽動(dòng)將卵膜撕破完成孵化過(guò)程。因此，對(duì)孵化酶或運(yùn)動(dòng)能力的毒害作用都會(huì)影響斑馬魚胚胎的順利孵化。據(jù)報(bào)道能夠抑制蛋白酶活性的金屬離子如鎘和銅等會(huì)降低孵化酶的活性，從而導(dǎo)致胚胎孵化延遲[12]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)，β－氯氰菊酯加速了胚胎的孵化。綜合本實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果推測(cè)β－氯氰菊酯可能未導(dǎo)致孵化酶活性降低，而自主抽動(dòng)程度的加劇促進(jìn)了卵膜的破裂，進(jìn)而加速了孵化過(guò)程。對(duì)于β－氯氰菊酯與孵化酶的詳細(xì)作用機(jī)制本實(shí)驗(yàn)未做探究，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

斑馬魚心血管在20 hpf開始形成，能夠收縮但尚未與發(fā)育中的血液循環(huán)系統(tǒng)相連，發(fā)育至30 hpf時(shí)心臟分化出心室和心房，36 hpf時(shí)開始規(guī)律的心跳[13]。正常生長(zhǎng)條件下，48 hpf時(shí)主要的器官系統(tǒng)完成形態(tài)發(fā)生并開始破膜孵化，此時(shí)心臟功能已相對(duì)比較完善，是斑馬魚胚胎發(fā)育進(jìn)程的一個(gè)重要轉(zhuǎn)折點(diǎn)。心率容易受外界因素如溫度、用藥等的影響而加快，但通常會(huì)隨著外界因素的消除而逐漸恢復(fù)正常。本實(shí)驗(yàn)中，除用藥外其他實(shí)驗(yàn)條件完全相同，故斑馬魚胚胎心率的加快必然是由于β－氯氰菊酯暴露所致。有趣的是，β－氯氰菊酯組胚胎心率加快至每10 s 34.7次，且各濃度組數(shù)值相近，并未隨著β－氯氰菊酯濃度的增大而明顯增加，實(shí)際上這一心率數(shù)值很可能已接近斑馬魚胚胎心率的最大值，很難再有明顯的增加。這也在某種程度上表明，在48 hpf之前斑馬魚胚胎可能由于受到卵膜的保護(hù)并未因?yàn)楸┞队讦拢惹杈挣?dǎo)致嚴(yán)重的心臟功能衰竭，而是通過(guò)增加心率加快全身血液的供應(yīng)，以滿足氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等的需要。但是在72 hpf后，β－氯氰菊酯組胚胎出現(xiàn)了不同嚴(yán)重程度的心包囊腫，故綜合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推斷β－氯氰菊酯暴露至48 hpf時(shí)，很可能已經(jīng)導(dǎo)致斑馬魚胚胎心功能不全但未嚴(yán)重衰竭，而在隨后發(fā)育過(guò)程中加劇并引起諸多胚胎出現(xiàn)嚴(yán)重的心包囊腫，心跳微弱和血液循環(huán)減慢。

體軸彎曲等畸形是斑馬魚胚胎毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中常出現(xiàn)的毒性反應(yīng)。已有研究表明，四溴聯(lián)苯醚[14]、四氯二苯并－p－二噁英[15]和銅[16]等都會(huì)引起斑馬魚胚胎發(fā)育畸形。體軸的彎曲通常是由于體軸肌肉組織損壞，包括肌肉細(xì)胞壞死及肌纖維受損，或脊椎骨原件自身發(fā)生畸形所致;此外，鈣離子通道功能紊亂也會(huì)導(dǎo)致脊柱彎曲[17]。本實(shí)驗(yàn)中斑馬魚幼魚體軸彎曲，可能是由于β－氯氰菊酯暴露導(dǎo)致肌肉組織損傷和神經(jīng)肌肉系統(tǒng)發(fā)育受損兩方面原因所致，具體機(jī)制還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

與其他脊椎動(dòng)物相似，斑馬魚黑色素細(xì)胞由神經(jīng)嵴發(fā)展而來(lái)[18]。斑馬魚胚胎發(fā)育至24 hpf黑色素開始出現(xiàn)[8]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，72 hpf處理組幼魚黑色素減少體色偏黃，很可能是由于早期神經(jīng)發(fā)育受到抑制所致。

影響擬除蟲菊酯類對(duì)魚類毒性作用的因素很多。如魚的年齡，一般認(rèn)為斑馬魚胚胎較成魚相比對(duì)外源毒物更為敏感。環(huán)境因素如溫度也會(huì)影響擬除蟲菊酯類對(duì)動(dòng)物毒害作用，Weston等[19]發(fā)現(xiàn)擬除蟲菊酯類對(duì)魚類的毒性作用與溫度成反向相關(guān)的關(guān)系。此外，所含異構(gòu)體比例不同表現(xiàn)出的毒性作用差別也很大[20]。β－氯氰菊酯作為擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的一種，具有很強(qiáng)的疏水性，容易被魚鰓吸附;另外，由于魚體內(nèi)缺乏水解擬除蟲菊酯類的酶，擬除蟲菊酯類在魚體內(nèi)的代謝主要靠氧化作用，致使擬除蟲菊酯類對(duì)魚類的毒性作用遠(yuǎn)大于對(duì)哺乳動(dòng)物和鳥類的毒性作用[21]。在96 h觀察期內(nèi)，斑馬魚胚胎孵化完成之前并未出現(xiàn)卵凝結(jié)、尾部不延展、無(wú)體節(jié)和無(wú)心跳等致死毒理學(xué)終點(diǎn)，只觀察到心跳加速，自主抽動(dòng)強(qiáng)烈;而孵化完成之后逐漸出現(xiàn)了體軸彎曲、心包囊腫和體長(zhǎng)較短(未作數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì))等嚴(yán)重的畸形效應(yīng)，甚至96 hpf時(shí)有些幼魚只有微弱的心跳而身體已經(jīng)完全不能動(dòng)，表現(xiàn)出孵化完成后毒性更強(qiáng)的特征。推測(cè)很可能是由于β－氯氰菊酯具有很強(qiáng)的親脂性，與斑馬魚胚胎卵膜結(jié)合，使其不易進(jìn)入胚胎體內(nèi)，而孵化后胚胎由于失去了卵膜的保護(hù)對(duì)化學(xué)物質(zhì)更為敏感。曾有文獻(xiàn)認(rèn)為去卵膜之后能夠改善胚胎毒性測(cè)試[22]。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對(duì)處于發(fā)育時(shí)期的動(dòng)物表現(xiàn)出更強(qiáng)的毒性[23]。并且已有報(bào)道稱孕婦、兒童甚至嬰幼兒尿液中含有擬除蟲菊酯類農(nóng)藥代謝產(chǎn)物[24]。DeMicco 等[25]通過(guò)6 種常見擬除蟲菊酯類對(duì)斑馬魚胚胎的神經(jīng)發(fā)育毒性，發(fā)現(xiàn)擬除蟲菊酯類對(duì)斑馬魚和哺乳動(dòng)物引起的神經(jīng)毒性非常相似且具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性;而且其自主抽動(dòng)隨著濃度的增加而加劇與本實(shí)驗(yàn)的觀察一致。Shi等[26]在氯氰菊酯對(duì)斑馬魚胚胎幼魚的毒性研究中采用吖啶橙染色法發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)呈現(xiàn)大量細(xì)胞凋亡，并出現(xiàn)體軸彎曲、心包囊腫等毒性反應(yīng);Xu等[20]對(duì)β－氯氰菊酯4種對(duì)映異構(gòu)體的斑馬魚胚胎致畸毒性分別進(jìn)行了研究，也有心包囊腫和體軸彎曲等畸形出現(xiàn)，但是未對(duì)神經(jīng)毒性進(jìn)行探討。

歐盟等國(guó)家規(guī)定在谷物、水果和蔬菜中β－氯氰菊酯最大殘留量為0.02 mg·L－1;在西紅柿、豆莢蔬菜和玉米谷物中最大殘留量為0.05 mg·L－1;在黃瓜中最大殘留量為0.1 mg·L－1;在杏、萵苣和桃中最大殘留量為0.5 mg·L－1，而在我國(guó)目前尚未制定β－氯氰菊酯殘留限量。本實(shí)驗(yàn)中，β－氯氰菊酯0.05 mg·L－1對(duì)斑馬魚胚胎暴露20 h既能對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重的損害，暴露至72 hpf時(shí)引起體軸彎曲，而 β－氯氰菊酯 0.05 mg·L－1遠(yuǎn)低于歐盟國(guó)家制定的在杏、萵苣和桃中最大殘留量0.5 mg·L－1，因此，這一數(shù)值可以為制定其在某些食物尤其是水產(chǎn)品中的殘留限量提供重要的參考，且應(yīng)當(dāng)?shù)陀?.05 mg·L－1，確切的安全限量還需大量實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。此外，孕婦、兒童及嬰幼兒應(yīng)遠(yuǎn)離暴露有高效氯氰菊酯的環(huán)境，杜絕含有其高殘留的食品，避免危害的發(fā)生。近期國(guó)內(nèi)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，某地區(qū)95%被檢孕婦尿中檢測(cè)出擬除蟲菊酯類代謝產(chǎn)物，且暴露水平高于國(guó)外相關(guān)數(shù)據(jù)，高暴露組幼兒的發(fā)育商顯著低于低暴露組幼兒[27]。

綜合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，β－氯氰菊酯對(duì)斑馬魚胚胎具有嚴(yán)重的神經(jīng)毒性，對(duì)孵化完成后的幼魚心臟和體軸等表現(xiàn)出嚴(yán)重的致畸效應(yīng)并呈現(xiàn)明顯的時(shí)間劑量依賴性，高濃度下還會(huì)嚴(yán)重抑制胚胎發(fā)育進(jìn)程，為深入研究β－氯氰菊酯對(duì)斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性提供了證據(jù)和線索。

致謝:感謝北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張博教授提供實(shí)驗(yàn)材料及斑馬魚飼養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo);感謝劉麗麗、王健、史延華和宋金龍?jiān)趯?shí)驗(yàn)和本文寫作中給予的大力支持與幫助。

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