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    阻塞性黃疸術(shù)后胰島素抵抗與腸黏膜屏障破壞間的相關(guān)性*

    2013-11-07 06:02:48陳振勇代紅梅涂志剛蔣春舫馮賢松
    中國病理生理雜志 2013年1期
    關(guān)鍵詞:抵抗素屏障黏膜

    陳振勇, 代紅梅, 涂志剛, 楊 鵬, 蔣春舫, 馮賢松

    盡管隨著術(shù)前評(píng)估和術(shù)后護(hù)理的進(jìn)展,阻塞性黃疸(阻黃)(obstructive jaundice,OJ)仍保持較高的發(fā)病率和死亡率,其中關(guān)鍵性的病理生理因素是腸道屏障功能破壞[1],腸通透性增加[2]。其中尚有許多未解之處。術(shù)后胰島素抵抗(insulin resistance,IR)是指繼發(fā)于大手術(shù)后的機(jī)體對(duì)胰島素敏感性下降,組織利用葡萄糖障礙的現(xiàn)象,主要表現(xiàn)在術(shù)后血糖升高,糖耐量異常。嚴(yán)重的術(shù)后IR會(huì)產(chǎn)生多種負(fù)面影響,影響機(jī)體代謝,破壞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,加重組織蛋白分解。臨床研究顯示術(shù)后IR在擇期腹部手術(shù)中普遍存在,發(fā)生的機(jī)制并未完全闡明[3]。而擇期腹部大手術(shù)后均存在腸黏膜屏障的破壞[4],我們前期的實(shí)驗(yàn)研究亦發(fā)現(xiàn)阻黃能破壞腸緊密連接蛋白,損傷腸黏膜屏障,引起內(nèi)毒素血癥和腸細(xì)菌移位。既然這兩者在術(shù)后均普遍存在,那么兩者間是否具有某種聯(lián)系?我們在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以阻黃大鼠為模型,研究兩者間的相關(guān)性。

    材料和方法

    1 動(dòng)物與分組

    50只5周齡Wistar大鼠,雌雄不限,體重(300±20)g,購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部,單籠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按隨機(jī)數(shù)字表法平均分為5組,每組10只。采用10%水合氯醛(0.3 g/kg)腹腔注射麻醉。手術(shù)過程中預(yù)防性給予0.1 mL/g體重的生理鹽水皮下注射。對(duì)照組:即假手術(shù)組,麻醉后僅行開關(guān)腹手術(shù);阻黃組(OJ組):取上腹正中切口,顯露肝十二指腸韌帶,于近肝門處游離并結(jié)扎膽總管;胰高血糖素樣肽2(glucagon-like peptide 2,GLP-2)組:阻黃動(dòng)物腹腔注射GLP-2(美國多肽公司)0.5 mL(250 mg·kg-1·d-1),連續(xù) 7 d;胰島素組(insulin組):阻黃動(dòng)物頸背部皮下注射胰島素(安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司)0.45 U/kg;連續(xù)7 d。

    2 檢測指標(biāo)

    2.1 術(shù)后IR的檢測 手術(shù)前1 d(1 d before operation,1 d BO)、手術(shù)后 2、24、48 h 和 3、7 d 空腹大鼠尾靜脈各采血300 μL。美國雅培公司血糖儀檢測大鼠的空腹血糖(fasting blood glucose,F(xiàn)BG,mmol/L),放射免疫法(北方生物技術(shù)研究所)測定空腹血清胰島素(fasting serum insulin,F(xiàn)INS,mU/L)。使用穩(wěn)態(tài)模式評(píng)估法(homeostasis model assessment,HOMA)計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=FBG×FINS/22.5。各時(shí)點(diǎn)相隔5min采血3次取平均值。

    2.2 乳果糖/甘露醇(lactulose/mannitol,L/M)比值檢測 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別于各時(shí)點(diǎn)采血后自由飲水,經(jīng)胃管每只喂服2 mL檢測溶液(含10%乳果糖100 mg和5%甘露醇50 mg,Sigma)。隨后連續(xù)收集6 h尿液,混勻后取5 mL,加入1 mg硫柳汞作防腐劑,置于-20℃冰箱保存。利用色譜儀分析尿中L/M比值。每只大鼠尿標(biāo)本分3次各取5 mL,重復(fù)測量3次。

    2.3 血清類抵抗素分子β(resistin-like molecule beta,RELMβ)濃度的測定 采用RELMβ ELISA試劑盒(上海天呈生物科技有限公司),100 μL血清標(biāo)本加入96孔板,按說明書操作,通過多波段培養(yǎng)皿閱讀器在420 nm處測量每孔吸光度。測量極限75 ng/L。

    2.4 回腸組織內(nèi)RELMβ mRNA的檢測 采取半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(武漢博士德公司)檢測組織細(xì)胞內(nèi)RELMβ表達(dá)。各組動(dòng)物分別于術(shù)后第8 d拉脫法處死。無菌取原手術(shù)切口,距回盲部10 cm處環(huán)形切取回腸,取1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊,提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以此為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增片段及引物[5]:上游引物5’-CCC TTC TCC AGC TGA TCA AC-3’,下游引物 5’-CCA CGA ACC ACA GCC ATA G-3’;以β-actin作為內(nèi)參照,上游引物5’-TTG CCT CTC AGA CAA TGC CTG-3’,下游引物5’-TCG CTC CTG GAA GAT GGT GAT-3’。循環(huán)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃ 30 s,58℃ 1 min;72℃ 1 min;共35個(gè)循環(huán),最后72℃ 7 min。PCR產(chǎn)物通過12%瓊脂糖凝膠電泳,并用密度掃描分析PCR產(chǎn)物帶。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,采用SPSS 13.0分析,組間計(jì)量資料比較,方差齊時(shí)采用單因素方差分析及配對(duì)資料t檢驗(yàn),方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 阻黃術(shù)后IR指數(shù)的變化

    阻黃和對(duì)照組動(dòng)物術(shù)后IR指數(shù)均明顯升高,與術(shù)前相比,對(duì)照組術(shù)后48 h IR指數(shù)達(dá)到最高(8.8±1.9),阻黃組術(shù)后 3 d 為最高(10.1 ±1.8),均明顯高于其它時(shí)點(diǎn)(均P<0.05),見圖1。

    Figure 1.The changes of index of IR after operation.BO:before operation.Mean ±SD.n=10.#P <0.05 vs other time points in control group;△P <0.05 vs other time points in OJ group.圖1 阻黃術(shù)后IR指數(shù)的變化

    2 阻黃術(shù)后L/M的變化

    L/M比值是反映腸黏膜通透性的指標(biāo)。對(duì)照組術(shù)后有所上升,但各時(shí)點(diǎn)的上升幅度沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),阻黃組術(shù)后明顯上升,其中3 d組達(dá)到最高值 0.66 ±0.08(P <0.05),7 d 組開始下降,但仍高于其它時(shí)點(diǎn),見圖2。

    Figure 2.The changes of ratio of L/M after operation.Mean ±SD.n=10.#P < 0.05 vs other time points in OJ group.圖2 阻黃術(shù)后L/M的變化

    3 IR與L/M比值變化間的相關(guān)性

    將術(shù)后IR與L/M比值的變化進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果兩者的相關(guān)系數(shù)r=0.86(P<0.05),呈明顯正相關(guān)。

    4 GLP-2組術(shù)后IR的變化

    GLP-2是一種腸黏膜保護(hù)劑[6],能恢復(fù)受損的腸黏膜。腹腔注射GLP-2后術(shù)后IR指數(shù)較阻黃組下降,其中7 d組從7.33 ±1.07 降至4.62 ±0.53,降幅達(dá)37.0%,為各時(shí)點(diǎn)最大降幅(P <0.05),見圖3。

    Figure 3.The changes of index of IR after operation in GLP-2 group.Mean ±SD.n=10.#P <0.05 vs OJ group.圖3 GLP-2組術(shù)后IR的變化

    5 胰島素組術(shù)后L/M的變化

    研究顯示圍手術(shù)期強(qiáng)化胰島素治療可以降低術(shù)后IR[7]。使用胰島素后L/M在3 d和7 d較阻黃組明顯降低,其中3 d組從0.66±0.08降至阻黃組的0.35 ±0.04,降幅最大達(dá)46.7%(P <0.05),見圖4。

    Figure 4.The changes of ratio of L/M in insulin and OJ groups.Mean±SD.n=10.#P <0.05 vs other time points in OJ group.圖4 胰島素組和阻黃組術(shù)后L/M的變化

    6 術(shù)后IR與腸黏膜屏障間的聯(lián)系

    用ELISA檢測阻黃組不同時(shí)點(diǎn)血清RELMβ的含量,結(jié)果阻黃動(dòng)物術(shù)后3 d RELMβ血清含量達(dá)到最高[(0.69 ±0.05)μg/L],見圖 5A,分別與術(shù)后IR指數(shù)變化的相關(guān)度r=0.955(P<0.05),與L/M變化的相關(guān)系數(shù)r=0.736(P<0.05)。由于RELMβ在腸道組織內(nèi)特異性表達(dá),我們進(jìn)一步研究末端回腸上皮細(xì)胞內(nèi)RELMβ mRNA的表達(dá)。半定量PCR顯示各組相對(duì)RELMβ mRNA水平均高于對(duì)照組,與血清濃度不同的是 GLP-2組上皮組織內(nèi) RELMβ mRNA相對(duì)含量高于胰島素組,見圖5B。

    7 各組血清RELMβ含量

    由于GLP-2和胰島素可以分別影響腸黏膜屏障和IR,我們研究兩者對(duì)血清RELMβ含量的影響,結(jié)果各組均高于對(duì)照組(P<0.01),其中阻黃組最高達(dá)(0.41 ±0.04)μg/L,GLP-2 組與胰島素組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見圖6。

    討 論

    術(shù)后IR在腹部手術(shù)后普遍存在[2],發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜,一般認(rèn)為與抗調(diào)節(jié)激素(如生長激素、促腎上腺皮質(zhì)激素、抗利尿激素、胰高血糖素、糖皮質(zhì)激素和兒茶酚胺)、細(xì)胞因子(IL-1、IL-6和 TNF-α)的大量釋放及外周組織胰島素抵抗密切相關(guān)。而外周組織胰島素抵抗又與胰島素受體有關(guān),并可初步區(qū)分為受體前、受體和受體后機(jī)制[8]。

    臨床和實(shí)驗(yàn)均觀察到腹部大手術(shù)后存在腸黏膜屏障的破壞[4],我們前期以阻黃動(dòng)物模型為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,研究發(fā)現(xiàn)阻黃手術(shù)后腸緊密連接蛋白數(shù)量和分布受損,緊密連接通道開放,腸黏膜屏障通透性增加,出現(xiàn)腸細(xì)菌移位和內(nèi)毒素血癥。既然這兩者在術(shù)后均普遍存在,那么兩者間是否具有某種聯(lián)系?

    Figure 5.The changes of serum RELMβ concentration detected by ELISA(A)and the expression of RELMβ mRNA detected by RT-PCR(B).1:control;2:OJ;3:insulin;4:GLP -2.Mean ±SD.n=10.#P <0.05 vs insulin group;*P <0.05 vs control group.圖5 血清RELM β的含量和組織內(nèi)RELMβ mRNA表達(dá)

    Figure 6.Serum RELMβ concentration.Mean±SD.n=10.#P <0.05 vs control group.圖6 各組血清RELMβ含量

    我們的研究發(fā)現(xiàn)阻黃術(shù)后IR和腸黏膜屏障的破壞間具有明顯相關(guān)。阻黃術(shù)后IR指數(shù)增加,阻黃組和假手術(shù)組術(shù)后IR指數(shù)均遠(yuǎn)高于術(shù)前,說明手術(shù)后均存在IR。阻黃組術(shù)后3 d IR指數(shù)達(dá)到最高(10.1±1.8),且反映腸黏膜通透性的指標(biāo)L/M比值也在術(shù)后3 d達(dá)到最高(0.66±0.08),兩者的相關(guān)系數(shù)r=0.86,說明兩者間的變化具有同步性。

    既然兩者有相關(guān)性,那么改變其中一個(gè)因素是否也能影響另外一個(gè)因素?GLP-2能保護(hù)并恢復(fù)受損的腸黏膜屏障。結(jié)果阻黃動(dòng)物使用GLP-2后術(shù)后IR指數(shù)較未用者下降。同樣,注射胰島素后,阻黃動(dòng)物3 d組的L/M降幅最大46.7%。說明兩者間可以互相影響。

    由于腸黏膜屏障的產(chǎn)生基礎(chǔ)是腸黏膜上皮細(xì)胞及其相互間的緊密連接,因此我們的研究顯示腸道上皮細(xì)胞既是術(shù)后IR產(chǎn)生的來源,也是IR作用的靶器官。在應(yīng)激狀態(tài)下,腸上皮細(xì)胞分泌抗調(diào)節(jié)激素,參與術(shù)后IR形成,同時(shí)增高的激素水平反過來也損傷腸上皮細(xì)胞,破壞腸黏膜屏障。因此使用腸黏膜屏障保護(hù)劑GLP-2,減少了腸上皮分泌抗調(diào)節(jié)激素和細(xì)胞因子,達(dá)到降低IR的作用。而術(shù)后強(qiáng)化胰島素治療,可以降低術(shù)后IR,也間接保護(hù)了腸黏膜屏障。

    那兩者間有什么內(nèi)在聯(lián)系?或者說其交匯點(diǎn)是什么?Steppan等[9]于2001年首次提出抵抗素(resistin)為肥胖與糖尿病的聯(lián)系所在,出現(xiàn)IR的小鼠抵抗素顯著增高。抵抗素參與2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制,并且2型糖尿病患者中,IR組的抵抗素水平要明顯高于胰島素敏感組[10]。隨后一系列的研究發(fā)現(xiàn)該家族的其它成員,包括類抵抗素分子RELMα、β、γ和resistin[11]。這些家族成員由105~114個(gè)氨基酸組成,有3個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域:N端信號(hào)肽、中間可變區(qū)和相對(duì)保守的富含11個(gè)半胱氨酸的C端序列[12]。其中RELMβ也稱作腸道特異性抵抗素,高度局限于腸杯狀細(xì)胞[13],參與維持胃腸道屏障功能[14],與腸道上皮細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[15]。

    用ELISA檢測阻黃組不同時(shí)段血清RELMβ的含量,結(jié)果阻黃動(dòng)物術(shù)后3 d組RELMβ血清含量達(dá)到最高(0.69±0.05)μg/L,分別與術(shù)后 IR 指數(shù)變化呈正相關(guān),說明血清RELMβ含量與術(shù)后IR的變化有關(guān)。通過RT-PCR研究末端回腸上皮細(xì)胞內(nèi)RELMβ的表達(dá),顯示各時(shí)點(diǎn)組織細(xì)胞內(nèi)相對(duì)RELMβ mRNA水平均高于對(duì)照組,說明阻黃術(shù)后短期內(nèi)血液和組織細(xì)胞內(nèi)RELMβ水平上升,與術(shù)后IR有一致性。同時(shí)阻黃術(shù)后使用GLP-2和強(qiáng)化胰島素治療,RELMβ相對(duì)含量均上升較多,從另一個(gè)角度更加反映RELMβ與術(shù)后腸黏膜屏障和IR有關(guān)。說明改善腸黏膜屏障和術(shù)后強(qiáng)化胰島素治療可以提升血清和組織內(nèi)RELMβ含量,其變化與術(shù)后腸黏膜屏障和IR具有一致性。

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