皖南地區(qū)眼鏡蛇毒活性組分鎮(zhèn)痛效應(yīng)的初步研究*

閔志雪， 黃 璐， 孫 瑤， 包鵬舉，2， 王海華，2， 張根葆△

疼痛是腦對(duì)急性或慢性組織損傷所引起的傷害性傳入進(jìn)行抽象和概括后所形成的不愉快感覺，常常伴有復(fù)雜的自主神經(jīng)活動(dòng)、運(yùn)動(dòng)反射、心理和情緒反應(yīng)。藥物是疼痛治療最常用和最基本的方法。目前缺乏作用強(qiáng)、不成癮、可長期安全服用的鎮(zhèn)痛藥。因此鎮(zhèn)痛效果良好而不具成癮性的鎮(zhèn)痛藥的開發(fā)研究一直是疼痛控制的路徑之一。

二十世紀(jì)初，人們就開始應(yīng)用蛇毒治療疼痛，與傳統(tǒng)藥物相比，蛇毒鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)痛時(shí)間長，無成癮性和耐藥性，用量少，對(duì)頑固性疼痛、神經(jīng)性疼痛和癌性疼痛都有效［1］。自發(fā)現(xiàn)粗毒具有鎮(zhèn)痛活性以來，國內(nèi)外分離純化發(fā)現(xiàn)約百余種鎮(zhèn)痛組分，從成分復(fù)雜的粗毒中分離純化尋找可靠的純度較高而效果良好的鎮(zhèn)痛組分，并對(duì)其結(jié)構(gòu)性質(zhì)、作用機(jī)制進(jìn)行研究具有重要意義。皖南地區(qū)地處亞熱帶，氣候溫和，丘陵山地偏多，蛇的蘊(yùn)藏量相當(dāng)豐富。關(guān)于皖南地區(qū)眼鏡蛇毒鎮(zhèn)痛組分尚未見報(bào)道，因此對(duì)皖南地區(qū)眼鏡蛇毒中鎮(zhèn)痛成分進(jìn)行研究開發(fā)和應(yīng)用是一個(gè)很有價(jià)值的研究方向。

材料和方法

1 材料

1.1 主要儀器與試劑 AKTA prime蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)(Pharmacia)，pHs-3B型 pH計(jì)(上海雷磁儀器廠)，RB智能熱板儀(四川成都儀器廠)，眼鏡蛇毒由皖南醫(yī)學(xué)院蛇毒研究所提供，P/ACE MDQ高效毛細(xì)管電泳液(貝克曼庫爾特公司)，SP Sephadex C-50和Sephadex G-50為Pharmacia產(chǎn)品;透析袋，截留相對(duì)分子量3 500(Sigma)，鹽酸嗎啡(morphine chloride)注射液(批號(hào)101006-1)購自沈陽第一制藥廠，低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白購自上海生工公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 動(dòng)物 昆明種小鼠244只，體重(20±2)g，由南京青龍山動(dòng)物繁殖場提供(批號(hào)為SCXK蘇2007-0001)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理規(guī)定。

2 方法

2.1 眼鏡蛇毒鎮(zhèn)痛因子(cobra venom analgesic factor，CVAF)的分離純化和保存 純化方法參考童富淡等［2］，對(duì)皖南地區(qū)眼鏡蛇粗毒使用陽離子交換色譜(cation-exchange chromatography，CEC)和分子排阻層析(size exclusion chromatography，SEC)進(jìn)行分離純化，取0.5 g眼鏡蛇毒凍干粉對(duì)眼鏡蛇粗毒進(jìn)行預(yù)處理后溶于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)中，6 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清0.22 μm 濾膜過濾后備用。平衡后過SP Sephadex C-50陽離子交換色譜，柱規(guī)格為1.7 cm ×40.0 cm，洗脫液0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH=6，流速為1 mL/min，每管6 mL，分段梯度洗脫;測定A280，繪制洗脫曲線，收集各峰洗脫液。使用小鼠熱板法篩選鎮(zhèn)痛活性明顯的組分進(jìn)行Sephadex G-50純化，柱規(guī)格為1.6 cm×50.0 cm，洗脫液為生理鹽水，流速為 0.5 mL/min，直線洗脫。脫鹽、脫水后將洗脫液配成一定的濃度分裝于凍干管中(每管1 mL)，4℃下放置30 min后，轉(zhuǎn)至－20℃下保存30 min，再置于－80℃中預(yù)凍3 h，最后經(jīng)冷凍干燥機(jī)真空凍干24 h。將制成的蛇毒凍干粉于－20℃中密封保存。

2.2 CVAF的純度和相對(duì)分子量測定

2.2.1 SDS-PAGE 采用不連續(xù)緩沖系統(tǒng)進(jìn)行十二烷基酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，分離膠(T=20%，pH 8.8)和濃縮膠(T=5%，pH 6.8)，以Tris-HCl溶液為緩沖系統(tǒng)，向加樣槽孔中加入20 μL制備好的樣品以及6 μL超低分子量蛋白質(zhì)marker;電泳裝置與電源相連，濃縮膠上所加電壓90 V，當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后，把電壓提至140 V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠的底部，關(guān)閉電源;電泳完畢后，小心取出凝膠，置于染色液中染色過夜;染色完畢后，將凝膠置于脫色液中脫色，并輕輕晃動(dòng)至藍(lán)色背景消失為止。凝膠掃描，記錄條帶，計(jì)算Rf值，用分子量的對(duì)數(shù)作圖，以marker為對(duì)照，計(jì)算樣品分子量。

2.2.2 毛細(xì)管區(qū)帶電泳法(capillary zone electrophoresis，CZE) 電泳分離條件:0.05 mol/L pH 7.4的Tris-HCl緩沖液，1 mL樣品(濃度為1 g/L)放入4℃樣品盒中，壓力(20 psi)進(jìn)樣5 s，毛細(xì)管長60.2 cm，有效內(nèi)徑50 cm×75 μm，檢測波長198 nm，運(yùn)行電壓25 kV，卡盒溫度25℃，運(yùn)行時(shí)間15 min。

2.3 CVAF的鎮(zhèn)痛活性測定

2.3.1 熱板法 選取18～22 g昆明種雌性小鼠50只，基礎(chǔ)痛閾大于5 s小于30 s，測量2次取平均痛閾作為基礎(chǔ)痛閾，按痛閾區(qū)組隨機(jī)化分成生理鹽水正常對(duì)照組、鹽酸嗎啡陽性對(duì)照組和CVAF實(shí)驗(yàn)組(高劑量組、中劑量組和低劑量組)，每組10只。生理鹽水組腹腔注射0.2 mL生理鹽水;鹽酸嗎啡組腹腔注射0.2 mL鹽酸嗎啡(劑量5 mg/kg);CVAF組腹腔注射 0.2 mL CVAF，劑量分別為 0.03 mg/kg、0.1 mg/kg和0.3 mg/kg。以舔后足為痛反應(yīng)指標(biāo)，以小鼠痛反應(yīng)時(shí)間為痛閾，觀察痛閾變化。痛閾提高率(%)=(給藥后痛閾－給藥前基礎(chǔ)痛閾)/生理鹽水組痛閾×100%。

2.3.2 醋酸扭體法 選取18～22 g昆明種小鼠50只，隨機(jī)化分為生理鹽水正常對(duì)照組、鹽酸嗎啡陽性對(duì)照組和CVAF實(shí)驗(yàn)組(高劑量組、中劑量組和低劑量組)，每組10只。室溫22～26℃。生理鹽水組腹腔注射0.2 mL生理鹽水;鹽酸嗎啡組腹腔注射0.2 mL鹽酸嗎啡(劑量5 mg/kg);CVAF組腹腔注射0.2 mL CVAF，劑量分別為0.03 mg/kg、0.1 mg/kg 和 0.3 mg/kg，1 h 后 ip 0.8%醋酸0.1 mL/10 g，以小鼠腹部內(nèi)凹、軀干與后肢伸張、臀部高起、后肢伸長等行為反射稱為完整扭體反應(yīng)1次。觀察15 min以內(nèi)扭體次數(shù)。計(jì)算扭體反應(yīng)抑制率。抑制率(%)=(空白組扭體數(shù) －給藥組扭體數(shù))/空白組扭體數(shù) ×100%。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)來表示，多組均數(shù)比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較用SNK法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。

結(jié) 果

1 CVAF的分離純化

經(jīng)SP Sephadex C-50陽離子交換色譜后呈5個(gè)峰(圖1)，小鼠熱板法預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示第5峰鎮(zhèn)痛活性明顯，取第5峰經(jīng)Sephadex G-50進(jìn)一步純化，得到3個(gè)峰，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示第2峰具有鎮(zhèn)痛活性，收集第2峰洗脫液，裝透析袋，脫鹽、脫水、凍干后呈粉末狀。

Figure 1.Cation-exchange chromatography of crude snake venom on SP Sephadex C-50圖1 粗蛇毒的SP Sephadex C-50陽離子交換色譜圖

2 SDS-PAGE凝膠垂直電泳

結(jié)果顯示CVAF相對(duì)分子質(zhì)量為6 500 D，呈單一條帶，見圖2。

Figure 2.SDS-PAGE analysis of CVAF.圖2CVAF的SDS-PAGE凝膠垂直電泳分析

3 毛細(xì)管區(qū)帶電泳

結(jié)果顯示CVAF樣品為單峰，與SDS-PAGE凝膠垂直電泳結(jié)果基本一致，見圖3。

Figure 3.Capillary zone electrophoresis analysis of CVAF.圖3 CVAF的毛細(xì)管區(qū)帶電泳分析

4 鎮(zhèn)痛活性測定

4.1 熱板法 在小鼠熱板法實(shí)驗(yàn)中測定熱刺激反應(yīng)顯示嗎啡組在給藥0.5 h后達(dá)高峰，6 h鎮(zhèn)痛作用消失;0.5 h時(shí)0.3 mg/kg CVAF組小鼠痛閾與嗎啡組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，0.03 mg/kg、0.1 mg/kg和0.3 mg/kg CVAF在給藥后痛閾提高百分率分別為9.31%、53.78%和79.23%;2 h時(shí)CVAF 0.3 mg/kg組小鼠痛閾與嗎啡組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞ 0.05);0.03 mg/kg、0.1 mg/kg和0.3 mg/kg CVAF在給藥后痛閾提高百分率分別為11.23%、74.44%和117.44%，6 h時(shí)0.3 mg/kg的CVAF組小鼠痛閾與嗎啡組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);0.03 mg/kg、0.1 mg/kg和 0.3 mg/kg CVAF 在給藥后痛閾提高百分率分別為62.81%、95.58%和155.86%;0.03 mg/kg、0.1 mg/kg和 0.3 mg/kg的CVAF在給藥后8 h小鼠痛閾提高百分率分別為42.08%、67.86%和136.17%。CVAF的鎮(zhèn)痛作用自0.5 h開始，且持續(xù)8 h仍存在。上述結(jié)果顯示CVAF能使小鼠對(duì)熱刺激的反應(yīng)時(shí)間延長，且具劑量相關(guān)性，見圖4。

4.2 醋酸扭體法 在醋酸扭體實(shí)驗(yàn)中，腹腔注射0.03 mg/kg、0.1 mg/kg 和0.3 mg/kg CVAF 后，隨著劑量增加，0.1 mg/kg和0.3 mg/kg小鼠扭體次數(shù)與對(duì)照組相比，差異顯著(P＜0.01);0.3 mg/kg小鼠扭體次數(shù)與嗎啡組相比無明顯差異(P＞0.05)。小鼠扭體抑制率分別為27%、50%和70%，說明CVAF能降低小鼠對(duì)化學(xué)刺激引起的敏感性，見表1。

討 論

Figure 4.Analgesic effect of CVAF examined by hot-plate test.Mean ±SD.n=10.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs NS group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs morphine group.圖4 熱板法測定CVAF對(duì)小鼠痛閾的影響

表1 CVAF組分對(duì)小鼠醋酸扭體次數(shù)的影響Table 1.The effect of CVAF on mice in acetic acid writhing test(mean±SD.n=10)

皖南地區(qū)蛇毒資源豐富，蛇毒中有效成分的開發(fā)和應(yīng)用具有廣闊的應(yīng)用前景。蛇毒是一種天然生物毒庫，具有抗凝［3］、鎮(zhèn)痛［4］、抗腫瘤等［5］廣泛的生物學(xué)及藥理學(xué)活性。疼痛是多種疾病引起的常見臨床癥狀，已成為繼呼吸、脈搏、體溫和血壓之后的“第五大生命指征”。臨床常用的鎮(zhèn)痛藥主要為非甾體類抗炎藥和阿片類強(qiáng)效鎮(zhèn)痛藥。前者以阿司匹林為代表，是弱鎮(zhèn)痛藥;后者以嗎啡為代表，是強(qiáng)鎮(zhèn)痛藥。非甾體類抗炎藥具有抗炎、退熱和鎮(zhèn)痛作用，臨床用途較廣，作為鎮(zhèn)痛藥主要用于慢性疼痛。其特點(diǎn)是鎮(zhèn)痛作用溫和，無成癮性。缺點(diǎn)是鎮(zhèn)痛強(qiáng)度不夠，消化道不良反應(yīng)較嚴(yán)重，個(gè)別藥物有心血管不良反應(yīng)、肝毒性或過敏反應(yīng)。阿片類鎮(zhèn)痛藥是麻醉性鎮(zhèn)痛藥，臨床限于急性銳痛的短期止痛，如外科手術(shù)和術(shù)后止痛、骨折及急性內(nèi)臟絞痛，也用于一些終末期患者無法治療的頑固性疼痛，如晚期癌癥的劇烈疼痛。其特點(diǎn)是起效快，鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)。缺點(diǎn)是具有成癮性，耐受性，引起呼吸抑制、內(nèi)分泌機(jī)能減退等嚴(yán)重不良反應(yīng)［6］。目前缺乏作用強(qiáng)但不成癮，可長期安全服用的鎮(zhèn)痛藥。1936年Macht等曾報(bào)道與強(qiáng)鎮(zhèn)痛類藥物如嗎啡相比，眼鏡蛇毒治療因癌組織壓迫神經(jīng)引起疼痛的晚期癌癥病人有顯著療效。與強(qiáng)鎮(zhèn)痛類藥物如嗎啡相比，眼鏡蛇毒制劑無麻醉作用，作用持久，連續(xù)應(yīng)用無耐受，不成癮;相反地在出現(xiàn)療效后用量可遞減。但是鎮(zhèn)痛作用起效較慢以及其它副作用限制其臨床的應(yīng)用。因此，成分復(fù)雜的粗毒中分離純化出純度較高而效果良好的鎮(zhèn)痛組分，并對(duì)其結(jié)構(gòu)性質(zhì)、作用機(jī)制進(jìn)行研究具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用離子交換色譜和排阻層析結(jié)合的方法對(duì)皖南地區(qū)眼鏡蛇粗毒進(jìn)行分離純化篩選得到一種鎮(zhèn)痛因子CVAF，相對(duì)分子量為6.5 kD，從 SDS-PAGE電泳來看可呈單一主帶，可認(rèn)為達(dá)到電泳純。

通過急性生理性疼痛模型小鼠熱板法及化學(xué)致痛模型醋酸扭體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)純化產(chǎn)物具有劑量依賴性的中樞和外周鎮(zhèn)痛作用，熱板法為熱刺激疼痛模型，舔足底動(dòng)作不僅是脊髓反應(yīng)，而且與高級(jí)中樞有關(guān)。小鼠熱板法是通過足部溫度感受器感受熱刺激，信息經(jīng)軀體神經(jīng)的傳入，在有高位中樞參與下完成的軀體縮爪反應(yīng)。熱板法實(shí)驗(yàn)顯示CVAF的鎮(zhèn)痛作用自0.5 h開始，且持續(xù)8 h仍存在。扭體法中0.03 mg/kg、0.1 mg/kg和0.3 mg/kg CVAF 在給藥后小鼠扭體抑制率分別為27%、50%和70%。呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，高劑量組鎮(zhèn)痛效果優(yōu)于嗎啡組。提示CVAF對(duì)化學(xué)物質(zhì)刺激致痛具有明顯的鎮(zhèn)痛作用。熱板法和扭體法致痛的原因、性質(zhì)、傳導(dǎo)途徑、強(qiáng)度各有差別，提示CVAF的鎮(zhèn)痛作用機(jī)制十分復(fù)雜，可能涉及多種通路。疼痛的產(chǎn)生及調(diào)控是涉及多部位多機(jī)制的復(fù)雜過程，目前研究發(fā)現(xiàn)蛇毒鎮(zhèn)痛可能與膽堿能系統(tǒng)［7-8］、NO/cGMP/PKG 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［9-10］、巨噬細(xì)胞活性抑制［11］、內(nèi)源性阿片系統(tǒng)等［12］有關(guān)，接下來我們將建立炎性痛和病理性神經(jīng)痛模型，測定行為學(xué)和血清學(xué)指標(biāo)，從而對(duì)其確切的鎮(zhèn)痛機(jī)制做進(jìn)一步的探討，為臨床鎮(zhèn)痛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

此外在本研究中，為了排除蛇毒自身毒副作用對(duì)動(dòng)物的影響［13］，我們使用功能觀測組合檢查方法觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)治療量的眼鏡蛇毒鎮(zhèn)痛因子對(duì)動(dòng)物的自發(fā)活動(dòng)、進(jìn)食無明顯影響，未發(fā)現(xiàn)異常的體位、活動(dòng)水平和步態(tài);未發(fā)現(xiàn)異常行為如強(qiáng)迫性噬咬、自殘、轉(zhuǎn)圈和后退等;未出現(xiàn)痙攣、震顫、流淚、紅色淚液、流延、腹瀉和嘶咬等表現(xiàn)，說明CVAF的鎮(zhèn)痛效應(yīng)可能與其毒性無關(guān)。

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