阻塞性黃疸術(shù)后胰島素抵抗與腸黏膜屏障破壞間的相關(guān)性*

陳振勇， 代紅梅， 涂志剛， 楊 鵬， 蔣春舫， 馮賢松

盡管隨著術(shù)前評(píng)估和術(shù)后護(hù)理的進(jìn)展，阻塞性黃疸(阻黃)(obstructive jaundice，OJ)仍保持較高的發(fā)病率和死亡率，其中關(guān)鍵性的病理生理因素是腸道屏障功能破壞［1］，腸通透性增加［2］。其中尚有許多未解之處。術(shù)后胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是指繼發(fā)于大手術(shù)后的機(jī)體對(duì)胰島素敏感性下降，組織利用葡萄糖障礙的現(xiàn)象，主要表現(xiàn)在術(shù)后血糖升高，糖耐量異常。嚴(yán)重的術(shù)后IR會(huì)產(chǎn)生多種負(fù)面影響，影響機(jī)體代謝，破壞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，加重組織蛋白分解。臨床研究顯示術(shù)后IR在擇期腹部手術(shù)中普遍存在，發(fā)生的機(jī)制并未完全闡明［3］。而擇期腹部大手術(shù)后均存在腸黏膜屏障的破壞［4］，我們前期的實(shí)驗(yàn)研究亦發(fā)現(xiàn)阻黃能破壞腸緊密連接蛋白，損傷腸黏膜屏障，引起內(nèi)毒素血癥和腸細(xì)菌移位。既然這兩者在術(shù)后均普遍存在，那么兩者間是否具有某種聯(lián)系?我們在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以阻黃大鼠為模型，研究兩者間的相關(guān)性。

材料和方法

1 動(dòng)物與分組

50只5周齡Wistar大鼠，雌雄不限，體重(300±20)g，購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，單籠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按隨機(jī)數(shù)字表法平均分為5組，每組10只。采用10%水合氯醛(0.3 g/kg)腹腔注射麻醉。手術(shù)過程中預(yù)防性給予0.1 mL/g體重的生理鹽水皮下注射。對(duì)照組:即假手術(shù)組，麻醉后僅行開關(guān)腹手術(shù);阻黃組(OJ組):取上腹正中切口，顯露肝十二指腸韌帶，于近肝門處游離并結(jié)扎膽總管;胰高血糖素樣肽2(glucagon-like peptide 2，GLP-2)組:阻黃動(dòng)物腹腔注射GLP-2(美國多肽公司)0.5 mL(250 mg·kg－1·d－1)，連續(xù) 7 d;胰島素組(insulin組):阻黃動(dòng)物頸背部皮下注射胰島素(安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司)0.45 U/kg;連續(xù)7 d。

2 檢測指標(biāo)

2.1 術(shù)后IR的檢測 手術(shù)前1 d(1 d before operation，1 d BO)、手術(shù)后 2、24、48 h 和 3、7 d 空腹大鼠尾靜脈各采血300 μL。美國雅培公司血糖儀檢測大鼠的空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG，mmol/L)，放射免疫法(北方生物技術(shù)研究所)測定空腹血清胰島素(fasting serum insulin，F(xiàn)INS，mU/L)。使用穩(wěn)態(tài)模式評(píng)估法(homeostasis model assessment，HOMA)計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=FBG×FINS/22.5。各時(shí)點(diǎn)相隔5min采血3次取平均值。

2.2 乳果糖/甘露醇(lactulose/mannitol，L/M)比值檢測 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別于各時(shí)點(diǎn)采血后自由飲水，經(jīng)胃管每只喂服2 mL檢測溶液(含10%乳果糖100 mg和5%甘露醇50 mg，Sigma)。隨后連續(xù)收集6 h尿液，混勻后取5 mL，加入1 mg硫柳汞作防腐劑，置于－20℃冰箱保存。利用色譜儀分析尿中L/M比值。每只大鼠尿標(biāo)本分3次各取5 mL，重復(fù)測量3次。

2.3 血清類抵抗素分子β(resistin-like molecule beta，RELMβ)濃度的測定 采用RELMβ ELISA試劑盒(上海天呈生物科技有限公司)，100 μL血清標(biāo)本加入96孔板，按說明書操作，通過多波段培養(yǎng)皿閱讀器在420 nm處測量每孔吸光度。測量極限75 ng/L。

2.4 回腸組織內(nèi)RELMβ mRNA的檢測 采取半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(武漢博士德公司)檢測組織細(xì)胞內(nèi)RELMβ表達(dá)。各組動(dòng)物分別于術(shù)后第8 d拉脫法處死。無菌取原手術(shù)切口，距回盲部10 cm處環(huán)形切取回腸，取1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增片段及引物［5］:上游引物5’-CCC TTC TCC AGC TGA TCA AC-3’，下游引物 5’-CCA CGA ACC ACA GCC ATA G-3’;以β-actin作為內(nèi)參照，上游引物5’-TTG CCT CTC AGA CAA TGC CTG-3’，下游引物5’-TCG CTC CTG GAA GAT GGT GAT-3’。循環(huán)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃ 30 s，58℃ 1 min;72℃ 1 min;共35個(gè)循環(huán)，最后72℃ 7 min。PCR產(chǎn)物通過12%瓊脂糖凝膠電泳，并用密度掃描分析PCR產(chǎn)物帶。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0分析，組間計(jì)量資料比較，方差齊時(shí)采用單因素方差分析及配對(duì)資料t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 阻黃術(shù)后IR指數(shù)的變化

阻黃和對(duì)照組動(dòng)物術(shù)后IR指數(shù)均明顯升高，與術(shù)前相比，對(duì)照組術(shù)后48 h IR指數(shù)達(dá)到最高(8.8±1.9)，阻黃組術(shù)后 3 d 為最高(10.1 ±1.8)，均明顯高于其它時(shí)點(diǎn)(均P＜0.05)，見圖1。

Figure 1.The changes of index of IR after operation.BO:before operation.Mean ±SD.n=10.#P ＜0.05 vs other time points in control group;△P ＜0.05 vs other time points in OJ group.圖1 阻黃術(shù)后IR指數(shù)的變化

2 阻黃術(shù)后L/M的變化

L/M比值是反映腸黏膜通透性的指標(biāo)。對(duì)照組術(shù)后有所上升，但各時(shí)點(diǎn)的上升幅度沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)，阻黃組術(shù)后明顯上升，其中3 d組達(dá)到最高值 0.66 ±0.08(P ＜0.05)，7 d 組開始下降，但仍高于其它時(shí)點(diǎn)，見圖2。

Figure 2.The changes of ratio of L/M after operation.Mean ±SD.n=10.#P ＜ 0.05 vs other time points in OJ group.圖2 阻黃術(shù)后L/M的變化

3 IR與L/M比值變化間的相關(guān)性

將術(shù)后IR與L/M比值的變化進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果兩者的相關(guān)系數(shù)r=0.86(P＜0.05)，呈明顯正相關(guān)。

4 GLP-2組術(shù)后IR的變化

GLP-2是一種腸黏膜保護(hù)劑［6］，能恢復(fù)受損的腸黏膜。腹腔注射GLP-2后術(shù)后IR指數(shù)較阻黃組下降，其中7 d組從7.33 ±1.07 降至4.62 ±0.53，降幅達(dá)37.0%，為各時(shí)點(diǎn)最大降幅(P ＜0.05)，見圖3。

Figure 3.The changes of index of IR after operation in GLP－2 group.Mean ±SD.n=10.#P ＜0.05 vs OJ group.圖3 GLP-2組術(shù)后IR的變化

5 胰島素組術(shù)后L/M的變化

研究顯示圍手術(shù)期強(qiáng)化胰島素治療可以降低術(shù)后IR［7］。使用胰島素后L/M在3 d和7 d較阻黃組明顯降低，其中3 d組從0.66±0.08降至阻黃組的0.35 ±0.04，降幅最大達(dá)46.7%(P ＜0.05)，見圖4。

Figure 4.The changes of ratio of L/M in insulin and OJ groups.Mean±SD.n=10.#P ＜0.05 vs other time points in OJ group.圖4 胰島素組和阻黃組術(shù)后L/M的變化

6 術(shù)后IR與腸黏膜屏障間的聯(lián)系

用ELISA檢測阻黃組不同時(shí)點(diǎn)血清RELMβ的含量，結(jié)果阻黃動(dòng)物術(shù)后3 d RELMβ血清含量達(dá)到最高［(0.69 ±0.05)μg/L］，見圖 5A，分別與術(shù)后IR指數(shù)變化的相關(guān)度r=0.955(P＜0.05)，與L/M變化的相關(guān)系數(shù)r=0.736(P＜0.05)。由于RELMβ在腸道組織內(nèi)特異性表達(dá)，我們進(jìn)一步研究末端回腸上皮細(xì)胞內(nèi)RELMβ mRNA的表達(dá)。半定量PCR顯示各組相對(duì)RELMβ mRNA水平均高于對(duì)照組，與血清濃度不同的是 GLP-2組上皮組織內(nèi) RELMβ mRNA相對(duì)含量高于胰島素組，見圖5B。

7 各組血清RELMβ含量

由于GLP-2和胰島素可以分別影響腸黏膜屏障和IR，我們研究兩者對(duì)血清RELMβ含量的影響，結(jié)果各組均高于對(duì)照組(P＜0.01)，其中阻黃組最高達(dá)(0.41 ±0.04)μg/L，GLP-2 組與胰島素組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖6。

討 論

術(shù)后IR在腹部手術(shù)后普遍存在［2］，發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，一般認(rèn)為與抗調(diào)節(jié)激素(如生長激素、促腎上腺皮質(zhì)激素、抗利尿激素、胰高血糖素、糖皮質(zhì)激素和兒茶酚胺)、細(xì)胞因子(IL-1、IL-6和 TNF-α)的大量釋放及外周組織胰島素抵抗密切相關(guān)。而外周組織胰島素抵抗又與胰島素受體有關(guān)，并可初步區(qū)分為受體前、受體和受體后機(jī)制［8］。

臨床和實(shí)驗(yàn)均觀察到腹部大手術(shù)后存在腸黏膜屏障的破壞［4］，我們前期以阻黃動(dòng)物模型為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究發(fā)現(xiàn)阻黃手術(shù)后腸緊密連接蛋白數(shù)量和分布受損，緊密連接通道開放，腸黏膜屏障通透性增加，出現(xiàn)腸細(xì)菌移位和內(nèi)毒素血癥。既然這兩者在術(shù)后均普遍存在，那么兩者間是否具有某種聯(lián)系?

Figure 5.The changes of serum RELMβ concentration detected by ELISA(A)and the expression of RELMβ mRNA detected by RT-PCR(B).1:control;2:OJ;3:insulin;4:GLP －2.Mean ±SD.n=10.#P ＜0.05 vs insulin group;*P ＜0.05 vs control group.圖5 血清RELM β的含量和組織內(nèi)RELMβ mRNA表達(dá)

Figure 6.Serum RELMβ concentration.Mean±SD.n=10.#P ＜0.05 vs control group.圖6 各組血清RELMβ含量

我們的研究發(fā)現(xiàn)阻黃術(shù)后IR和腸黏膜屏障的破壞間具有明顯相關(guān)。阻黃術(shù)后IR指數(shù)增加，阻黃組和假手術(shù)組術(shù)后IR指數(shù)均遠(yuǎn)高于術(shù)前，說明手術(shù)后均存在IR。阻黃組術(shù)后3 d IR指數(shù)達(dá)到最高(10.1±1.8)，且反映腸黏膜通透性的指標(biāo)L/M比值也在術(shù)后3 d達(dá)到最高(0.66±0.08)，兩者的相關(guān)系數(shù)r=0.86，說明兩者間的變化具有同步性。

既然兩者有相關(guān)性，那么改變其中一個(gè)因素是否也能影響另外一個(gè)因素?GLP-2能保護(hù)并恢復(fù)受損的腸黏膜屏障。結(jié)果阻黃動(dòng)物使用GLP-2后術(shù)后IR指數(shù)較未用者下降。同樣，注射胰島素后，阻黃動(dòng)物3 d組的L/M降幅最大46.7%。說明兩者間可以互相影響。

由于腸黏膜屏障的產(chǎn)生基礎(chǔ)是腸黏膜上皮細(xì)胞及其相互間的緊密連接，因此我們的研究顯示腸道上皮細(xì)胞既是術(shù)后IR產(chǎn)生的來源，也是IR作用的靶器官。在應(yīng)激狀態(tài)下，腸上皮細(xì)胞分泌抗調(diào)節(jié)激素，參與術(shù)后IR形成，同時(shí)增高的激素水平反過來也損傷腸上皮細(xì)胞，破壞腸黏膜屏障。因此使用腸黏膜屏障保護(hù)劑GLP-2，減少了腸上皮分泌抗調(diào)節(jié)激素和細(xì)胞因子，達(dá)到降低IR的作用。而術(shù)后強(qiáng)化胰島素治療，可以降低術(shù)后IR，也間接保護(hù)了腸黏膜屏障。

那兩者間有什么內(nèi)在聯(lián)系?或者說其交匯點(diǎn)是什么?Steppan等［9］于2001年首次提出抵抗素(resistin)為肥胖與糖尿病的聯(lián)系所在，出現(xiàn)IR的小鼠抵抗素顯著增高。抵抗素參與2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制，并且2型糖尿病患者中，IR組的抵抗素水平要明顯高于胰島素敏感組［10］。隨后一系列的研究發(fā)現(xiàn)該家族的其它成員，包括類抵抗素分子RELMα、β、γ和resistin［11］。這些家族成員由105～114個(gè)氨基酸組成，有3個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域:N端信號(hào)肽、中間可變區(qū)和相對(duì)保守的富含11個(gè)半胱氨酸的C端序列［12］。其中RELMβ也稱作腸道特異性抵抗素，高度局限于腸杯狀細(xì)胞［13］，參與維持胃腸道屏障功能［14］，與腸道上皮細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［15］。

用ELISA檢測阻黃組不同時(shí)段血清RELMβ的含量，結(jié)果阻黃動(dòng)物術(shù)后3 d組RELMβ血清含量達(dá)到最高(0.69±0.05)μg/L，分別與術(shù)后 IR 指數(shù)變化呈正相關(guān)，說明血清RELMβ含量與術(shù)后IR的變化有關(guān)。通過RT-PCR研究末端回腸上皮細(xì)胞內(nèi)RELMβ的表達(dá)，顯示各時(shí)點(diǎn)組織細(xì)胞內(nèi)相對(duì)RELMβ mRNA水平均高于對(duì)照組，說明阻黃術(shù)后短期內(nèi)血液和組織細(xì)胞內(nèi)RELMβ水平上升，與術(shù)后IR有一致性。同時(shí)阻黃術(shù)后使用GLP-2和強(qiáng)化胰島素治療，RELMβ相對(duì)含量均上升較多，從另一個(gè)角度更加反映RELMβ與術(shù)后腸黏膜屏障和IR有關(guān)。說明改善腸黏膜屏障和術(shù)后強(qiáng)化胰島素治療可以提升血清和組織內(nèi)RELMβ含量，其變化與術(shù)后腸黏膜屏障和IR具有一致性。

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