慢性華支睪吸蟲感染對(duì)脂多糖刺激巨噬細(xì)胞反應(yīng)的影響*

徐 嘉， 徐 雪， 王中華， 胡旭初， 詹 蔚， 葉 子， 詹 紅， 熊 艷△

(中山大學(xué)1附屬第一醫(yī)院急診科，2附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)神經(jīng)三科，3中山醫(yī)學(xué)院寄生蟲教研室，廣東廣州510080)

巨噬細(xì)胞是參加機(jī)體針對(duì)感染和炎癥的天然免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞，主要參與吞噬病原體、免疫調(diào)理和組織損傷的病理生理過程。這些作用被認(rèn)為是經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞(classical activated macrophage，M1)的主要功能。但近年來，一種新的巨噬細(xì)胞亞類越來越受到重視，其活化條件和功能狀態(tài)與經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞大不相同，被稱為替代活化型巨噬細(xì)胞(alternatively activated macrophage，M2)，主要參與抑制炎癥、免疫耐受和損傷修復(fù)的病理生理過程。慢性華支睪吸蟲(Clonorchis sinensis，Cs)感染可導(dǎo)致宿主機(jī)體免疫應(yīng)答向Th2方向偏移，產(chǎn)生抑制炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子、效應(yīng)分子和T細(xì)胞亞型等，慢性華支睪吸蟲感染的宿主機(jī)體對(duì)可能同時(shí)存在的急性炎癥反應(yīng)表現(xiàn)出抑制免疫應(yīng)答，減輕組織損傷的效應(yīng)，但其中的具體機(jī)制尚不明確。本研究通過建立慢性華支睪吸蟲感染大鼠模型，檢測(cè)血清促炎和抗炎因子水平以評(píng)價(jià)其免疫狀態(tài)，并觀察不同狀態(tài)下腹腔巨噬細(xì)胞的表型分化以及對(duì)炎癥刺激因子的反應(yīng)，探討Cs感染對(duì)其它感染性疾病的影響及可能的機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物及分組

清潔級(jí)雄性SD大鼠(160～180 g)40只，購自中山大學(xué)北校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，其中正常對(duì)照組10只，慢性華支睪吸蟲感染組10只，進(jìn)行第一部分實(shí)驗(yàn)。余20只同樣分組，用于獲取腹腔巨噬細(xì)胞進(jìn)行第二部分實(shí)驗(yàn)。感染華支睪吸蟲囊蚴的麥穗魚取自中山醫(yī)學(xué)院寄生蟲實(shí)驗(yàn)室建造的生態(tài)池。

2 主要試劑和儀器

高糖型 DMEM、RPMI-1640、DPBS和不含 Ca2+、Mg2+的HBSS均購自Gibco;胰酶和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)購于Sigma;大鼠腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、干擾素 γ(interferon γ，IFN-γ)、白細(xì)胞介素 4(interleukin 4，IL-4)和 IL-10的ELISA檢測(cè)試劑盒購于Bender MedSystems;抗大鼠PE-Cy5F4/80和大鼠PE-CD16/32抗體購于eBioscience;大鼠FITC-CD206抗體購于Santa Cruz;氯化鈉、氯化鉀等為國產(chǎn)分析純;消化液由中山醫(yī)學(xué)院寄生蟲教研室保存;微量移液器購于Gilson;15 mL離心管、50 mL培養(yǎng)瓶和96孔培養(yǎng)板購于Corning;測(cè)試儀器包括Bio-Rad公司的MODEL 550型酶標(biāo)儀;北京醫(yī)用離心機(jī)廠生產(chǎn)的臺(tái)式離心機(jī);BD公司的FACSCalibur流式細(xì)胞儀。

3 方法

3.1 建立慢性華支睪吸蟲感染模型

3.1.1 華支睪吸蟲囊蚴的收集 (1)麥穗魚肉50 g，用絞肉機(jī)絞碎;(2)碎魚肉放入2 000 mL的大燒杯中，加入自來水少量，攪勻，再加自來水至滿，充分?jǐn)噭?，靜置15 min，倒去上液，余下一半體積的液體;(3)把消化液加入燒杯中，攪勻，放入37℃溫箱中消化，每隔20～30 min攪拌1次，約經(jīng)4～12 h，即可消化完全;(4)將消化好的魚肉從溫箱中取出，靜置15 min，倒去上液，余下的用80目篩網(wǎng)過濾，把殘?jiān)^濾掉;(5)濾液中加入生理鹽水，靜置30 min，倒去上液，如此反復(fù)，直至上液澄清為止，換到小平皿中，沉淀在解剖鏡下挑取活囊蚴。

3.1.2 囊蚴攻擊感染SD大鼠致華支睪吸蟲慢性感染模型 具體操作如下:對(duì)華支睪吸蟲感染組大鼠進(jìn)行囊蚴感染，采用灌胃針經(jīng)口灌胃，每只SD大鼠50個(gè)囊蚴，感染后第20 d開始每天收集糞便查蟲卵，確定最早排蟲卵時(shí)間，感染后第70 d收集大鼠糞便檢出蟲卵證實(shí)感染模型建造成功。

3.2 腹腔巨噬細(xì)胞的收集 取細(xì)胞前SD大鼠禁食不禁水24 h;SD大鼠乙醚麻醉后，斷頭處死。將動(dòng)物仰臥放置，剪去腹壁皮毛，用70%乙醇消毒;沿正中線剪開腹壁，將5～10 mL沖洗液注入腹腔，用吸管反復(fù)沖洗腹膜腔;將腹膜腔的細(xì)胞懸液吸入離心管，室溫離心(1 000 r·min-1，10 min，2 次);用培養(yǎng)液混懸沉淀細(xì)胞，將細(xì)胞加入培養(yǎng)瓶，37℃、5%CO2培養(yǎng)2 h;吸去培養(yǎng)液，用不含Ca2+和Mg2+的HBSS清洗2次，除去漂浮的細(xì)胞，得到附著于培養(yǎng)瓶底壁的巨噬細(xì)胞。

3.3 腹腔巨噬細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)分組及處理 按照腹腔巨噬細(xì)胞的大鼠來源，分為3組:對(duì)照組(control group)、正常大鼠巨噬細(xì)胞組(normal group)和華支睪吸蟲感染大鼠巨噬細(xì)胞(Cs infestation group)組。采用酶消化法取出貼壁的巨噬細(xì)胞，室溫離心(1 000 r·min－1，10 min)，用無色 RPMI-1640 完全培養(yǎng)液混懸沉淀細(xì)胞，將細(xì)胞調(diào)整至2×109/L，接種于96孔板繼續(xù)培養(yǎng)，1 d后培養(yǎng)基換為無色RPMI-1640不完全培養(yǎng)液。其中正常巨噬細(xì)胞組和肝吸蟲感染巨噬細(xì)胞組加入LPS(10 μg/L)刺激孵育，對(duì)照組加入無色RPMI-1640培養(yǎng)，每組每個(gè)時(shí)點(diǎn)做3個(gè)平行孔。在刺激后的0、2、12、24 h收集各組各孔細(xì)胞培養(yǎng)上清液，－80℃保存。

3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞膜蛋白表達(dá) 采用酶消化法取得貼壁的腹腔巨噬細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞至每管5×105細(xì)胞，PBS 洗1 次，100 μL PBS 重懸，向巨噬細(xì)胞中加入抗大鼠PE-Cy5F4/80抗體，向經(jīng)誘導(dǎo)刺激后的巨噬細(xì)胞中加入小鼠FITC-CD206抗體和小鼠PECD16/32抗體，避光室溫孵育30 min，PBS洗3遍，再用PBS 200 μL重懸后用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

3.5 細(xì)胞因子的檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清的 IL-4、IL-10、TNF-α 和 IFN-γ 濃度，以及各組各時(shí)點(diǎn)巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液TNF-α濃度，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，兩組以上計(jì)量資料比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 正常大鼠與慢性華支睪吸蟲感染大鼠血清細(xì)胞因子的比較

慢性Cs感染組較正常對(duì)照組血清IL-4、IL-10、TNF-α 和IFN-γ均明顯升高(P ＜0.05)，其中IL-4和IL-10的升高更加顯著，見表1。

表1 正常對(duì)照組和慢性Cs感染組大鼠血清細(xì)胞因子濃度的比較Table 1.Comparison of serum levels of IL-4，IL-10，TNF-α and IFN-γ in rats from normal group and chronic Cs infestation group(ng/L.Mean± SD.n=10)

2 正常對(duì)照組與慢性華支睪吸蟲感染組的腹腔巨噬細(xì)胞分化情況

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示正常對(duì)照組大鼠的腹腔巨噬細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞分化的比例為92.11%，見圖1A，而慢性華支睪吸蟲感染組大鼠的腹腔巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞分化的比例為93.84%，見圖1B。

Figure 1.The differentiation proportion of different types of peritoneal macrophages from normal group(A)and chronic Cs infestation group(B).圖1 正常對(duì)照組與慢性肝吸蟲感染組腹腔不同類型巨噬細(xì)胞的分化情況

3 空白對(duì)照組、正常對(duì)照組和慢性Cs感染組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液TNF-α和IL-10濃度的比較

在未受LPS刺激時(shí)，空白對(duì)照組、正常對(duì)照組和慢性Cs感染組大鼠巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-10的濃度均較低，基礎(chǔ)值比較無顯著差異(P ＞0.05);給予LPS(10 μg/L)刺激后的2、12 和24 h，正常對(duì)照組和慢性Cs感染組腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液TNF-α和IL-10濃度均呈時(shí)間依賴性升高，其中正常對(duì)照組腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液TNF-α濃度上升更顯著(P＜0.05)，而慢性Cs感染組腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-10的濃度上升更加顯著(P＜0.05)，見表2。

表2 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)腹腔巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)上清液TNF-α和IL-10水平的比較Table 2.The levels of TNF-α and IL-10 in the culture supernatants of peritoneal macrophages at different time points in the three groups(ng/L.Mean ±SD.n=10)

討 論

Cs又稱為肝吸蟲，是感染人類引起華支睪吸蟲病的病原體，其感染在世界范圍內(nèi)流行，且具有慢性化和長(zhǎng)時(shí)程的特點(diǎn)［1］。與其它蠕蟲感染一樣，華支睪吸蟲感染會(huì)引起宿主的免疫反應(yīng)，而蠕蟲感染與宿主免疫應(yīng)答的關(guān)系一直是病原生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，主要集中于探討宿主免疫應(yīng)答在Cs致病機(jī)制中的作用［2］。Cs感染可誘導(dǎo)宿主機(jī)體獲得性免疫向Th2方向極化，產(chǎn)生大量的Th2應(yīng)答的細(xì)胞因子，如IL-4、IL-5 和 IL-13 等［3］，這些細(xì)胞因子可以打擊感染的蠕蟲，但同時(shí)蠕蟲可以通過誘導(dǎo)產(chǎn)生抗炎因子IL-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β(transfer growth factor β，TGF-β)逃避宿主機(jī)體的免疫攻擊，在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期生存，這就是Cs感染呈慢性過程的主要機(jī)制［4］。除此之外，關(guān)于蠕蟲感染引起的宿主免疫應(yīng)答的極化對(duì)其它疾病影響的研究越來越受到學(xué)者們的關(guān)注，已有研究顯示，慢性蠕蟲感染對(duì)感染性疾病，如細(xì)菌、病毒等具有保護(hù)效應(yīng)［5］，但具體的機(jī)制尚不明確。

巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫應(yīng)答，尤其是在對(duì)抗病原體感染機(jī)體的天然免疫應(yīng)答過程中的重要細(xì)胞之一，巨噬細(xì)胞在不同的刺激條件下發(fā)生不同的功能變化，參與感染、炎癥等多種病理生理過程［6］。根據(jù)巨噬細(xì)胞活化狀態(tài)和發(fā)揮作用的不同，分為經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞(M1型)和替代活化型巨噬細(xì)胞(M2型)［7］，它們?cè)隗w內(nèi)和體外均具有較強(qiáng)的可塑性，在不同條件下向不同方向極化［8］。其中，在Th2型細(xì)胞因子的作用下，如IL-4或IL-13等，巨噬細(xì)胞向M2型分化，與M1型巨噬細(xì)胞吞噬病原體、激發(fā)炎癥反應(yīng)和組織損傷的作用不同，M2型巨噬細(xì)胞主要發(fā)揮減輕炎癥反應(yīng)、組織修復(fù)和血管生成的生物學(xué)作用［9］，以往血吸蟲感染的研究顯示M2巨噬細(xì)胞主要通過表達(dá)精氨酸酶1(Arg-1)和抵抗素樣分子 α(RELMα)等發(fā)揮對(duì)炎癥的抑制作用［10-11］。巨噬細(xì)胞缺乏表達(dá)Arg-1的小鼠不能抑制血吸蟲蟲卵誘導(dǎo)的炎癥［11］。因此，M2巨噬細(xì)胞的免疫抑制效應(yīng)可能并不完全依賴Th2細(xì)胞因子機(jī)制，有研究表明其抗炎和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制也不依賴于IL-10［12］，具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。

我們?cè)谝酝难芯恐?，通過囊蚴灌胃建立了慢性Cs感染大鼠的模型，并通過改變灌胃囊蚴的數(shù)量、頻次以及感染時(shí)間的摸索，確定最佳的建模條件，檢測(cè)大鼠血清的抗體以 IgE和 IgG1亞類為主［13］。本實(shí)驗(yàn)中，慢性Cs感染大鼠血清的IL-4和IL-10等抑炎因子明顯升高，為誘導(dǎo)腹腔巨噬細(xì)胞向M2表型分化提供了免疫環(huán)境，流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)腹腔巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物證實(shí)慢性Cs感染后腹腔巨噬細(xì)胞向M2型極化，而在自然狀態(tài)下正常對(duì)照的大鼠腹腔巨噬細(xì)胞仍以經(jīng)典的M1型為主。體外以脂多糖刺激并培養(yǎng)不同類型的腹腔巨噬細(xì)胞，以觀察不同巨噬細(xì)胞對(duì)LPS這種革蘭陰性細(xì)菌感染致膿毒癥的最重要致病因子的炎癥應(yīng)答，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液TNF-α的濃度，結(jié)果顯示，LPS刺激后 M1和M2型巨噬細(xì)胞均可對(duì)LPS刺激反應(yīng)，培養(yǎng)上清液TNF-α和IL-10濃度隨時(shí)間進(jìn)行性升高，從LPS刺激2 h開始各時(shí)點(diǎn)測(cè)得M2型巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液的TNF-α水平較M1巨噬細(xì)胞明顯降低，相反的，另一種抑炎因子IL-10的水平隨時(shí)間進(jìn)展明顯升高，這反映出M2巨噬細(xì)胞對(duì)炎癥刺激的耐受。在我們關(guān)注的膿毒癥研究中，以往免疫調(diào)節(jié)治療的研究往往局限于某些藥物或免疫系統(tǒng)的某個(gè)環(huán)節(jié)［14］，本研究初步結(jié)果顯示在慢性Cs感染導(dǎo)致的機(jī)體Th2免疫應(yīng)答環(huán)境下，發(fā)生了參與炎癥反應(yīng)關(guān)鍵的巨噬細(xì)胞和細(xì)胞因子的改變，這可能為臨床嚴(yán)重感染所致膿毒癥的疾病診治提供了新的思路和理論基礎(chǔ)，相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)深入展開。

［1］ Rim HJ.Clonorchiasis:an update［J］.J Helminthol，2005，79(3):269-281.

［2］ 高 翔，劉 平，李懿宏，等.華支睪吸蟲感染患者血清Th1/Th2細(xì)胞因子水平檢測(cè)及意義［J］.國際免疫學(xué)雜志，2006，29(1):55-57.

［3］ Maizels RM，Yazdanbakhsh M.Immune regulation by helminth parasites:cellular and molecular mechanisms［J］.Nat Rev Immunol，2003，3(9):733-744.

［4］ Taylor A，Verhagen J，Blaser K，et al.Mechanisms of immune suppression by interleukin-10 and transforming growth factor-β:the role of T regulatory cells［J］.Immunology，2006，117(4):433-442.

［5］ Van Riet E，Hartgers FC，Yazadanbakhsh M.Chronic helminth infections induce immunomodulation:consequences and mechanisms［J］.Immunobiology，2007，212(6):475-490.

［6］ 吳曉倩，宜 金，何麗珊.ox-LDL對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)皮脂肪酶表達(dá)的影響［J］.中國病理生理雜志，2012，28(7):1172-1175.

［7］ Mantovani A，Sica A，Locati M.Macrophage polarization comes of age［J］.Immunity，2005，23(4):344-346.

［8］ Gordon S.Macrophage heterogeneity and tissue lipids［J］.J Clin Invest，2007，117(1):89-93.

［9］ Edward JP，Zhang X，F(xiàn)rauwirth KA，et al.Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations［J］.J Leukoc Biol，2006，80(6):1298-1307.

［10］ Pesce JT，Ramalingam TR，Mentink-Kane MM，et al.Arginase-1-expressing macrophages suppress Th2 cytokine-driven inflammation and fibrosis［J］.PLoS Pathog，2009，5(4):e1000371.

［11］ Nair MG，Du Y，Perrigoue JG，et al.Alternatively activated macrophage-derived RELM-α is a negative regulator of type 2 inflammation in the lung［J］.J Exp Med，2009，206(4):937-952.

［12］ Herbert DR，Holscher C，Mohrs M，et al.Alternative macrophage activation is essential for surviving during schistosomiasis and downmodulated T helper 1 responses and immunopathology［J］.Immunity，2004，20(3):623-635.

［13］ Wang X，Liang C，Chen W，et al.Experimental model in rats for study on transmission dynamics and evaluation of Clonorchis sinensis infection immunologically，morphologically，and pathologically［J］.Parasitol Res，2009，106(1):15-21.

［14］ 黃順偉，管向東，陳 娟，等.烏司他丁聯(lián)合胸腺肽α1改善膿毒癥患者免疫功能的作用機(jī)制研究［J］.中國病理生理雜志，2009，25(11):2168-2172.