胰島素瘤動物模型的建立及特性研究*

成蘭云， 許世清， 張文健， 婁晉寧， 門秀麗

(1河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，河北 唐山 063000； 2中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所，北京 100029； 3涿州市醫(yī)院病理科， 河北 涿州 072750)

·實(shí)驗技術(shù)·

胰島素瘤動物模型的建立及特性研究*

成蘭云1，3， 許世清2， 張文健2， 婁晉寧2， 門秀麗1△

(1河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，河北 唐山 063000；2中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所，北京 100029；3涿州市醫(yī)院病理科， 河北 涿州 072750)

目的建立胰島素瘤的動物模型并分析其特性，為胰島素瘤的深入研究奠定實(shí)驗基礎(chǔ)。方法首先檢測體外培養(yǎng)的大鼠胰島素瘤細(xì)胞株INS-1的激素釋放能力，然后將INS-1細(xì)胞移植到裸鼠左腎包膜下，或在移植后18 d或在移植前3 d聯(lián)合腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)破壞動物自身胰島。尾靜脈采血檢測血糖,當(dāng)血糖<2.8 mmol/L認(rèn)為胰島素瘤模型建立。對各種條件建立的模型，觀察給予不同刺激物對血糖的影響以及動物血清中胰島素含量；并對動物胰腺組織和移植細(xì)胞的腎臟組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色檢測胰島素和胰高血糖素。結(jié)果胰島素瘤細(xì)胞既表達(dá)胰島素，同時也表達(dá)胰高血糖素。裸鼠接種INS-1細(xì)胞后3～4周血糖<2.8 mmol/L；移植腎臟明顯增大，形成明顯腫瘤，直徑≥1 cm。細(xì)胞移植后腹腔注射STZ的動物，血糖短暫回升，超過正常血糖水平，之后又逐漸下降，約2周后血糖<2.8 mmol/L。正常裸鼠給予STZ后血糖明顯升高，移植INS-1細(xì)胞后動物血糖逐漸下降，約4周后血糖降至2.8 mmol/L。與正常對照組相比，3種方法建立的胰島素瘤模型給予高糖后，動物血糖峰值低。高糖加精氨酸或乙酰膽堿刺激后，正常動物血糖峰值較單純高糖刺激降低，并較快降至正常水平，但3種胰島素瘤模型組血糖升高均明顯超過單純高糖刺激者。高糖加去甲腎上腺素刺激后，正常動物血糖達(dá)到峰值時間延遲，血糖水平下降緩慢，3種胰島素瘤模型組血糖較單純高糖刺激組有所升高。與正常對照組相比，3種胰島素瘤模型血漿基礎(chǔ)胰島素的水平明顯升高。結(jié)論通過給裸鼠腎包膜下移植INS-1細(xì)胞，可建立胰島素瘤動物模型，且瘤細(xì)胞同時表達(dá)胰島素和胰高血糖素，不易被STZ破壞。該模型為進(jìn)一步探討胰島素瘤的發(fā)病機(jī)制奠定實(shí)驗基礎(chǔ)。

胰島素瘤； 模型，動物； INS-1細(xì)胞； 葡萄糖

胰島素瘤是來源于胰島β細(xì)胞的腫瘤，是功能性胰腺內(nèi)分泌腫瘤中最常見的一種[1- 2]，具有較強(qiáng)的自主分泌胰島素能力，臨床上多表現(xiàn)為低血糖反復(fù)發(fā)作并逐漸加重,嚴(yán)重時可危及生命。低血糖導(dǎo)致自主神經(jīng)過度興奮癥狀和神經(jīng)缺糖癥狀[3]，長期低血糖癥狀反復(fù)發(fā)作，將導(dǎo)致大腦和神經(jīng)系統(tǒng)不可逆的營養(yǎng)不良性退行性改變，可使病人智力低下,行為異常甚至癡呆、喪失勞動力[4- 6]。其診斷依靠Whipple診斷三聯(lián)征[即典型的低血糖癥狀發(fā)作,發(fā)作時血糖低于2.8 mmol/L (500 mg/L),攝入葡萄糖可使癥狀迅速緩解][7- 8]和實(shí)驗室檢查。臨床上此病極易被誤診,有報道超過40%的胰島素瘤病例初診為神經(jīng)系統(tǒng)疾病[9]。因此,提高對胰島素瘤的認(rèn)識并及時診治具有重要意義。由于缺乏合適的動物模型，對胰島素瘤發(fā)病機(jī)制的了解甚少，該類腫瘤的生物學(xué)特性尚有待研究。本研究采用裸鼠腎包膜下移植大鼠胰島素瘤細(xì)胞株INS-1成功建立了胰島素瘤的動物模型，并初步觀察了腫瘤的特性，為深入研究胰島素瘤的發(fā)病機(jī)制和診斷方法奠定實(shí)驗基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1材料

1.1細(xì)胞 INS-1細(xì)胞(大鼠胰島素瘤細(xì)胞)、INR-1G9細(xì)胞(胰島α細(xì)胞)、r9細(xì)胞(INS-1的單細(xì)胞克隆)、人胰島素瘤細(xì)胞和HK- 2細(xì)胞(人近端腎小管上皮細(xì)胞)。

1.2動物nu/nu裸鼠[購自北京維通利華實(shí)驗動物技術(shù)有限公司 ，動物合格證號為SCXK (京)2006-0009]，6～8周齡，體重20～25 g，均為雄性，無特定病原體條件下飼養(yǎng)。

1.3主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco),胎牛血清(Gibco),胰蛋白酶(Sigma),鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ;Sigma),葡萄糖(中國大冢制藥有限公司),精氨酸(上海信誼藥業(yè)有限公司 ),去甲腎上腺素(上海禾豐制藥有限公司),乙酰膽堿(TGI),胰島素ELISA試劑盒(Millipore),兔抗胰島素多克隆抗體(Santa Cruz),羊抗胰高血糖素多克隆抗體(Santa Cruz),總RNA提取試劑盒(Promega),BCA法蛋白測定試劑盒(碧云天公司),ECL化學(xué)發(fā)光試劑(Millipore)。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) INS-1細(xì)胞、INR-1G9細(xì)胞、r9細(xì)胞和人胰島素瘤細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基(內(nèi)含10%胎牛血清,1×105U/L青霉素,100 mg/L鏈霉素, 5.5 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L HEPES, 50 μmol/L β-巰基乙醇，1 mmol/L丙酮酸鈉)，其中r9細(xì)胞培養(yǎng)時另外添加100 mg/L G418；HK- 2細(xì)胞用DMEM/F12培養(yǎng)基(內(nèi)含10%胎牛血清,1×105U/L青霉素,100 mg/L鏈霉素)，各種細(xì)胞于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 。待細(xì)胞生長至匯合時用0.025%胰蛋白酶/0.025% EDTA 傳代。

2.2胰島素瘤細(xì)胞的特性分析

2.2.1RT-PCR 將正常培養(yǎng)的INS-1細(xì)胞、r9細(xì)胞、INR-1G9細(xì)胞、人胰島素瘤細(xì)胞和HK- 2細(xì)胞各1×106個，使用總 RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒進(jìn)行總 RNA 的提取、逆轉(zhuǎn)錄和PCR，引物序列見表1。之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察條帶，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。

表1 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)引物及產(chǎn)物大小

2.2.2Western blotting 將正常培養(yǎng)的INS-1細(xì)胞、r9細(xì)胞、INR-1G9細(xì)胞、人胰島素瘤細(xì)胞 和HK- 2細(xì)胞各5×106個提取總蛋白,采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。取30 μg總蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h，洗膜后分別加入鼠抗β-actin抗血清、兔抗胰島素抗血清、羊抗胰高血糖素抗血清4 ℃雜交過夜。洗膜后，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)Ⅱ抗雜交。使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，暗室曝光成像。

2.2.3ELISA方法INS-1細(xì)胞胰島素和胰高血糖素釋放的檢測 INS-1細(xì)胞以2×108/L的密度接種于24孔培養(yǎng)板中，應(yīng)用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后，用含2.5 mmol/L 葡萄糖的培養(yǎng)基平衡5 h，然后用KRBH液 (mmol/L: 140 NaCl, 3.6 KCl, 0.5 NaH2PO4·2H2O, 0.5 MgSO4·7H2O, 1.5 CaCl2, 2 NaHCO3, 10 HEPES, 0.1% BSA)洗2次,再分別換成含下列物質(zhì)的KRBH液：20 mmol/L 葡萄糖(glucose，G)、20 mmol/L G+20 mmol/L 精氨酸(arginine，Arg)、20 mmol/L G+40 μmol/L 去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)或 20 mmol/L G+ 1 mmol/L 乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)，培養(yǎng)30 min 后收集上清液，用于胰島素和胰高血糖素的測定。胰島素的測定采用ELISA方法，胰高血糖素采用放射免疫法測定。

2.3胰島素瘤動物模型的建立

2.3.1細(xì)胞準(zhǔn)備 刮取培養(yǎng)的INS-1細(xì)胞，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗2次，再加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，吸入頭皮針中，離心，將細(xì)胞離心到針端，每只裸鼠移植細(xì)胞數(shù)約2×107。

2.3.2模型建立方法和動物分組 使用3種方法建立胰島素瘤模型，具體方法是： (1)單獨(dú)細(xì)胞移植：將上述準(zhǔn)備好的INS-1細(xì)胞移植到裸鼠左腎包膜下，以假手術(shù)組作為對照。(2)細(xì)胞移植后聯(lián)合STZ腹腔注射：同上進(jìn)行細(xì)胞移植，待動物血糖降至4 mmol/L左右時腹腔注射STZ溶液(200 mg/kg)；另以同樣移植但不注射STZ的和正常裸鼠同時同樣方法腹腔注射STZ作為對照。(3)STZ給藥后進(jìn)行細(xì)胞移植：將正常裸鼠禁食12 h，給予STZ (200 mg/kg)腹腔注射，72 h后開始測定血糖，血糖連續(xù)3 d>20 mmol/L，成為糖尿病鼠；將其分為2組，一組在左腎包膜下移植INS-1細(xì)胞(細(xì)胞量同上)，另一組進(jìn)行假手術(shù)作為對照。以上各組每組4只動物。

2.3.3尾靜脈采血監(jiān)測各組動物血糖 當(dāng)模型組動物的血糖明顯降低至<2.8 mmol/L后,以10%糖水代替普通飲水，繼續(xù)監(jiān)測血糖，3 d后開始，各組動物在隔天下午分別給予葡萄糖(4 g/kg)、精氨酸(500 mg/kg)+葡萄糖(4 g/kg)、去甲腎上腺素(8 mg/kg)+ 葡萄糖(4 g/kg)或乙酰膽堿(10 mg/kg)+ 葡萄糖(4 g/kg)，分別在0、5、10、15、20、30、40和60 min時測其血糖。

2.4免疫組織化學(xué)染色 處死動物，取血，采用ELISA方法測定血清中胰島素的含量。取胰腺和移植細(xì)胞的腎臟固定于10%甲醛，制備石蠟切片。經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化，微波熱修復(fù)，3%過氧化氫溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶。Ⅰ抗分別使用兔抗小鼠胰島素抗血清、羊抗小鼠胰高血糖素抗血清，4 ℃孵育過夜，Ⅱ抗使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體或兔抗羊IgG抗體，37 ℃ 30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明封片后鏡檢。

3統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗。多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1胰島素瘤細(xì)胞的特性分析

RT-PCR(圖1A)和Western blotting(圖1B)結(jié)果顯示，INS-1細(xì)胞及INS-1的單克隆細(xì)胞株r9細(xì)胞均同時表達(dá)胰島素和胰高血糖素，并且人胰島素瘤細(xì)胞也具有同樣特點(diǎn)。但作為對照的INR-1G9細(xì)胞只表達(dá)胰高血糖素，而腎小管上皮細(xì)胞HK- 2細(xì)胞則兩者都不表達(dá)。胰島素釋放實(shí)驗(圖1C)結(jié)果顯示， 給予高糖刺激時，INS-1細(xì)胞的胰島素和胰高血糖素分泌增加，精氨酸和乙酰膽堿對高糖誘導(dǎo)的胰島素和胰高血糖素釋放起到促進(jìn)作用，而去甲腎上腺素起到抑制作用。

Figure 1. Analysis of insulin and glucagon of insulinoma cells. A: RT-PCR; B: Western blotting; C: ELISA. G: glucose; G+Arg: glucose+arginine; G+NE: glucose+norepinephrine; G+ACh: glucose+acetylcholine. Mean±SD.n=3.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsG group.

圖1胰島素瘤細(xì)胞的特性分析

2胰島素瘤動物模型的建立

2.1單純移植INS-1細(xì)胞組血糖變化 與假手術(shù)組相比，左腎包膜下移植INS-1細(xì)胞的裸鼠,血糖在2周后開始下降，3周時血糖<2.8 mmol/L，此后一直維持該水平，見圖2A。

2.2INS-1細(xì)胞移植后注射STZ對血糖水平的影響 移植INS-1裸鼠血糖降至正常一半[(4.03±0.49)mmol/L]時(約18 d時)腹腔注射STZ，血糖在STZ給藥后3 d開始上升，最高可上升到(16.80±4.84)mmol/L，之后逐漸下降，在注射STZ后約2周時血糖達(dá)到<2.8 mmol/L[(2.10±0.44)mmol/L]；而僅移植INS-1組的裸鼠血糖逐漸降低，3周時血糖(2.30±0.55)mmol/L，之后一直處于低血糖狀態(tài)；正常裸鼠腹腔注射STZ后，血糖3～5d時明顯上升,出現(xiàn)高血糖[(27.80±1.22)mmol/L]，之后一直處于高血糖狀態(tài),見圖2B。

2.3INS-1細(xì)胞移植到糖尿病裸鼠后血糖水平的變化 腹腔注射STZ 3 d后，動物血糖水平均明顯升高，達(dá)20 mmol/L以上。移植INS-1細(xì)胞后，裸鼠血糖逐漸減低，在4周后血糖<2.8 mmol/L，見圖2C。

2.4胰島素瘤的成瘤檢查 當(dāng)裸鼠血糖<2.8 mmol/L后，處死各組的裸鼠，檢查移植細(xì)胞在腎臟局部成瘤情況,可見與右腎相比，移植細(xì)胞的左腎明顯增大，形態(tài)不規(guī)則，表面凹凸不平，形成明顯腫瘤，直徑≥1 cm，見圖2D。

3比較各種胰島素瘤動物模型糖耐量情況

正常裸鼠(圖3A)和3種方法建立的胰島素瘤模型[單純移植INS-1細(xì)胞(圖3B)、移植INS-1細(xì)胞后注射STZ(圖3C)以及注射STZ后移植INS-1細(xì)胞(圖3D)]給予高糖后，正常動物血糖在15 min左右上升到20 mmol/L以上，但3種胰島素瘤模型動物血糖峰值明顯降低，在8 mmol/L左右。高糖加精氨酸或乙酰膽堿刺激后，正常動物血糖峰值較單純高糖刺激的降低，并較快降至正常水平，但3種胰島素瘤模型組血糖升高均明顯超過單純高糖刺激者。高糖加去甲腎上腺素刺激后，正常動物血糖達(dá)到峰值時間延遲，血糖水平下降緩慢，3種胰島素瘤模型組血糖較單純高糖刺激組有所升高。

4胰島素瘤模型血漿基礎(chǔ)胰島素水平

正常裸鼠血漿中胰島素水平較低[(1.25±0.55)μg/L]，與正常對照組相比，3種方法建立的胰島素瘤動物血漿中胰島素的水平明顯升高，分別為(10.67±0.85)μg/L、(8.13±1.15) μg/L和(4.61±0.85)μg/L，見圖4。

Figure 2. Establishment of insulinoma animal models. A: the changes of blood glucose after INS-1 cells were transplanted into the left kidney capsule of nude mice; B: the changes of blood glucose after intraperitoneal injection of STZ in nude mice transplanted with INS-1 cells; C: the changes of blood glucose after INS-1 cells were transplanted into the left kidney capsule of diabetic nude mice; D: tumorigenicity after INS-1 cells were transplanted into the left kidney capsule in different groups of nude mice. 1,3,5,7: the right kidney; 2,4,6,8: the left kidney.Mean±SD.n=4.*P<0.05.**P<0.01vsN or N+STZ group.

圖2胰島素瘤動物模型的建立

Figure 3. Different animal models of insulinoma response to different stimuli.A: normal nude mice; B: transplantation of INS-1 cells; C: injection of STZ after transplantation of INS-1 insulinoma model; D: transplantation of INS-1 cells after STZ injection. G: glucose; G+Arg: glucose+arginine; G+NE: glucose+norepinephrine; G+ACh: glucose+acetylcholine. Mean±SD.n=4.

圖3不同胰島素瘤動物模型對不同刺激物的反應(yīng)

Figure 4. Comparison of plasma basal insulin levels in different insulinoma models. A: normal nude mice; B: transplantation of INS-1 cells; C: injection of STZ after transplantation of INS-1 cells; D: transplantation of INS-1 cells after STZ injection. Mean±SD.n=4.**P<0.01vsA group.

圖4比較不同胰島素瘤模型血漿基礎(chǔ)胰島素水平

5移植瘤的病理學(xué)檢查

移植INS-1細(xì)胞的裸鼠腎臟比正常腎臟明顯增大，表面凸凹不平，形成明顯腫瘤。組織學(xué)檢查證實(shí)胰島素瘤的形成(圖5A)，移植瘤的免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)組織中表達(dá)胰島素(圖5B)和胰高血糖素(圖5C)。

6INS-1細(xì)胞移植聯(lián)合STZ給藥建模動物胰島素和胰高血糖素的表達(dá)

正常胰腺表達(dá)胰島素和胰高血糖素，而移植INS-1細(xì)胞并腹腔注射STZ裸鼠的胰腺未檢測到胰島素，只檢測到胰高血糖素表達(dá)；但移植部位的INS-1細(xì)胞仍然高表達(dá)胰島素和胰高血糖素，見圖6。

討 論

胰島素瘤是最常見的胰腺內(nèi)分泌腫瘤之一，具有胰島素過度分泌功能，可引起反復(fù)發(fā)作性低血糖和低糖造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙等一系列臨床表現(xiàn)。目前其發(fā)病機(jī)制不清，臨床上極易誤診。本研究利用將INS-1細(xì)胞移植到裸鼠體內(nèi)成功建立了胰島素瘤的動物模型，并對其特性進(jìn)行了初步分析，為研究其發(fā)病機(jī)制和診斷方法奠定實(shí)驗基礎(chǔ)。

Figure 5. HE and immunohistochemical staining in the insulinoma model of transplantation of INS-1 cells. A: HE staining of the transplanted tumors (×200); B: staining of insulin in the transplanted tumors (×400); C: staining of glucagon in the transplanted tumors (×400).

圖5移植INS-1細(xì)胞的胰島素瘤模型的免疫組化染色分析

Figure 6. Immunohistochemical staining in the insulinoma model of STZ injection after INS-1 cell transplantation (×200). A,B: normal pancreas; C,D:pancreas from INS-1+STZ mice; E,F:transplanted INS-1 cells.A,C,E:staining of insulin; B,D,F:staining of glucagon.

圖6INS-1細(xì)胞移植聯(lián)合STZ注射的胰島素瘤模型的免疫組化染色

我們首先檢測了體外培養(yǎng)的INS-1細(xì)胞的胰島素分泌能力。婁晉寧教授等前期研究發(fā)現(xiàn)INS-1細(xì)胞只表達(dá)胰島素，而本實(shí)驗結(jié)果顯示INS-1細(xì)胞不僅表達(dá)和釋放胰島素而且表達(dá)和釋放胰高血糖素。為分析原因，我們還檢測了INS-1的單克隆細(xì)胞株 r9細(xì)胞，以及原代分離的人胰島素瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)后兩者也同時表達(dá)胰島素和胰高血糖素。以往的研究發(fā)現(xiàn)，正常情況下，胰島α細(xì)胞對胰島β細(xì)胞的存活和胰島素分泌具有支持作用[10]。也有報道胰高血糖素對胰島β細(xì)胞的增殖和胰島素分泌具有促進(jìn)作用[11]，因此同時表達(dá)胰高血糖素對胰島素瘤細(xì)胞的存活和功能可能起到重要作用。

為建立胰島素瘤的動物模型，我們將INS-1細(xì)胞移植到裸鼠腎包膜下，在大約3周時動物血糖即降至2.8 mmol/L以下，組織病理學(xué)檢查也證實(shí)移植局部腫瘤形成。為使模型在整體水平反映胰島素瘤的特性，我們在建模過程中用STZ破壞動物自身胰島，此時動物血糖的變化可反映胰島素瘤的功能。在移植INS-1細(xì)胞后給予STZ或先給予STZ后再移植INS-1細(xì)胞均可使動物血糖降至2.8 mmol/L以下，因此可以認(rèn)為胰島素瘤模型建立成功。

隨后對所建立的3種胰島素瘤模型分泌胰島素特性進(jìn)行了初步分析，當(dāng)給予高糖刺激后，正常動物血糖迅速升高后逐漸降低至正常水平，但胰島素瘤組血糖峰值較低，曲線較低平，與臨床胰島素瘤患者糖耐量曲線低平的特點(diǎn)相符合[12]。給予高糖加精氨酸刺激時，正常動物血糖峰值降低且較快恢復(fù)至正常水平，但胰島素瘤模型組血糖峰值不降反升，結(jié)合體外實(shí)驗發(fā)現(xiàn)胰島素瘤細(xì)胞同時表達(dá)胰島素和胰高血糖素，推測是精氨酸刺激使2種激素釋放均增加的結(jié)果。

精氨酸作為一種非葡萄糖刺激物，帶有正電荷，能加強(qiáng)胰島β細(xì)胞膜的去極化，使鈣通道開放，鈣離子內(nèi)流，促進(jìn)已儲存的胰島素釋放，可用來評估胰島β細(xì)胞功能[13-15],同時精氨酸和葡萄糖有協(xié)同作用。有文獻(xiàn)報道：糖尿病及糖耐量受損患者精氨酸負(fù)荷后胰高血糖素水平升高，病程較長的1型糖尿病患者精氨酸刺激后胰島素反應(yīng)消失，但保持正常的胰高血糖素反應(yīng)[16]，提示精氨酸對胰島α細(xì)胞也具有較強(qiáng)的興奮作用，促進(jìn)胰高血糖素分泌。本研究結(jié)果也提示精氨酸能促進(jìn)胰島素瘤細(xì)胞同時釋放胰島素和胰高血糖素。

此外，我們還研究了去甲腎上腺素和乙酰膽堿對INS-1細(xì)胞功能的影響。去甲腎上腺素和乙酰膽堿是體內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，也是調(diào)節(jié)胰島素分泌的重要物質(zhì)[17]。乙酰膽堿促進(jìn)胰島素分泌[18-19]，而去甲腎上腺素抑制胰島素分泌[20- 21]。本研究結(jié)果顯示，乙酰膽堿與精氨酸的作用相似，不僅促進(jìn)胰島素釋放，而且同時促進(jìn)胰高血糖素的釋放；去甲腎上腺素抑制胰島素分泌的同時還抑制胰高血糖素的釋放。

我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)胰島素瘤動物血中基礎(chǔ)胰島素水平明顯高于正常，這可能是造成動物低血糖和即使給予高糖后血糖峰值也很低的原因。在移植INS-1后再給予STZ，可以破壞動物自身胰島，但對移植的細(xì)胞影響不大，說明胰島素瘤細(xì)胞對STZ具有一定的抵抗作用。

綜上所述，通過移植INS-1細(xì)胞可以成功建立胰島素瘤動物模型，該模型具有臨床胰島素瘤的特點(diǎn)，適用于對胰島素瘤的深入研究。尤其是INS-1細(xì)胞移植后注射STZ組將自身胰島破壞，但對移植細(xì)胞影響小，更適用于胰島素瘤的深入研究。此外，胰島素瘤細(xì)胞不僅表達(dá)胰島素還表達(dá)胰高血糖素，同時表達(dá)胰高血糖素是否對瘤細(xì)胞的成瘤性和功能具有影響還有待進(jìn)一步研究。

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Establishmentofinsulinomaanimalmodelsandobservationoftumorcharacteristics

CHENG Lan-yun1,3, XU Shi-qing2, ZHANG Wen-jian2, LOU Jin-ning2, MEN Xiu-li1

(1DepartmentofPathophysiology,SchoolofBasicMedicine,HebeiUnitedUniversity,Tangshan063000,China;2InstituteofClinicalMedicine,China-JapanFriendshipHospital,Beijing100029,China;3DepartmentofPathology,ZhuozhouCity’sHospital,Zhuozhou072750,China.E-mail:xiulimen@126.com)

AIM: To establish the animal model of insulinoma and to analyze the properties of insulinoma for further study.METHODSThe hormone-releasing ability of rat insulinoma cell line INS-1 was detectedinvitro. INS-1 cells were transplanted into the left kidney capsule of nude mice. The islets of the animals were destroyed by intraperitoneal injection of streptozocin (STZ) 3 d before transplantation or 2 weeks after transplantation. The venous blood was sampled, and the level of blood glucose less than 2.8 mmol/L was defined as successful establishment of insulinoma model. Different irritants were given to the model animals, and the changes of blood glucose and insulin content in serum were observed. The pancreatic tissues and the renal tissues in the injecting sites were taken from all mice for detecting insulin and glucagon by immunohistochemical staining.RESULTSInsulinoma cells expressed insulin and glucagon at the same time. The blood glucose was less than 2.8 mmol/L 3 to 4 weeks after inoculation of INS-1 cells. Apparent tumor formed in the left kidneys where INS-1 cells were transplanted and the tumor diameters were more than 1 cm. The level of blood glucose transiently increased to higher than the normal level in the mice with tumor cell transplantation after intraperitoneal injection of STZ, and then decreased gradually and returned to less than 2.8 mmol/L after 2 weeks. The level of blood glucose in the normal nude mice after administration of STZ increased significantly. After transplantation of INS-1 cells, the level of blood glucose decreased gradually, and returned to less than 2.8 mmol/L after 4 weeks. After stimulated with high glucose, the blood glucose levels in the mice with 3 methods to establish the insulinoma models showed lower glucose peaks than that in the normal control mice. After stimulated with high glucose plus arginine or acetylcholine in the normal animals, the blood glucose peak was lower than that in the normal animals only stimulated with high glucose, and rapidly recovered to the normal level. However, the levels of blood glucose in the mice with 3 methods to establish the insulinoma models under the same stimulations were significantly higher than that in the mice only stimulated with high glucose. After stimulated with high glucose plus norepinephrine, the blood glucose peak time in the normal animals delayed, and the blood glucose level declined slowly. After stimulated with high glucose plus norepinephrine, the levels of blood glucose in the mice with 3 methods to establish the insulinoma models increased as compared with that in the mice only stimulated with high glucose. Compared with normal control group, serum insulin in insulinoma mice increased significantly.CONCLUSIONThe insulinoma animal model is successfully established by transplantation of INS-1 cells into the renal capsule of nude mice. The insulinoma cells express both insulin and glucagon, and are not easily damaged by STZ.

Insulinoma; Models, animal; INS-1 cells; Glucose

R736.7

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.04.034

1000- 4718(2013)04- 0761- 08

2012- 09- 08

2013- 03- 14

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.30971410)

△通訊作者 Tel： 0315-3725612； E-mail： xiulimen@126.com