艾洛替尼耐藥的卵巢癌SKOV3細(xì)胞系的建立及其耐藥特性

趙 青，任志廣，賈硯寒，魏寅祥，李新穎，黎 燕，李亞里，彭 暉

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所免疫學(xué)研究室，北京 100850;2.南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津 300071;3.解放軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100853)

最新一項(xiàng)世界范圍內(nèi)腫瘤發(fā)病統(tǒng)計(jì)中，在女性生殖器官惡性腫瘤中，卵巢癌發(fā)病率居第三位，病死率高居第一[1]。使用一線化療方案紫杉醇聯(lián)合鉑類藥物(TP方案)后的絕大多數(shù)卵巢癌患者，最終腫瘤復(fù)發(fā)并導(dǎo)致耐藥，中位生存期僅18個(gè)月[2]。隨著人們對(duì)腫瘤標(biāo)志物的不懈研究，靶向治療讓人們充滿期待。表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是目前腫瘤治療中非常有潛力的靶點(diǎn)。研究表明，其過表達(dá)與包括卵巢癌、結(jié)腸癌、頭頸癌、肺癌及胰腺癌在內(nèi)的多種癌癥的預(yù)后不良有關(guān)[2]。有報(bào)道稱，EGFR在卵巢癌中陽(yáng)性率為35%～70%[3]。

艾洛替尼(erlotinib，Erl)作為第二個(gè)被FDA批準(zhǔn)的靶向EGFR的小分子抑制劑，已在非小細(xì)胞肺癌的治療中取得不俗的成績(jī)。在美國(guó)臨床試驗(yàn)官方登記網(wǎng)站上顯示，其在卵巢癌的最新的臨床試驗(yàn)也處于第三期的階段[4]。在一項(xiàng)Erl單藥臨床試驗(yàn)中，藥物反應(yīng)率達(dá)到6%，而病情穩(wěn)定率為44%[5]。另外一項(xiàng)與紫杉醇和卡鉑的聯(lián)合用藥的臨床二期試驗(yàn)中，卵巢癌Ⅲ，Ⅳ期患者中術(shù)后化療藥與Erl聯(lián)合使用完全有效率為29%，術(shù)前行新輔助化療的患者使用聯(lián)合方案的完全緩解率為11%[6]。Erl在卵巢癌的臨床應(yīng)用前景令人期待。其單藥或聯(lián)合其他化療藥物或靶向藥物的臨床研究仍在進(jìn)行中，以EGFR為主的靶向治療也成為了最有希望的卵巢癌治療途徑之一。但不得不令人們關(guān)注的另一個(gè)事實(shí)是，盡管第一代酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)吉非替尼和Erl已經(jīng)成功用于臨床的EGFR靶向治療，其有效率高達(dá)70%～80%，中位生存期為20～30個(gè)月。但在治療的1年內(nèi)最終仍會(huì)出現(xiàn)TKI耐藥導(dǎo)致腫瘤惡性發(fā)展[7]。Erl在卵巢癌的靶向治療中也可能存在著類似的問題，本研究通過建立Erl誘導(dǎo)的卵巢癌耐藥株，來探討此類藥物在未來卵巢癌靶向治療的可行性與療效，進(jìn)而為其可能產(chǎn)生耐藥的機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

Erl，購(gòu)自百靈威公司，由二甲亞砜(DMSO)配置成10 mmol·L－1儲(chǔ)備液。紫杉醇注射液、注射用硫酸長(zhǎng)春新堿(vincristine)與甲氨蝶呤(methotrexate)，購(gòu)自浙江海正藥業(yè);順鉑(cisplatin)注射液，購(gòu)自齊魯制藥有限公司;注射用鹽酸米托蒽醌(mitoxantrone)與注射用鹽酸拓?fù)涮婵?topotecan)，分別購(gòu)自江蘇豪森藥業(yè)和黃石飛云制藥公司;注射用鹽酸表柔比星(epirubicin)，氟尿嘧啶(fluorouracil)分別購(gòu)自輝瑞制藥及金耀氨基酸有限公司。PE熒光標(biāo)記的流式抗人CD243(ABCB1)-PE抗體，抗人 CD338(ABCG2)-PE抗體、抗人TLR4-PE抗體均購(gòu)自 eBioscience;抗人 MRP1-FITC購(gòu)自BD公司。HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗，購(gòu)自北京中杉金橋公司;GAPDH鼠源單抗，購(gòu)自美國(guó) California Bioscience公司;EGFR，p-EGFR，ERK，p-ERK，ErbB2，p-ErbB2兔源多克隆抗體均購(gòu)自Cell Signal Technology。ECL顯色試劑盒購(gòu)自Amersham LifeScience公司;BCA蛋白定量試劑盒，購(gòu)自Thermo公司;胎牛血清，購(gòu)自北京元亨金馬公司;Hyclone DMEM(高糖)培養(yǎng)基，為塞默菲世爾公司產(chǎn)品;胰蛋白酶、磺酰羅丹明B、脂多糖，購(gòu)自美國(guó) Sigma-Aldrich公司;FACS Calibur型流式細(xì)胞儀，為美國(guó) BD公司產(chǎn)品;5417R型小型臺(tái)式冷凍離心機(jī)，為Eppendorf公司產(chǎn)品;1420 VICTOR3型熒光分光光度計(jì)，為PerkinElmer公司產(chǎn)品;倒置顯微鏡，為Olympus公司產(chǎn)品;Forma SeriesⅡ型細(xì)胞培養(yǎng)箱，為Thermo公司產(chǎn)品;超凈工作臺(tái)，為北京昌平長(zhǎng)城空氣凈化設(shè)備工程公司產(chǎn)品;蛋白電泳儀與電轉(zhuǎn)儀，為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 艾洛替尼誘導(dǎo)的SKOV3/Erl耐藥細(xì)胞系的建立

人漿液性卵巢癌細(xì)胞系SKOV3由本實(shí)驗(yàn)室保存培養(yǎng)，高糖DMEM完全培養(yǎng)基中含10%胎牛血清及青霉素100 kU·L－1和鏈霉素100 kU·L－1置于37℃恒溫孵箱培養(yǎng)，CO2濃度保持在5% 。采用程國(guó)鈞[8－9]等介紹的逐步遞增聯(lián)合大劑量沖擊法誘導(dǎo)細(xì)胞。具體方法為:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞，從 Erl 1 μmol·L－1開始處理，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定后逐步增加Erl的濃度，反復(fù)換液傳代，Erl依次為2，4，8，16 和 25 μmol·L－1，最 終 維 持 濃 度 為10 μmol·L－1，前期誘導(dǎo)歷經(jīng)10個(gè)月，傳代20次以上，耐藥性能夠穩(wěn)定維持在2～3倍。

1.3 磺酰羅丹明B染色法檢測(cè)SKOV3/Erl細(xì)胞的耐藥倍數(shù)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3和SKOV3/Erl細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液加入96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為5000個(gè)，培養(yǎng)24 h后，分別加入終濃度為0，0.78，1.56，3.13，6.25，12.5，25 和 50 μmol·L－1的Erl，繼續(xù)培養(yǎng)72 h檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的殺傷作用。紫杉醇、米托蒽醌、表柔比星、拓?fù)涮婵?、長(zhǎng)春新堿和甲氨蝶呤終濃度為0，0.2，0.8，3.1，12.5，50，200 和 800 nmol·L－1;順鉑、5-氟尿嘧啶終濃度為0，0.2，0.8，3.1，12.5，50，200和800 μmo·lL－1。檢測(cè)時(shí)使用SRB染色法[10]，步驟如下:用真空泵吸出96孔板中每孔的培養(yǎng)基，每孔加入質(zhì)量濃度為0.4%的 SRB 染液(含 1%醋酸)，體積為 70 μl，室溫染色30 min后，吸出染液，每孔加入1%醋酸溶液洗 3次，晾干，每孔加入 200 μl Tris溶液10 μmmol·L－1，使結(jié)晶充分溶解并振蕩后，使用酶標(biāo)儀，檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm的吸光度(absorbance，A)[11]，GraphPad Prism 5.0 分析軟件給出細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)，SKOV3/Erl細(xì)胞的耐藥倍數(shù)為SKOV3/Erl細(xì)胞IC50與SKOV3細(xì)胞IC50的比值。

1.4 流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞周期

收集SKOV3及SKOV3/Erl細(xì)胞各2×106個(gè)，PBS洗1次后，分別用1 ml冰乙醇在－20℃固定36 h后，100×g離心5 min，去盡上清，PBS 洗1次后，加入濃度為 1 g·L－1RNase 各 100 μl，37℃消化30 min。加入100 μl碘化丙啶于室溫避光染色20 min。使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行周期檢測(cè)，Cell Quest軟件分析細(xì)胞周期分析，重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.5 Western印跡法檢測(cè)SKOV3/Erl細(xì)胞信號(hào)通路蛋白表達(dá)

在六孔板中種植SKOV3及SKOV3/Erl細(xì)胞，每孔1×106個(gè)，37℃培養(yǎng)24 h后，分別加入Erl 2和10 μmol·L－1，20 min 后用真空泵抽取培養(yǎng)液，PBS清洗1次后，立即加入冷的細(xì)胞裂解液，每孔150 μl，冰上裂解10 min，置入低溫高速離心機(jī)中離心10 min，轉(zhuǎn)速為13800×g，吸取上清，按照BCA蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白定量，電泳中每份樣品上樣量為30 μg。進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶室溫封閉1 h后，用5%BSA稀釋的一抗孵育PVDF膜，保持4℃低溫過夜。用TBST洗膜3次后，加入二抗室溫孵育1 h，多次洗膜后，使用ECL系統(tǒng)在X線膠片上顯影。使用Gelpro32分析軟件對(duì)全部條帶進(jìn)行灰度掃描，以GAPDH為內(nèi)參，分析不同信號(hào)蛋白的表達(dá)，除內(nèi)參GAPDH以外的條帶積分吸光度值分別與對(duì)應(yīng)樣品的內(nèi)參積分吸光度值做比值進(jìn)行同一化，最后統(tǒng)計(jì)磷酸化條帶與非磷酸化條帶的比值。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SKOV3及SKOV3/Erl細(xì)胞膜表面轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)

收集SKOV3及SKOV3/Erl細(xì)胞，每管1×106個(gè)，每份樣品加入熒光標(biāo)記的抗體各10 μl，另預(yù)留一管細(xì)胞作為裸細(xì)胞對(duì)照;在室溫避光孵育20 min后，使用FACS洗液清洗細(xì)胞3次，加入1%多聚甲醛對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，準(zhǔn)備上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞測(cè)試。P糖蛋白(P-glycoprotein，Pgp)與乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)的檢測(cè)使用FL-2通道，多藥耐藥相關(guān)蛋白1(multidrug resistance-related protein 1，MRP1)的檢測(cè)使用FL-1通道，Toll樣受體 4(Toll-like receptor 4，TLR-4)的檢測(cè)使用 FL-2通道。分析軟件為WinMDI 2.8，陽(yáng)性率以軟件統(tǒng)計(jì)分析中的Gate值(%)表示[11]。

1.7 SRB法檢測(cè)脂多糖刺激下藥物對(duì)SKOV3/Erl細(xì)胞生存率的影響

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3及SKOV3/Erl細(xì)胞，計(jì)數(shù)，加入96孔板中，每孔5×103個(gè)，培養(yǎng)24 h后，刺激組加入脂多糖20 mg·L－1，無刺激組加入相同體積的培養(yǎng)基，再過2 h后每組加入紫杉醇濃度分別為8 nmol·L－1和1 μmol·L－1，另以無藥物組作為對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)72 h，進(jìn)行SRB染色法處理及吸光度檢測(cè)，方法同1.3。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SKOV3/Erl細(xì)胞的耐藥性

圖1結(jié)果表明，Erl對(duì)SKOV3的IC50為(9.54±1.04)μmol·L－1，對(duì) SKOV3/Erl細(xì)胞的 IC50上升至(21.63±1.05)μmol·L－1，耐藥倍數(shù)約為 2.26。由表1可見，SKOV3/Erl對(duì)8種化療藥都產(chǎn)生了一定程度的交叉耐藥，其中以Pgp底物的紫杉醇的耐受性最強(qiáng)，IC50由對(duì) SKOV3(2.85±1.30)nmol·L－1上升至(17.15±1.36)nmol·L－1，耐藥倍數(shù)約為 6.01。長(zhǎng)春新堿、米托蒽醌、甲氨蝶呤均為BCRP底物，耐藥倍數(shù)達(dá)到3以上，甲氨蝶呤的耐藥倍數(shù)更高達(dá)5.23。

Fig.1 Effect of erlotinib(Erl)on SKOV3 and SKOV3/Erl cell survival.Cells were treated with graded concentration of Erl 0，0.78，1.56，3.13，6.25，12.5，25 and 50 μmol·L －1，and then incubated for 72 h.The IC50was determined by SRB assay.

Tab.1 Resistance factor(RF)of SKOV3/Erl cells to different anticancer drugs

2.2 SKOV3/Erl細(xì)胞的細(xì)胞周期

流式細(xì)胞同期檢測(cè)結(jié)果(圖2)顯示，SKOV3/Erl細(xì)胞的(G0+G1)期細(xì)胞比例有所上升，為(52.36±1.20)%，SKOV3 細(xì) 胞 僅 為(45.08±0.90)%;SKOV3/Erl細(xì)胞 S期比例有所下降，為(35.92±1.97)%，SKOV3 細(xì)胞為(42.32±0.69)%;而SKOV3與SKOV3/Erl細(xì)胞在G2/M期無顯著差異，比例分別為(12.60±0.27)%和(11.72±0.81)%。SKOV3/Erl細(xì)胞中G0/G1期比例增加，與S期比例下降表明更多的細(xì)胞進(jìn)入靜止期，而DNA合成減緩，在一定程度上降低了對(duì)細(xì)胞毒類化療藥的敏感度。

Fig.2 Representative results of cell cycle of SKOV3(A)and SKOV3/Erl(B)cells by flow cytometry.

2.3 SKOV3/Erl細(xì)胞中EGFR相關(guān)蛋白的表達(dá)

如圖3所示，隨Erl濃度增加，SKOV3細(xì)胞中p-HER1略有下調(diào)，SKOV3/Erl細(xì)胞p-HER1水平顯著高于SKOV3(P＜0.01)，加入 Erl后并不下降。SKOV3/Erl細(xì)胞中活化形式的p-ERK平顯著上調(diào)(P＜0.01)，但加入 Erl 2 μmol·L－1后，活化程度微弱下降但仍高于相應(yīng)處理的SKOV3細(xì)胞，當(dāng)Erl 10 μmo·lL－1時(shí)，不再高于SKOV3。AKT在SKOV3/Erl中的活化程度顯著減弱(P＜0.01)，加入Erl后活化程度Erl增加，即隨Erl濃度升高而上調(diào)，與相應(yīng)處理SKOV3細(xì)胞。盡管在SKOV3/Erl中HER2的活化程度顯著升高(P＜0.01)，但在Erl 2和10 μmo·lL－1刺激下，pHER2水平均低于相應(yīng)處理組的SKOV3細(xì)胞。

2.4 SKOV3/Erl細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)

如圖4所示，Pgp在SKOV3/Erl細(xì)胞中的表達(dá)率為(3.56±0.24)%，而在 SKOV3 細(xì)胞中為(1.07±0.11)%(P＜0.01);BCRP 在 SKOV3/Erl細(xì)胞中的表達(dá)率為(7.60±0.98)%，而在SKOV3細(xì)胞中為(3.97±0.54)%(P＜0.01);而在 SKOV3/Erl細(xì)胞中MRP1的表達(dá)率為(2.43±0.36)%，而在SKOV3的細(xì)胞中為(1.63±0.21)%。Pgp，BCRP 和MRP1在SKOV3/Erl細(xì)胞中都有微量的上升，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，但表達(dá)率均在10%以內(nèi)。

Fig.3 Protein expression in SKOV3 cell SKOV3/Erl treated with Erl by Western blotting.B was the semiquantitative result of A.The cells were treated with Erl 2 and 10 μmol·L －1for 20 min，respectively.Lanes 1，2 and 3:SKOV3 cell treated with Erl 0，2 and 10 μmo·lL－1groups，respectively;lanes 4，5 and 6:SKOV3/Erl cell treated with Erl 0，2 and 10 μmol·L－1groups，respectively.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with SKOV3 group.

Fig.4 Representative result of protein expression level of surface P-glycoprotein(Pgp)(A)，breast cancer resistance protein(BCRP)(B)and multidrug resistance-associated protein 1(MRP1)(C)in SKOV3 and SKOV3/Erl cells.

2.5 SKOV3/Erl細(xì)胞TLR4蛋白的表達(dá)

如圖5所示，SKOV3/Erl細(xì)胞不但表現(xiàn)出一定的耐藥性，還伴隨著細(xì)胞表面TLR4蛋白的表達(dá)量顯著上升，其表達(dá)率由在SKOV3細(xì)胞中的(18.43±5.61)%顯著提高至在 SKOV3/Erl細(xì)胞中的(92.68±2.19)%(P＜0.01)。

Fig.5 Toll-like receptor 4 expression level on SKOV3 and SKOV3/Erl cells determined by flow cytometry.

2.6 脂多糖刺激對(duì)SKOV3/Erl細(xì)胞存活的影響

如表2所示，脂多糖的刺激可顯著提高SKOV3/Erl細(xì)胞存活數(shù)，SKOV3/Erl細(xì)胞增殖程度甚至可達(dá)到空白對(duì)照組的2倍左右，而脂多糖對(duì)SKOV3則影響微弱。紫杉醇 8 nmol·L－1組中，SKOV3/Erl細(xì)胞仍保持較高的存活率，與SKOV3細(xì)胞相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);而在脂多糖刺激下，SKOV3/Erl的存活數(shù)顯著高于SKOV3細(xì)胞(P＜0.01)。紫杉醇1 μmol·L－1作用下和脂多糖刺激時(shí)，SKOV3/Erl細(xì)胞存活數(shù)顯著高于SKOV3細(xì)胞(P＜0.01)，而無脂多糖刺激時(shí)，兩種細(xì)胞無顯著差異。

Tab.2 Effect of lipopolysaccharide(LPS)on SKOV3/Erl cell survival

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過持續(xù)性藥物刺激誘導(dǎo)而成的SKOV3/Erl細(xì)胞，耐藥倍數(shù)可達(dá)2.26倍，對(duì)紫杉醇和順鉑為代表的常用卵巢癌化療藥物表現(xiàn)出多藥耐藥的特點(diǎn)，提示未來使用Erl治療卵巢癌的患者，如出現(xiàn)Erl耐藥現(xiàn)象，使用多種抗腫瘤藥物的化療方案可能表現(xiàn)出療效達(dá)不到預(yù)期的狀況。在細(xì)胞周期的檢測(cè)中，耐藥細(xì)胞表現(xiàn)為G0/G1期的上升，以及S期的下降，這表明耐藥細(xì)胞相對(duì)較多地進(jìn)入了靜止期，DNA合成有所下降，這似乎與腫瘤干細(xì)胞特征十分相似，增殖速度慢，造成化療藥物殺傷的選擇性下降，致使療效降低。Erl的長(zhǎng)期刺激下，細(xì)胞中EGFR的磷酸化活性反而有所上升。藥物干預(yù)條件下EGFR并未出現(xiàn)明顯抑制，耐藥細(xì)胞中的EGFR保持了較強(qiáng)的激酶活性，其下游信號(hào)中，活化的ERK維持了較高水平，而AKT信號(hào)則對(duì)ERK不敏感。由于HER1可以通過同源二聚化以及與HER2的異源二聚化兩種方式傳遞信號(hào)，因此，HER2的磷酸化水平也值得關(guān)注的。從結(jié)果來看，SKOV3/Erl細(xì)胞HER2的磷酸化水平有上調(diào)，但對(duì)Erl的抑制作用仍然十分敏感，推測(cè)HER1/HER2的異源二聚化程度對(duì)細(xì)胞的藥物耐受并無貢獻(xiàn)。綜上所述，在體外條件下，EGFR仍然是SKOV3/Erl細(xì)胞增殖和存活的重要途徑。在非小細(xì)胞肺癌的研究中，有文獻(xiàn)報(bào)道，EGFR的T790M突變是導(dǎo)致TKI藥物治療過程出現(xiàn)耐藥的重要原因之一[12]，而本研究中誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞SKOV3/Erl并不存在激酶區(qū)的任何突變，因此，SKOV3細(xì)胞系出現(xiàn)的Erl耐藥機(jī)制與非小細(xì)胞肺癌有很大差別。EGFR活性保持與其他受體酪氨酸激酶的關(guān)系需要進(jìn)一步觀察。

文獻(xiàn)[13－15]報(bào)道，與多藥耐藥有關(guān)的重要的3個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白會(huì)引起多種藥物在細(xì)胞內(nèi)的積累下降，特別是BCRP和Pgp對(duì)Erl具有外排功能，可能是導(dǎo)致其療效下降的直接原因。然而實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示，耐藥細(xì)胞中Pgp，BCRP以及MRP1表達(dá)僅有微弱提高，總體陽(yáng)性率都保持在10%以下，可認(rèn)為是低水平表達(dá)，難以對(duì)藥物的外排起到重要作用。

TLR4是最近幾年上皮性腫瘤標(biāo)志物研究中的新熱點(diǎn)，由其在卵巢癌的增殖和耐藥方面起到重要作用。最近幾年的研究發(fā)現(xiàn)多種上皮腫瘤細(xì)胞也有TLR4高表達(dá)，并且與腫瘤的增殖能力和化療耐藥相關(guān)[16－18]。甚至有報(bào)道稱TLR4信號(hào)的激活是上皮性卵巢癌干細(xì)胞的特征。在本研究中所建立的SKOV3耐藥細(xì)胞模型中，TLR4的陽(yáng)性率顯著地上升，同時(shí)脂多糖刺激實(shí)驗(yàn)也證實(shí)TLR4激活大大促進(jìn)耐藥細(xì)胞SKOV3/Erl增殖，并在相對(duì)低濃度紫杉醇的殺傷下保持較高的存活率，而相對(duì)低表達(dá)TLR4的SKOV3細(xì)胞則對(duì)紫杉醇十分敏感。推測(cè)由于紫杉醇自身具有激活TLR4信號(hào)的功能，TLR4下游的NF-κB入核增多，PI3K/AKT路徑的活化信號(hào)上調(diào)所致[18]，推測(cè)Erl在一定程度上降低腫瘤對(duì)紫杉醇的敏感度。TLR4上調(diào)的原因尚未得到證實(shí)，而臨床上TLR4上調(diào)對(duì)EGFR小分子抑制劑靶向治療的指示作用，也有待于根據(jù)臨床做進(jìn)一步驗(yàn)證與探究。

總之，SKOV3/Erl表現(xiàn)出的耐藥特點(diǎn)與已報(bào)道的非小細(xì)胞肺癌大不相同，初步分析TLR4的表達(dá)上調(diào)是其藥物耐受能力提高的重要原因之一。此外，目前國(guó)內(nèi)卵巢癌的靶向治療研究剛剛處在起步階段，SKOV3/Erl細(xì)胞模型的建立為卵巢癌靶向治療的耐受研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)和新的思路。

[1]Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2012[J].CA Cancer J Clin，2012，62(1):10-29.

[2]Mezzanzanica D， Bagnoli M， De Cecco L， Valeri B，Canevari S.Role of microRNAs in ovarian cancer pathogenesis and potential clinical implications[J].Int J Biochem Cell Biol，2010，42(8):1262-1272.

[3]Mendelsohn J，Baselga J.Epidermal growth factor receptor targeting in cancer[J].Semin Oncol，2006，33(4):369-385.

[4]Erlotinib or Observation in Treating Patients Who Have Undergone First-Line Chemotherapy for Ovarian Cancer，Peritoneal Cancer，or Fallopian Tube Cancer[DB/OL].(2011-04-23)[2012-09-04]http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00263822.

[5]Gordon AN，F(xiàn)inkler N，Edwards RP，Garcia AA，Crozier M，Irwin DH，et al.Efficacy and safety of erlotinib HCl，an epidermal growth factor receptor(HER1/EGFR)tyrosine kinase inhibitor，in patients with advanced ovarian carcinoma:results from a phaseⅡ multicenter study[J].Int J Gynecol Cancer，2005，15(5):785-792.

[6]Blank SV，Christos P，Curtin JP，Goldman N，Runowicz CD，Sparano JA，et al.Erlotinib added to carboplatin and paclitaxel as first-line treatment of ovarian cancer:a phaseⅡstudy based on surgical reassessment[J].Gynecol Oncol，2010，119(3):451-456.

[7]Murphy M，Stordal B.Erlotinib or gefitinib for the treatment of relapsed platinum pretreated non-small cell lung cancer and ovarian cancer:a systematic review[J].Drug Resist Updat，2011，14(3):177-190.

[8]Xu QY，Chen YH，Zhao LJ，Li XP，Wang JL，Wei LH.Establishmentofcisplatin-resistanthuman endometrial cancer cell line and the study of its resistant mechanisms[J].Chin J Obstet Gynecol(中華婦產(chǎn)科雜志)，2011，46(7):533-537.

[9]Chen GJ，Li YL，Tian F，Zhu H，Sun LY，Li CH，et al.Comparison of stepwise and pulse induced cisplatin-resistant ovarian cancer cell sublines[J].Chin J Oncol(中華腫瘤雜志)，2001，23(4):305-308.

[10]Peng H， Qi J， Dong Z， Zhang JT.Dynamic vs static ABCG2 inhibitors to sensitize drug resistant cancer cells[J].PLoS One，2010，5(12):e15276.

[11]Ye WL， Lin Z， Lang XL， Qiao CX，Li XY，Wang LY，et al.Effects of cetuximab against human hepatocellular carcinoma cells HepG2 in vitro[J].Mil Med Sci(軍事醫(yī)學(xué))，2011，35(3):202-206.

[12]Costa DB，Schumer ST，Tenen DG，Kobayashi S.Differential responses to erlotinib in epidermal growth factor receptor(EGFR)-mutated lung cancers with acquired resistance to gefitinib carrying the L747S or T790M secondary mutations[J].J Clin Oncol，2008，26(7):1182-1184.

[13]Lopez JP，Wang-Rodriguez J，Chang C，Chen JS，Pardo FS，Aguilera J，et al.Gefitinib inhibition of drug resistance to doxorubicin by inactivating ABCG2 in thyroid cancer cell lines[J].Arch Otolaryngol Head Neck Surg，2007，133(10):1022-1027.

[14]Lemos C，Kathmann I，Giovannetti E，Calhau C，Jansen G，Peters GJ.Impact of cellular folate status and epidermal growth factor receptor expression on BCRP/ABCG2-medi-ated resistance to gefitinib and erlotinib[J].Br J Cancer，2009，100(7):1120-1127.

[15]Shi Z，Peng XX，Kim IW，Shukla S，Si QS，Robey RW，et al.Erlotinib(Tarceva，OSI-774)antagonizes ATP-binding cassette subfamily B member 1 and ATP-binding cassette subfamily G member 2-mediated drug resistance[J].Cancer Res，2007，67(22):11012-11020.

[16]Szajnik M，Szczepanski MJ，Czystowska M，Elishaev E，Mandapathil M，Nowak-Markwitz E，et al.TLR4 signaling induced by lipopolysaccharide or paclitaxel regulates tumor survival and chemoresistance in ovarian cancer[J].Oncogene，2009，28(49):4353-4363.

[17]Hsu RY，Chan CH，Spicer JD，Rousseau MC，Giannias B，Rousseau S，et al.LPS-induced TLR4 signaling in human colorectal cancer cells increases beta1 integrin-mediated cell adhesion and liver metastasis[J].Cancer Res，2011，71(5):1989-1998.

[18]Wang AC，Su QB，Wu FX，Zhang XL，Liu PS.Role of TLR4 for paclitaxel chemotherapy in human epithelial ovarian cancer cells[J].Eur J Clin Invest，2009，39(2):157-164.