青海地區(qū)結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)與KatG、rpoB及gyrA的突變特征分析

王 芝,馬如存,卓 瑪,常鳳霞,郝 娟,王玉清

(青海省傳染病?？漆t(yī)院檢驗(yàn)科,青海,810000)

近年來,結(jié)核分枝桿菌耐藥率在全球范圍內(nèi)呈逐年上升,使得耐多藥和高耐藥菌株不斷產(chǎn)生和傳播,嚴(yán)重影響了結(jié)核病的化療療效,引起結(jié)核病的廣泛流行[1-2]。青海是西部地區(qū)結(jié)核病疫情較重的省份之一,活動(dòng)性肺結(jié)核患者約2.5萬人,每年新發(fā)傳染性肺結(jié)核約3500例[1]。異煙肼(INH)、利福平(RFP)與氟喹諾酮類藥物是治療結(jié)核分枝桿菌(MTB)的一線藥物,臨床應(yīng)用廣泛,但據(jù)臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)近年來其耐藥情況正逐漸加重[3-5]。因此,對(duì)耐INH、RFP及氟喹諾酮類藥物的結(jié)核分枝桿菌katG、rpoB、gyra基因突變的特點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)分析很有必要。本研究采用PCRDNA測(cè)序法對(duì)我省MTB耐藥分離株進(jìn)行分析,以便了解katG、rpoB、gyrA等基因突變特點(diǎn)。

1 資料和方法

1.1 菌株來源

選取2010年06月—2012年12月在本院住院和門診確診為肺結(jié)核且痰培養(yǎng)陽性患者220例,其中女性63例,男性157例,年齡25～71歲,平均(48.17±19.65)歲。

1.2 方法

按照結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)予以分枝桿菌分離培養(yǎng),采用生物化學(xué)反應(yīng)法進(jìn)行分枝桿菌菌種地鑒定,藥物敏感試驗(yàn)采用微量液體培養(yǎng)基MIC藥敏快速檢測(cè)法。

1.3 MTB的DNA制備

將培養(yǎng)陽性的結(jié)核分枝桿菌菌株用液體培養(yǎng)基重懸,加入玻璃珠在漩渦振蕩器上磨菌5～10 min后靜置10～15 min,取上層懸濁液用液體培養(yǎng)基比濁到1 mg/mL。從L-J培養(yǎng)基斜面上用接種環(huán)進(jìn)行MTB菌落刮取,加入300 L的DNA裂解液中 ,進(jìn)行3h的55℃水浴 ,再予95℃的水滅活5 min,加上等體積(比例為25∶24∶1的酚-氯仿-異戊醇)抽提2次,加50L雙蒸水進(jìn)行溶解,-20℃溫度中保存以備用。

1.4 PCR擴(kuò)增

采用50 L反應(yīng)體系,擴(kuò)增參數(shù):94℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min,退火1 min(退火溫度katG為64℃,gyrA 60℃,rpoB 60℃),72℃延伸1 min,予以 30次循環(huán);然后72℃延伸10 min。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)[6]。

1.5 DNA序列測(cè)定

DNA序列測(cè)定與分析采用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的PCRDNA純化試劑盒提純PVR擴(kuò)增產(chǎn)物,送上海生物工程公司測(cè)序。測(cè)序儀器選用ABI PRISM 3700,測(cè)序試劑選用BigDye terminatorv 3.1,使用DNASTAR與ClustalX 1.81軟件輔助分析。

2 結(jié) 果

2.1 耐藥率及基因突變情況

從220例本院住院和門診確診的肺結(jié)核病人痰液中分離出77例MTB,對(duì)3種藥耐藥情況為:INH耐藥率40.26%(31/77),RFP耐藥率31.17%(24/77),氟喹諾酮類藥物耐藥率為8.57%(22/77),在耐單一藥中以耐INH為首。

耐藥株基因突變情況如下:耐INH菌株中,katG基因突變率為 70.97%;耐 RFP菌株中,rpoB基因突變率為83.33%;耐氟喹諾酮類藥物菌株中,gyra基因突變率為77.27%。見表1。

表1 100例分離MTB耐藥及基因突變情況[n(%)]

2.2 DNA測(cè)序

katG最常見的突變形式為Ser 315 Thr(86.67%);rpoB最常見的突變形式為526、531位氨基酸改變,總突變率為72.73%;氟喹諾酮類藥物突變主要在gyrA基因耐藥決定區(qū)(QRDR)發(fā)生,突變位點(diǎn)主要為94(65.00%)。見表2。

3 討 論

近年來,由于多重耐藥結(jié)核的廣泛存在,對(duì)結(jié)核病的治療產(chǎn)生嚴(yán)重影響,結(jié)核病的臨床控制也變得越來越艱辛和復(fù)雜,早期診斷和快速識(shí)別多重耐藥結(jié)核對(duì)結(jié)核病的傳染控制和治療至關(guān)重要[7]。

表2 基因突變DNA測(cè)序突變特征[n(%)]

本研究結(jié)果中,本院220例MTB臨床分離株對(duì)3種藥的耐藥率分別為INH55.5%(122/220)、RFP35.0%(77/220)、氟喹諾酮類藥物34.5%(76/20),提示青海地區(qū)在耐單一藥中以INH耐藥率較高,說明青海地區(qū)臨床使用INH頻率較高。

3.1 MTB異煙肼耐藥katG基因突變特點(diǎn)

異煙肼作為一線治療結(jié)核病的藥物,其作用機(jī)制較為復(fù)雜,至今尚不明確?，F(xiàn)已闡明:異煙肼主要是由MTB的KatG基因活化為具有殺菌活性的異煙酸、異煙胺而發(fā)揮作用[8]。有報(bào)道在1992年已經(jīng)證實(shí),KatG是MTB中具有活化異煙肼作用的一種酶,繼之又證實(shí)了MTB耐異煙肼與katG基因突變之間的關(guān)系[9-10]。katG由744個(gè)氨基酸殘基所構(gòu)成,全長2223 bp,有研究報(bào)道其常見的突變位點(diǎn)為第315、463位密碼子。

本研究56株耐INH藥株中,katG基因突變率為71.4%;在 315位點(diǎn),AGC※ACC(Ser※Thr)突變 25株(62.5%),ACG※AAC(Ser※Asn)突變6株(15.0%)等,即katG最常見的突變形式為Ser315Thr(62.5%),與上述報(bào)道基本一致。

3.2 MTB利福平耐藥rpoB基因突變特點(diǎn)

利福平是通過與MTB的 RNA聚合酶B亞基(簡稱rpoB)相結(jié)合,對(duì)轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物形成具有抑制作用,從而干擾細(xì)菌轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生殺菌作用[11]。如果 RNA聚合酶81 bp核心區(qū)發(fā)生突變,利福平則無法與作用靶位rpoB相結(jié)合,由此而產(chǎn)生細(xì)菌的耐藥[12]。

相關(guān)報(bào)道指出,第531位氨基酸是最易發(fā)生突變的位點(diǎn)[13]。本研究耐藥株rpoB基因突變?nèi)考邪l(fā)生在81 bp核心區(qū)。35株利福平耐藥株密碼子TCG※T TG(Ser※Leu)在531位點(diǎn)突變11株(31.4%),526位點(diǎn)突變14株(40.0%),516位點(diǎn)突變3株(8.6%),其他6株(17.1)。這也再次印證了絕大部分耐RFP菌株與rpoB基因耐藥決定區(qū)的突變有關(guān),最常見突變位點(diǎn)在第526、531位密碼子。

3.3 MTB耐氟喹諾酮類藥物菌株中g(shù)yrA基因突變特點(diǎn)

氟喹諾酮類藥物中有很多能起較強(qiáng)抗MTB活性的藥物,但隨著近年來臨床的廣泛應(yīng)用,細(xì)菌耐藥性問題亦日漸突出。其主要通過抑制細(xì)菌DNA回旋酶活性,松弛細(xì)菌雙鏈超螺旋結(jié)構(gòu),使得雙鏈無法被部分拆開,細(xì)菌DNA修復(fù)和合成無法完成,導(dǎo)致最終死亡[14]。絕大部分獲得性耐藥與DNA回旋酶A亞單位(簡稱gyrA)基因突變有關(guān)[15]。

本文研究結(jié)果顯示,在耐氟喹諾酮類藥物菌株中,gyra基因突變率為75%,氟喹諾酮類藥物突變主要在gyrA基因耐藥決定區(qū)(QRDR)發(fā)生,突變位點(diǎn)主要為94(66.7%)、90(10%)、91點(diǎn)(6.7),其他16.7%,說明氟喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥的主要機(jī)制為gyrA基因QRDR突變,突變位點(diǎn)主要在90、91、94位點(diǎn)。

katG、gyrA、rpoB基因突變?yōu)榍嗪５貐^(qū)結(jié)核分枝桿菌INH、氟喹諾酮類藥物以及RFP耐藥所引起的主要分子機(jī)制,應(yīng)用操作簡單的PCRDNA測(cè)序法,可作為臨床快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌INH、氟喹諾酮類藥物、RFP耐藥性的輔助手段。

本研究確診的肺結(jié)核患者來自青海省不同地區(qū),包括牧區(qū)藏族、農(nóng)村及市區(qū),按照地區(qū)來源對(duì)樣本進(jìn)行分類,并對(duì)drpoB、katG、gyrA耐藥基因位點(diǎn)突變特征進(jìn)行比較,未能發(fā)現(xiàn)地區(qū)之間的耐藥基因突變位點(diǎn)存在顯著差異。

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