蛇床子素通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體α調(diào)節(jié)肝細胞內(nèi)脂肪酸代謝

沈 洪，周 峰，薛 潔，謝梅林

(1.湖州師范學院醫(yī)學院藥理學教研室，浙江湖州 313000;2.蘇州市第五人民醫(yī)院藥劑科，江蘇蘇州 215006，3.蘇州大學藥學院藥理學系，江蘇蘇州 215123)

血液中的游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)在脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白(fatty acid transporter protein，F(xiàn)ATP)和肝脂肪酸結(jié)合蛋白(liver fatty acid binding protein，L－FABP)作用下可被肝細胞攝取和轉(zhuǎn)運。肝細胞也可以乙酰輔酶A為原料，在脂肪酸合酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)作用下合成脂肪酸(fatty acid，F(xiàn)A)，合成的FA又可在二脂酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(diacylglycerol acyltransferase，DGAT)作用下進一步合成甘油三酯(triglycerides，TG);肝中的FA也可在肉堿軟脂酰轉(zhuǎn)移酶－1a(carnitine palmitoyltransferase－1a，CPT－1a)作用下促使 FA進行β氧化，使用于TG合成的FA減少。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferatoractivated receptor，PPAR)α可以調(diào)控參與FA代謝的這些酶和轉(zhuǎn)運體[1－5]，而且 PPARα 也可通過調(diào)節(jié)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element－binding protein，SREBP)，包括 SREBP－1和 SREBP－2 而抑制 FAS 的表達[6－7]。

蛇床子素(osthole)是一種香豆素類化合物，其化學名稱為7－甲氧基－8－異戊烯基香豆素，廣泛存在于傘形科植物蛇床子和獨活等植物中。本課題組首先發(fā)現(xiàn)蛇床子素具有調(diào)節(jié)血脂和肝脂、明顯減輕動物脂肪肝程度的作用[8－10]，進一步的研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素可明顯增加肝組織中PPARα/γ mRNA和蛋白的表達[11]，提示蛇床子素可能通過激活肝細胞中PPARα而調(diào)節(jié)細胞中的TG和FA含量。為此本文利用PPARα選擇性抑制劑，對PPARα介導的與FA代謝相關的上述這些基因的表達進行研究，以確定蛇床子素是否通過激活PPARα而發(fā)揮調(diào)節(jié)FA代謝的作用，為其將來的臨床應用提供可靠的藥理學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

蛇床子素，白色粉末，純度＞98%，由西安綠泉生物技術有限公司提供。MK886，為PPARα選擇性抑制劑[12]，購自Cayman化學公司，純度＞99%。TG測定試劑盒，購自浙江伊利康生物技術有限公司。FFA和考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。Trizol，購自Invitrogen公司。M－MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(2 ×108U·L－1)，Taq 聚合酶(3 ×106U·L－1)，dNTP(10 mmol·L－1)和DNA 100 bp marker，均購自Fermentas公司。瓊脂糖購自 Biowest公司。RPMI 1640培養(yǎng)基和小牛血清，購自Gibco公司。本文所用引物均由上海生物工程科技有限公司合成，PPARα，SREBP－1/2，F(xiàn)AS，DGAT，CPT－1a，F(xiàn)ATP4和L－FABP引物序列見表1。其余試劑均為分析純。

1.2 細胞株

BRL大鼠肝細胞，由中科院上海細胞所提供。

1.3 主要儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱(Heraeus公司)，高速冷凍離心機(德國 Eppendorf公司)，PCR儀(美國Bio－Rad公司)，DYY－8B 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和DYY－Ⅲ31D型電泳槽(北京市六一儀器廠)，GELMate 2000型電泳系統(tǒng)(Toyobo Biotech公司)，數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)(GIS2008H，上海天能科技有限公司)，722N型可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)。

1.4 細胞分組處理

BRL大鼠肝細胞采用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，將細胞數(shù)調(diào)整為1×106ml－1后接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔加2.0 ml細胞懸液，待細胞貼壁融洽后分為7組，即溶媒(0.1%DMSO)對照組，蛇床子素 12.5，25，50 和 100 μmol·L－1組，MK8861 μmol·L－1組，MK8861 μmol·L－1+蛇床子素 100 μmol·L－1組。MK886+ 蛇床子素組細胞先用 MK8861 μmol·L－1預處理2 h 后，再加入蛇床子素，在蛇床子素作用于細胞24 h后，按下述方法檢測相應的指標。

1.5 比色法檢測肝細胞內(nèi)TG和FFA含量

收獲細胞后，用PBS重復洗3次，加入PBS 500 μl后放入－80℃冰箱反復凍融3次，然后按照試劑盒說明書上提供的比色法進行測定細胞內(nèi)TG和FFA的含量。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄 PCR 法檢測 PPARα，SREBP－1/2，F(xiàn)AS，DGAT，CPT－1a，F(xiàn)ATP4 和 L－FABP mRNA表達

收獲細胞后，按照試劑盒說明書上提供的方法提取總RNA，取2 μg用于逆轉(zhuǎn)錄至cDNA，按下列條件進行 PCR擴增:95℃變性5 min，繼之95℃30 s、退火(退火溫度見表1)30～45 s，72℃延伸40 s，共擴增30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。反應結(jié)束后用2%瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物，凝膠掃描圖像采用Band Leader軟件分析，計算與內(nèi)參GAPDH的積分吸光度(integrated absorbance，IA)的比值。

Tab.1 Primers used in RT－PCR analysis

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 蛇床子素對肝細胞內(nèi)TG和FFA含量的影響

與溶媒對照組相比較，在給予蛇床子素12.5～100 μmo·lL－1作用24 h后，肝細胞內(nèi)的TG和FFA水平隨著蛇床子素濃度的增加均逐步降低(P＜0.01)。如預先用 PPARα 抑制劑 MK8861 μmol·L－1處理 2 h 后，蛇床子素 100 μmol·L－1降低肝細胞內(nèi)TG和FFA的作用則被明顯減弱(P＜0.01)。單用MK8861 μmol·L－1處理的肝細胞內(nèi) TG 和 FFA 水平反較溶媒對照組升高 (P＜0.05，P＜0.01)(表2)。

Tab.2 Effect of osthole on triglycerides(TG)and free fatty acid(FFA)contents in cultured rat hepatocytes

2.2 蛇床子素對PPARα mRNA表達的影響

結(jié)果如圖1顯示，與溶媒對照組相比較，在給予蛇床子素2.5～100 μmol·L－1作用 24 h 后，可見肝細胞內(nèi)的PPARα mRNA表達水平隨著蛇床子素濃度的增加逐步增多(P＜0.01)，并呈明顯的劑量依賴趨勢(r=0.95，P＜0.05)。

Fig.1 Effect of osthole on PPARα mRNA expression in cultured rat hepatocytes.The cultured rat hepatocytes were treated with osthole for 24 h.The PPARα mRNA expression in hepatocytes was then determined by reverse transcription polymerase chain reaction.Lane 1:vehicle control;lane 2:osthole 12.5 μmol·L －1;lane 3:osthole 25 μmol·L －1;lane 4:osthole 50 μmo·lL－1;lane 5:osthole 100 μmol·L－1;M:marker.±s，n=4.＊＊P＜0.01，compared with vehicle control group.

2.3 蛇床子素對 MK886預處理的肝細胞中SREBP－1/2，F(xiàn)AS， DGAT，CPT－1a， FATP4 和L－FABP mRNA表達的影響

如圖2～圖4顯示，與溶媒對照組相比較，肝細胞給予蛇床子素 100 μmol·L－1作用 24 h 后，其中的SREBP－1/2，F(xiàn)AS和DGAT mRNA的表達明顯降低(P＜0.01)，而 CPT－1a，F(xiàn)ATP4 和 L－FABP mRNA的表達明顯增加(P＜0.01)。若預先用PPARα 抑制劑 MK8861 μmol·L－1預處理 2 h 后，蛇床子素抑制SREBP－1/2，F(xiàn)AS和DGAT mRNA表達的作用則明顯減弱或完全消失(P＜0.01)，蛇床子素增加 CPT－1a，F(xiàn)ATP4 和 L－FABP mRNA 表達的作用也明顯減弱或完全消失(P＜0.01)。MK886本身對FAS和DGAT mRNA表達有促進作用(P＜0.01)，而對 FATP4 和 L－FABP mRNA表達有抑制作用(P＜0.05或P＜0.01)。

Fig.2 Effect of osthole on mRNA expressions of sterol regulatory element－binding protein－1/2(SREBP－1/2)in cultured rat hepatocytes pretreated with MK886.The hepatocytes were pretreated with MK886 for 2 h，osthole was then added and incubated with cells for 24 h.B was the semiquantitative result of A.Lane 1:vehicle control;lane 2:osthole 100 μmol·L －1;lane 3:MK8861 μmo·lL－1;lane 4:MK8861 μmol·L－1+osthole 100 μmol·L－1;M:marker.±s，n=4.＊＊P＜0.01，compared with vehicle control group;##P＜0.01，compared with osthole 100 μmo·lL－1group.

Fig.3 Effect of osthole on mRNA expressions of fatty acid synthase(FAS)，diacylglycerol acyltransferase(DGAT)，and carnitine palmitoyltransferase(CPT)－1a in cultured rat hepatocytes pretreated with MK886.See Fig.2 for the treatments.B was the semiquantitative result of A.Lane 1:vehicle control;lane 2:osthole 100 μmol·L －1;lane 3:MK8861 μmol·L －1;lane 4:MK8861 μmol·L －1+osthole 100 μmol·L －1;M:marker.±s，n=4.＊＊P＜0.01，compared with vehicle control group;##P＜0.01，compared with osthole 100 μmol·L －1group.

Fig.4 Effect of osthole on mRNA expressions of fatty acid transporter protein(FATP)4 and liver fatty acid binding protein(L－FABP)in cultured rat hepatocytes pretreated with MK886.See Fig.2 for the treatments.B was the semiquantitative result of A.Lane 1:vehicle control;lane 2:osthole 100 μmol·L －1;lane 3:MK8861 μmol·L －1;lane 4:MK8861 μmol·L －1+osthole 100 μmol·L －1;M:marker.±s，n=4.*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with vehicle control group;##P＜0.01，compared with osthole 100 μmol·L －1group.

3 討論

脂肪肝的主要病理特征是大量的TG在肝細胞內(nèi)蓄積，但蓄積的TG對肝一般不會產(chǎn)生嚴重的毒性作用，反而由于TG的合成增加可降低肝內(nèi)FA的蓄積而減少FA氧化所產(chǎn)生的活性氧自由基，從而可防止脂肪肝損傷的進一步發(fā)展[13－14]，因此有學者認為FA在脂肪肝的發(fā)生和發(fā)展中起著極其重要的作用[15]。眾所周知，肝中的PPARα主要參與調(diào)節(jié)肝臟的脂質(zhì)代謝平衡[16]。作者先前的研究業(yè)已證明，蛇床子素可降低高脂飼養(yǎng)動物血及肝中的TG 和 FFA 含量[8－9，17]，同時也可增加肝組織中的PPARα 表達[11]，但蛇床子素 是 否通過作用于PPARα后介導相關靶基因而降低肝中的TG和FFA含量，仍尚不清楚。

本研究在體外培養(yǎng)的大鼠肝細胞上，發(fā)現(xiàn)蛇床子素可劑量依賴性地降低肝細胞中的TG和FFA含量，同時也能增加肝細胞中的PPARα mRNA表達。這一結(jié)果完全與動物體內(nèi)的結(jié)果相一致[11]。為了進一步確定蛇床子素降低肝細胞內(nèi)TG和FFA與激活PPARα的關系，我們觀察了在用PPARα選擇性抑制劑 MK886預處理情況下，蛇床子素對PPARα介導的相關靶基因的影響。結(jié)果表明，蛇床子素抑制SREBP－1/2、FAS和DGAT的mRNA表達的作用明顯降低或完全消失，同樣地，蛇床子素增加 CPT－1a、FATP4 和 L－FABP 的 mRNA 表達的作用也明顯減弱或完全消失。這些結(jié)果提示蛇床子素降低肝中的 TG和 FFA含量，一方面與激活PPARα后抑制 SREBP－1/2及下游基因 FAS和DGAT表達作用有關，從而降低FA和TG的合成;另一方面也與激活PPARα后增加CPT－1a、FATP4和L－FABP表達作用后增強對FA的利用有關，從而使肝細胞中的FA和TG水平降低。

總之，蛇床子素降低肝中TG和FFA含量，主要可能與通過激活PPARα后隨后抑制肝中FAS的表達而減少FA的合成，以及增加CPT－1a和抑制DGAT的表達后增強對FA的氧化利用有關。

[1]Kwon HJ，Hyum SH，Choung SY.Traditional Chinese Medicine improves dysfunction of peroxisome proliferatoractivated receptor alpha and microsomal triglyceride transfer protein on abnormalities in lipid metabolism in ethanolfed rats[J].Biofactors，2005，23(3):163－176.

[2]Ringseis R，Muschick A，Eder K.Dietary oxidized fat prevents ethanol－induced triacylglycerol accumulation and increases expression of PPARalpha target genes in rat liver[J].J Nutr，2007，137(1):77－83.

[3]Sun F， Xie ML， Xue J， Wang HB.Osthole regulates hepatic PPAR alpha－mediated lipogenic gene expression in alcoholic fatty liver murine[J].Phytomedicine，2010，17(8－9):669－673.

[4]Yong EL，Li J，Liu MH.Single gene contributions:genetic variants of peroxisome proliferator－activated receptor(isoforms alpha，beta/delta and gamma)and mechanisms of dyslipidemias[J].Curr Opin Lipidol，2008，19(2):106－112.

[5]Motojima K，Passilly P，Peters JM，Gonzalez FJ，Latruffe N.Expression of putative fatty acid transporter genes are regulated by peroxisome proliferator－activated receptor alpha and gamma activators in a tissue－ and inducer－specific manner[J].J Biol Chem，1998，273(27):16710－16714.

[6]K?nig B，Koch A，Spielmann J，Hilgenfeld C，Hirche F，Stangl GI，et al.Activation of PPARalpha and PPARgamma reduces triacylglycerol synthesis in rat hepatoma cells by reduction of nuclear SREBP－1[J].Eur J Pharmacol，2009，605(1－3):23－30.

[7]Knight BL，Hebbachi A，Hauton D，Brown AM，Wiggins D，Patel DD，et al.A role for PPARalpha in the control of SREBP activity and lipid synthesis in the liver[J].Biochem J，2005，389(Pt 2):413－421.

[8]Song F，Xie ML，Zhu LJ，Zhang KP，Xue J，Gu ZL.Experimental study of osthole on treatment of hyperlipidemic and alcoholic fatty liver in animals[J].World J Gastroenterol，2006，12(27):4359－4363.

[9]Zhang Y，Xie ML，Zhu LJ，Gu ZL.Therapeutic effect of osthole on hyperlipidemic fatty liver in rats[J].Acta Pharmacol Sin，2007，28(3):398－403.

[10]Sun F，Xie ML，Zhu LJ，Xue J，Gu ZL.Inhibitory effect of osthole on alcohol－induced fatty liver in mice[J].Dig Liver Dis，2009，41(2):127－133.

[11]Zhang Y，Xie ML，Xue J，Gu ZL.Osthole improves fat milk－induced fatty liver in rats:modulation of hepatic PPAR－alpha/gamma－mediated lipogenic gene expression[J].Planta Med，2007，73(8):718－724.

[12]Kehrer JP，Biswal SS，La E，Thuillier P，Datta K，F(xiàn)ischer SM，et al.Inhibition of peroxisome－proliferator－activated receptor(PPAR)alpha by MK886[J].Biochem J，2001，356(Pt 3):899－906.

[13]Yamaguchi K， Yang L， McCall S， Huang J， Yu XX，Pandey SK，et al.Inhibiting triglyceride synthesis improves hepatic steatosis but exacerbates liver damage and fibrosis in obese mice with nonalcoholic steatohepatitis[J].Hepatology，2007，45(6):1366－1374.

[14]Listenberger LL，Han X，Lewis SE，Cases S，F(xiàn)arese RV，Ory DS，et al.Triglyceride accumulation protects against fatty acid－induced lipotoxicity[J].Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(6):3077－3082.

[15]Verna EC，Berk PD.Role of fatty acids in the pathogenesis of obesity and fatty liver:impact of bariatric surgery[J].Semin Liver Dis，2008，28(4):407－426.

[16]Reddy JK.Nonalcoholic steatosis and steatohepatitis.Ⅲ.Peroxisomal beta－oxidation，PPAR alpha，and steatohepatitis[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2001，281(6):G1333－G1339.

[17]Du R，Xue J，Wang HB，Zhang Y，Xie ML.Osthol ameliorates fat milk－induced fatty liver in mice by regulation of hepatic sterol regulatory element－binding protein－1c/2－mediated target gene expression[J].Eur J Pharmacol，2011，666(1－3):183－188.