PCR法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌DNA在鑒別克羅恩病與腸結(jié)核中的價(jià)值*

陳瑜君， 何 瑤， 陳白莉， 毛 仁， 晁 康， 徐萍萍， 曾志榮， 陳旻湖， 胡品津

腸結(jié)核(intestinal tuberculosis，ITB)和克羅恩病 (Crohn disease，CD)臨床表現(xiàn)有很多相似之處，且病理特征上都具有肉芽腫形成的特點(diǎn)，較難區(qū)別2種疾病。克羅恩病是一組發(fā)病機(jī)制不明的腸道炎癥性疾病，其發(fā)病機(jī)制認(rèn)為與腸道細(xì)菌和環(huán)境因素作用于遺傳易感的人群，引起異常免疫反應(yīng)有關(guān)。結(jié)核分枝桿菌感染作為ITB的病因已明確，因此從病原學(xué)檢測(cè)的角度出發(fā)，探索在腸結(jié)核患者中直接檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌 DNA(Mycobacterium tuberculosis，MTB)快捷有效的方法對(duì)鑒別兩病重要意義。

ITB是由人型MTB感染所致的特異性腸道炎癥。結(jié)核菌在感染人體后，多處于潛伏狀態(tài)，它能在宿主細(xì)胞內(nèi)逃逸宿主的防御作用而大量繁殖，一般情況下，約10%的感染者可發(fā)展為致病性結(jié)核，在病灶檢測(cè)到結(jié)核桿菌可診斷結(jié)核。IS6110［1-2］是 MTB基因組中一個(gè)多拷貝的保守片段，有1 361 bp的核苷酸和28 bp的反向末端重復(fù)序列，MTB中含有該序列10～20拷貝，具有較高的敏感性。該序列僅存在于人型結(jié)核分枝桿菌、牛型結(jié)核分枝桿菌(包括BCG)和非洲結(jié)核分枝桿菌中，亦具有較高的特異性。根據(jù)IS6110設(shè)計(jì)引物的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)具有高敏感性和高特異性的優(yōu)點(diǎn)，特別是菌量少時(shí)更能顯示出該技術(shù)的優(yōu)越性。本研究旨在通過PCR技術(shù)檢測(cè)ITB與CD患者腸道組織的MTB，探索進(jìn)行快速M(fèi)TB病原學(xué)診斷試驗(yàn)方法在確診ITB中的可行性及價(jià)值，同時(shí)為ITB和CD鑒別診斷提供方便快捷的方法。

材料和方法

1 組織標(biāo)本

石蠟標(biāo)本來自中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科2002年～2011年檔案保存病例，其中ITB 25例，CD 25例。所有標(biāo)本通過HE染色切片，由病理學(xué)家重新讀片確定病理診斷。病人有完整臨床病理資料及內(nèi)鏡資料，由消化內(nèi)科專家重新分析臨床資料，確定臨床診斷。所有患者取材前未接受抗結(jié)核治療。

2 陽(yáng)性對(duì)照菌株

陽(yáng)性對(duì)照菌株H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA由廣州市胸科醫(yī)院研究所惠贈(zèng)。

3 主要儀器

ABI 9700 PCR儀。

4 石蠟組織DNA的提取

腸結(jié)核和克羅恩病患者腸道組織DNA提取自石蠟包埋組織，采用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen)試劑盒提取。具體操作如下:(1)從腸結(jié)核患者和克羅恩病患者石蠟組織標(biāo)本中切取8 μm×8張的切片;(2)分次加入適量二甲苯、無水乙醇溶解蠟塊，并加入50 μL溶菌酶;(3)加入180 μL的ATL緩沖液;(4)加入20 μL蛋白酶K(protease K)，將離心管放入56℃水浴箱直至組織完全溶解，加長(zhǎng)溶解時(shí)間，可過夜，此過程需不時(shí)振蕩離心管以分散組織;(5)依據(jù)說明書分次加入Buffer AL、無水乙醇溶解;(6)取上述混合液入QIAamp柱中，據(jù)說明書分次加入Buffer AW1、Buffer AW2和Buffer AE提取DNA。

5 DNA完整性的判斷

1.5 %瓊脂糖，電壓100 V，20 ～30 min。

6 PCR引物的設(shè)計(jì)與合成

引物采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，均由廣州英韋創(chuàng)津生物科技有限公司合成。具體序列及片段長(zhǎng)度:目的基因IS6110引物正義鏈5'-CCTGCGAGCGTAGGCGTCGG-3'，反義鏈 5'-CTCGTCCAGCGCCGCTTCGG-3'，目的產(chǎn)物長(zhǎng)度123 bp。內(nèi)參照β-actin引物正義鏈5'-GCATGGGTCAGAAGGATTCCT-3'，反義鏈5'-TCGTCCCAGTTGGTGACGAT-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度 106 bp。

7 PCR擴(kuò)增反應(yīng)

50 μL 反應(yīng)體系:PCR Mix 20 μL，ddH2O 6 μL，Primer F 2 μL，Primer R 2 μL，DNA 20 μL。反應(yīng)條件:預(yù)變性 95℃ 5 min，93℃ 30 s，60℃ 45 s，72℃35 s，35 個(gè)循環(huán)。

8 電泳

于含有溴化乙啶染色的2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外線下觀察結(jié)果。

9 測(cè)序

抽樣測(cè)序擴(kuò)增出目的條帶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，由華大基因測(cè)序，采用雙向測(cè)序。PCR產(chǎn)物測(cè)序所得基因序列在 GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)。

10 質(zhì)量控制

本實(shí)驗(yàn)采用多項(xiàng)措施控制質(zhì)量，避免污染及減少假陰性:(1)操作過程Eppendorf管開蓋操作均在生物安全柜中進(jìn)行;(2)每輪反應(yīng)均設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照;(3)擴(kuò)增陰性者均重復(fù)2次，3次擴(kuò)增均陰性者方可判斷為陰性。

11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

選用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，兩組陽(yáng)性率比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確概率檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MTB DNA PCR有助于確診ITB

如表1中所示，ITB標(biāo)本中MTB PCR陽(yáng)性率為32%(8/25)，CD標(biāo)本中 MTB PCR陽(yáng)性率為0%(0/25)。MTB DNA PCR法在ITB和CD鑒別診斷中的靈敏度為32%，特異度為100%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100%，陰性預(yù)測(cè)值59.5%。而在本組病例中抗酸染色法和病理確診(干酪樣壞死)靈敏度僅分別為8%和12%，PCR敏感性明顯高于抗酸染色(P＜0.05)和干酪樣壞死(P＜0.05)。

表1 腸結(jié)核組與克羅恩病組MTB PCR檢測(cè)結(jié)果Table 1.Positive results of MTB DNA PCR in ITB and CD groups

圖1所示為MTB PCR結(jié)果，目的電泳條帶長(zhǎng)度為123 bp。所有陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照均出現(xiàn)預(yù)期相應(yīng)的陽(yáng)性及陰性結(jié)果。PCR測(cè)序由華大基因完成，采用雙向測(cè)序，PCR產(chǎn)物測(cè)序所得基因序列在Gen-Bank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)，結(jié)果顯示與電泳結(jié)果相符，圖2示部分測(cè)序結(jié)果。

Figure 1.PCR results for MTB DNA detection.1:negative control;2:intestinal tuberculosis sample;3:Crohn disease sample;4:positive control;5:DNA marker.圖1 IS6110 PCR擴(kuò)增結(jié)果

Figure 2.Target DNA PCR product sequencing figure(part).圖2 PCR擴(kuò)增出目的條帶標(biāo)本的PCR產(chǎn)物測(cè)序圖(部分)

2 PCR法陽(yáng)性率與病理特征的關(guān)系

如圖3所示，25例ITB患者石蠟切片標(biāo)本發(fā)現(xiàn)肉芽腫的共12例，有肉芽腫標(biāo)本PCR陽(yáng)性率為41.7%，無肉芽腫組陽(yáng)性率為23.1%，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。進(jìn)一步分析肉芽腫數(shù)目與PCR陽(yáng)性率間的關(guān)系，肉芽腫數(shù)目≥2個(gè)/切片的標(biāo)本7例，PCR的陽(yáng)性率為42.9%，肉芽腫數(shù)目=1個(gè)/切片的標(biāo)本5例，2例PCR陽(yáng)性，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。9例標(biāo)本可見多核巨細(xì)胞，PCR陽(yáng)性率為44.4%，不含巨核細(xì)胞標(biāo)本的陽(yáng)性率為25.0%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。其中1例為僅含離散的多核巨細(xì)胞，PCR結(jié)果陰性。2例同時(shí)含離散多核巨細(xì)胞和肉芽腫內(nèi)多核巨細(xì)胞，1例PCR結(jié)果陽(yáng)性。6例多核巨細(xì)胞僅位于肉芽腫內(nèi)，有3例PCR結(jié)果陽(yáng)性。圖4示部分典型病理表現(xiàn)。

Figure 3.The relationship between MTB DNA positive rate and pathological features.Big granulomas:diameter ≥200 μm;small granulomas:diameter ＜ 200 μm;multiple granulomas:granuloma number≥2 each specimen.圖3 PCR法檢測(cè)MTB DNA陽(yáng)性率與病理特征的關(guān)系

Figure 4.Typical pathological manifestations of ITB and CD.A(×100)，B(×200)and C(×100)showed caseation necrosis，horseshoe-shaped or wreath-like multinucleated giant cells and dense fused granulomas，respectively，supporting ITB;D(×400)，E(×100)and F(×200)revealed ganglion cells，fissure-like ulcer and loose small granulomas，respectively，supporting CD.圖4 腸結(jié)核和克羅恩病的部分典型病理表現(xiàn)

討 論

ITB和CD的鑒別診斷一直是臨床難題。如果將CD誤診為ITB，將導(dǎo)致不必要的抗結(jié)核治療和藥物毒性，及導(dǎo)致CD的治療延遲。反之，如果將ITB誤診為CD，采用激素、免疫抑制劑甚至生物制劑治療可使病情惡化甚至死亡。目前對(duì)2種疾病的鑒別診斷主要依據(jù)內(nèi)鏡檢查和手術(shù)標(biāo)本組織病理，以及診斷性抗結(jié)核治療［3］。而典型臨床特征、結(jié)核桿菌抗酸染色、結(jié)核桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性等僅見于極少數(shù)患者，因此作為鑒別診斷依據(jù)的價(jià)值有限。結(jié)核桿菌PCR、小腸CT成像(CTE)和結(jié)核感染酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(T.SPOT.TB)成為目前較新的研究熱點(diǎn)［4］。

MTB DNA PCR技術(shù)在PCR技術(shù)將病原體的檢測(cè)帶入了分子生物學(xué)時(shí)代時(shí)已嘗試應(yīng)用于此領(lǐng)域。其優(yōu)越性體現(xiàn)在:(1)敏感性高，尤其適用于ITB抗酸染色陰性或未見干酪樣壞死典型病例表現(xiàn)的標(biāo)本;(2)特異性高;(3)快速。1989年法國(guó)學(xué)者Brisson-Noёl等［5］首先報(bào)道將 PCR 技術(shù)用于診斷結(jié)核病。近年國(guó)內(nèi)外多家研究機(jī)構(gòu)已經(jīng)對(duì)PCR技術(shù)應(yīng)用于ITB的診斷做了一些初步的探討。PCR在ITB的診斷中敏感性一般，但特異性很高。國(guó)內(nèi)以華西為代表的研究機(jī)構(gòu)做出的結(jié)果其敏感性可達(dá)60%以上［6-9］，國(guó)外主要是印度和韓國(guó)結(jié)核較高發(fā)的國(guó)家在研究，其做出的敏感性在21.6% ～45.0%。而特異性都高達(dá)80%以上［10-12］。我們的研究MTB DNA檢查的陽(yáng)性率為32%，與報(bào)道相符。

MTB DNA PCR假陰性的原因主要有:(1)活組織標(biāo)本:組織中結(jié)核分枝桿菌DNA的提取量小于PCR法檢出下限。MTB DNA在ITB病人的組織中濃度很低，分布不均勻，且內(nèi)鏡活檢組織，鉗取組織量少且淺。這些特征導(dǎo)致提取的DNA主要是組織DNA，不能有效地從分枝桿菌中提取結(jié)核DNA。(2)石蠟標(biāo)本:某些石蠟包埋組織陳舊，DNA已降解或破壞;組織的反復(fù)凍融也有可能破壞DNA。(3)實(shí)驗(yàn)技術(shù):DNA提取時(shí)結(jié)核分枝桿菌未破解成功，結(jié)核分枝桿菌包壁堅(jiān)韌，裂解困難，不除外提取的主要是組織DNA，部分分枝桿菌未充分裂解釋放出DNA。此外不排除商品化的DNA分離試劑則可能移除我們所要檢測(cè)的部分結(jié)核桿菌DNA，這將導(dǎo)致錯(cuò)誤的陰性結(jié)果。

針對(duì)上述可能出現(xiàn)的問題，我們的研究圍繞著DNA提取和PCR擴(kuò)增，建立穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)學(xué)方法提高實(shí)驗(yàn)可靠性和檢出率。(1)DNA提取是結(jié)核DNA PCR的關(guān)鍵，增加活檢數(shù)量和部位［13］，在DNA提取前加入溶解酶，加大蛋白酶K的量、加長(zhǎng)溶解時(shí)間，盡量增強(qiáng)溶解效果。選用可達(dá)到較高濃度和純度產(chǎn)物的試劑盒。(2)PCR擴(kuò)增選擇MTB基因組中一個(gè)多拷貝的保守片段 IS6110 設(shè)計(jì)引物［1，14］，具有較高的敏感性及高度特異性。(3)其次擴(kuò)增123 bp片段，避免了大片段因石蠟包埋處理過程的DNA降解、斷裂而導(dǎo)致的假陰性。(4)進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控。設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，并對(duì)結(jié)果陰性的標(biāo)本重復(fù)2次PCR擴(kuò)增。

許多研究探討分枝桿菌PCR陽(yáng)性率與病理特征的關(guān)系，ITB特異性指標(biāo)干酪樣壞死和抗酸染色陽(yáng)性率低。大(直徑＞200 μm)、致密、融合、邊界清的黏膜下肉芽腫傾向ITB。直徑小(＜200 μm)、非融合、邊界不清、結(jié)構(gòu)排列疏松肉芽腫傾向于CD。多核巨細(xì)胞在腸結(jié)核和克羅恩病患者均可見。報(bào)道提示，PCR的陽(yáng)性率同病理特征有關(guān)［12］，有特征性病理表現(xiàn)的組織PCR陽(yáng)性率更高。可能與結(jié)核分枝桿菌多存在于上皮樣肉芽腫形成部位有關(guān)。在我們的研究中，PCR的陽(yáng)性率在有肉芽腫、巨核細(xì)胞的標(biāo)本中較高，但未達(dá)顯著差異，考慮與樣本量小有關(guān)。大樣本研究、定量PCR和血清學(xué)檢測(cè)［15］等更敏感的方法是今后研究的方向。

PCR法可用于結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè)，隨著分子技術(shù)的不斷進(jìn)步，大大縮短了診斷所需時(shí)間，敏感性和特異性也不斷提高，是確診ITB以及研究ITB和CD鑒別診斷的一種方便快捷的輔助診斷方法。

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