CARP1基因克隆、表達(dá)及其泛素連接酶活性的鑒定

張睿 ，蘇文莉 ，孫走南 ，楊益 ，劉京梅 ，何湘

1.遼寧省腫瘤醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110042；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 疾病預(yù)防控制所，北京 100071

大腸癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年增加的趨勢(shì)。研究大腸癌的發(fā)生機(jī)制，有助于腫瘤的早期診斷、治療。我們?cè)谇捌诠ぷ髦邪l(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，結(jié)腸癌患者組織標(biāo)本中caspase 8/10相關(guān)RING結(jié)構(gòu)域蛋白1（caspase-8/10-associated RING domain protein1，CARP1）基因表達(dá)量顯著增高。因此，為了更進(jìn)一步研究CARP1在不同信號(hào)通路的功能，我們克隆了CARP1的全長(zhǎng)基因，并構(gòu)建了其真核表達(dá)載體，在293T細(xì)胞中進(jìn)行了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)表達(dá)的CARP1具有相應(yīng)的生物學(xué)功能，為下一步研究奠定了工作基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

293T細(xì)胞、HCT116細(xì)胞、大腸桿菌DH5α、真核表達(dá)載體pcDNA3-Flag、受體相互作用蛋白1（recep?tor-interacting protein 1，RIP1）表 達(dá) 質(zhì) 粒 Flag-RIP1、泛素表達(dá)質(zhì)粒HA-Ubi由本實(shí)驗(yàn)室保存；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ和cDNA合成試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；T4DNA快速連接酶購(gòu)自全氏金公司；蛋白酶體抑制劑MG132購(gòu)自Sigma公司；螢光素酶活性測(cè)定試劑盒購(gòu)自Promega公司；轉(zhuǎn)染試劑Vigo?fect購(gòu)自威格拉斯公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO生物公司；胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品；Flag抗體購(gòu)自Sigma公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)自中杉金橋生物有限公司；膠內(nèi)DNA回收試劑盒、大量質(zhì)粒提取試劑盒、TRIzol試劑和Pfu DNA聚合酶Mix購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；引物合成和測(cè)序由奧科公司完成。

1.2 從結(jié)腸癌細(xì)胞中擴(kuò)增CARP1基因

參考TRIzol使用說(shuō)明，從HCT116細(xì)胞中提取總RNA。根據(jù)CARP1的基因序列（GenBank登錄號(hào)：NM_025126.2）和pcDNA3-Flag載體的多克隆位點(diǎn)，選擇BamHⅠ和XhoⅠ作為酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)上游引物5'-CGGGATCCatgaaggcgggtgccacgtctatg-3'（劃線部分為BamHⅠ位點(diǎn)）、下游引物5'-CCGCTCGAGtcag?gacttgaacacgtg-3'（劃線部分為XhoⅠ位點(diǎn)），以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增CARP1基因片段。反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，確定分子量正確后，回收目的基因。

1.3 CARP1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

將回收的擴(kuò)增產(chǎn)物和pcDNA3-Flag質(zhì)粒分別用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后回收。將雙酶切的目的基因與pcDNA3-Flag載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，氨芐西林平板培養(yǎng)過(guò)夜。挑選候選陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定后的克隆送奧科公司測(cè)序。Myc-CARP1構(gòu)建采用亞克隆方法，構(gòu)建至Myc-tag3B載體。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及免疫印跡分析

HCT116細(xì)胞、293T細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染按說(shuō)明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染前24 h將293T細(xì)胞接種于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)板中。將質(zhì)粒與200 μL生理鹽水混合，再將2 μL Vigofect與200 μL生理鹽水混合，靜置混勻后將兩者輕輕混合，室溫放置15 min，加入培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用1×PBS洗細(xì)胞3次，用裂解液裂解后，加入SDS上樣緩沖液［50 mmol/L Tris-HCl（pH6.8），2%SDS，0.1%溴酚藍(lán)，10%甘油，2.5% β-巰基乙醇］，沸水浴5 min，離心后取上清進(jìn)行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫孵育1 h，然后加入稀釋的Flag特異抗體4℃孵育過(guò)夜。用TBST洗膜3次，加入稀釋的HRP偶聯(lián)的羊抗鼠IgG，室溫孵育1 h，用TBST洗膜3次，暗室中顯影。

1.5 免疫共沉淀分析

質(zhì)粒Flag-RIP1、HA-Ubi與Myc-CARP1共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，以僅轉(zhuǎn)染Flag-RIP1、僅轉(zhuǎn)染Flag-RIP1和HA-Ubi為對(duì)照。按上述方法收取細(xì)胞，用含2%SDS的細(xì)胞裂解液［2%SDS，150 mmol/L NaCl，10 mmol/LTris-HCl（pH8.0），2mmol/LNa3VO4，50 mmol/L NaF，1×蛋白酶體抑制劑］裂解細(xì)胞，沸水浴10 min，離心后取上清，加入10倍體積的稀釋緩沖液［10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），150 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA，1%Triton X-100］，樣品混勻后加入20 μL抗Flag抗體瓊脂糖珠（Sigma公司）進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，在4℃冰箱中旋轉(zhuǎn)孵育2 h，孵育結(jié)束后3000 r/min離心1 min，棄上清，沉淀用洗滌緩沖液［10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1%NP-40］800 μL重懸，重復(fù)3次，最后一次離心沉淀的珠子中加入1×SDS上樣緩沖液，沸水浴5 min，利用免疫印跡對(duì)蛋白的泛素化進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 螢光素酶活性檢測(cè)

按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。細(xì)胞接種于24孔板中 ，將 質(zhì) 粒 pcDNA3-Flag-CARP1（0.1 μg/孔）、NF-κB-luc（0.1 μg/孔）、pRL（0.002 μg/孔）共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，18 h后加入10 ng/μL TNFα處理6 h，用PBS洗2次，在每孔中加入100 μL裂解緩沖液，室溫輕搖15 min，取50 μL測(cè)定螢光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116總RNA的提取

用TRIzol法提取HCT116細(xì)胞系總RNA，從圖1中可以看到提取的總RNA有清晰的5S、18S、28S條帶。

2.2 CARP1基因的擴(kuò)增

以HCT116細(xì)胞系的cDNA為模板擴(kuò)增CARP1基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在1000 bp左右出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增條帶（圖2），與預(yù)期的CARP1基因長(zhǎng)度一致。

2.3 重組pcDNA3-Flag-CARP1質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將雙酶切的pcDNA3-Flag和目的片段CARP1連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，克隆長(zhǎng)出后，用含氨芐西林的LB培養(yǎng)基進(jìn)行菌液擴(kuò)增，并用PCR檢測(cè)是否含有CARP1片段。從圖3A中可以看到1、2克隆中有CARP1插入片段；取1號(hào)克隆菌液提取質(zhì)粒，經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后在1000 bp左右出現(xiàn)預(yù)期條帶（圖3B）。將1號(hào)克隆測(cè)序，比對(duì)發(fā)現(xiàn)CARP1測(cè)定序列與報(bào)道一致。

2.4 pcDNA3-Flag-CARP1在293T細(xì)胞中的表達(dá)

pcDNA3-Flag空載體和pcDNA3-Flag-CARP1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，用裂解液裂解后經(jīng)SDS-PAGE分離，Western印跡結(jié)果（圖4）顯示，與空載體對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3-Flag-CARP1的細(xì)胞中在相對(duì)分子質(zhì)量30×103～55×103之間有一條特異性條帶，與預(yù)期大小37×103相符，表明pcDNA3-Flag-CARP1在293T細(xì)胞中獲得了表達(dá)。

圖1 HCT116細(xì)胞總RNA的鑒定

圖2 PCR擴(kuò)增CARP1基因

圖3 重組質(zhì)粒的PCR（A）及酶切鑒定（B）

2.5 CARP1對(duì)RIP1泛素化及NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響

從免疫共沉淀結(jié)果（圖5A）可以看到，如果不加入CARP1，RIP1可見(jiàn)較弱的泛素化，而加入CARP1后RIP1泛素化明顯增強(qiáng)。有文獻(xiàn)報(bào)道，CARP1可以通過(guò)泛素化RIP1抑制TNFα激活NF-κB的功能。將pcDNA3-Flag空質(zhì)?；騪cDNA3-Flag-CARP1和NF-κB-luc及pRL質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞，4 h后換液，收細(xì)胞前6 h加入10 ng/mL TNFα刺激。從圖5B可以看到，加入TNFα后，NF-κB活性增加了6倍，轉(zhuǎn)染pcDNA3-Flag-CARP1后，TNFα引起的NF-κB升高的活性被明顯抑制。這些結(jié)果提示我們，構(gòu)建的pcDNA3-Flag-CARP1具有生物學(xué)活性。

圖4 Western印跡鑒定CARP1在293T細(xì)胞中的表達(dá)

圖5 CARP1活性檢測(cè)

2.6 CARP1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系生長(zhǎng)的影響

將pcDNA3-Flag空質(zhì)?；騪cDNA3-Flag-CARP1分別轉(zhuǎn)染相同數(shù)量的HCT116細(xì)胞，在24、48、72、96 h收取細(xì)胞計(jì)數(shù)并做圖（圖6），可以看到CARP1基因促進(jìn)HCT116細(xì)胞的生長(zhǎng)（P＜0.05）。順鉑（cisplatin，CDDP）是化療常用藥物，可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。從圖6我們可以看到，在細(xì)胞中加入CDDP（5 μg/mL），HCT116 細(xì)胞的生長(zhǎng)受到了明顯抑制；而細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CARP1時(shí)，CDDP的生長(zhǎng)抑制作用減弱（P＜0.01）。進(jìn)一步說(shuō)明CARP1促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，并可以部分抵抗化療藥物引起的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。

圖6 CARP1基因?qū)?xì)胞生長(zhǎng)的影響

3 討論

2004年El-Deiry等報(bào)道，CARP1可以泛素化caspase-8和-10，引起這2個(gè)蛋白通過(guò)蛋白酶體降解，從而抑制caspase-8和-10介導(dǎo)的凋亡[1]。CARP1含有一個(gè)RING鋅指結(jié)構(gòu)域，是泛素連接酶常見(jiàn)的結(jié)構(gòu)域。CARP1的RING鋅指結(jié)構(gòu)域與牛小腸堿性磷酸酶（cIAP）結(jié)構(gòu)域的同源性很高，而cIAP不具備降解caspase-8和-10的活性。文獻(xiàn)還報(bào)道了CARP1可以泛素化從而降解抑癌基因p53，并降低p53ser20磷酸化水平[2-4]。另外，CARP1還參與到腫瘤壞死因子受體（TNFR）復(fù)合物中，通過(guò)蛋白酶體途徑降解泛素化的RIP1，從而降低NF-κB的活性[5]。為了研究該基因的功能，我們從HCT116細(xì)胞cDNA文庫(kù)中克隆了CARP1基因，構(gòu)建了其真核表達(dá)載體pcDNA3-Flag-CARP1，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，利用Western印跡證實(shí)該表達(dá)載體能夠在293T細(xì)胞中表達(dá)，最后利用體內(nèi)泛素化實(shí)驗(yàn)及螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)到構(gòu)建的CARP1具有相應(yīng)的生物學(xué)功能。另外，實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)在HCT116中過(guò)表達(dá)CARP1可以促進(jìn)HCT116細(xì)胞的增殖，并可部分抵抗順鉑引起的生長(zhǎng)抑制，但機(jī)制并不清楚。以上結(jié)果說(shuō)明CARP1可能參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及耐藥性的產(chǎn)生，為我們進(jìn)一步研究CARP1的功能奠定了基礎(chǔ)。

[1]McDonald E R,El-Deiry W S.Suppression of caspase-8-and-10-associated RING proteins results in sensitization to death ligandsand inhibition oftumorcellgrowth[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101:6170-6175.

[2]Yang W,Rozan L M,McDonaldⅢE R,et al.CARPs are ubiquitin ligasesthatpromoteMDM2-independentp53 and phospho-p53ser20degradation[J].J Biol Chem,2007,282:3273-3281.

[3]Yang W,Dicker D T,Chen J,et al.CARPs enhance p53 turnover by degrading 14-3-3sigma and stabilizing MDM2[J].Cell Cycle,2008,7(5):670-682.

[4]Yang W,El-Deiry W S.CARPs are E3 ligases that target apicalcaspases and p53[J].CancerBiolTher,2007,6(11):1676-1683.

[5]Liao W,Fujita K I,Xiao Q,et al.CARP1 regulates induc?tion of NF-κB by TNFα[J].Curr Biol,2009,19(1):R17-R18.

[6]Liao W,Xiao Q,Tchikov V,et al.CARP-2 is an endo?some-associated ubiquitin ligase for RIP and regulates TNF-induced NF-κB activation[J].Curr Biol,2008,18(9):641-649.