二苯乙烯苷對同型半胱氨酸誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及bcl-2、bax、caspase-3表達(dá)的影響*

李 軍， 王國榮， 張秀芹， 王 燕， 牟艷玲， 姚慶強(qiáng)△

(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 1藥物研究所, 2山東省罕少見病重點實驗室，山東 濟(jì)南 250062)

二苯乙烯苷對同型半胱氨酸誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及bcl-2、bax、caspase-3表達(dá)的影響*

李 軍1,2， 王國榮1， 張秀芹1， 王 燕1， 牟艷玲1,2， 姚慶強(qiáng)1,2△

(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院1藥物研究所,2山東省罕少見病重點實驗室，山東 濟(jì)南 250062)

目的研究何首烏二苯乙烯苷(TSG)對同型半胱氨酸(Hcy)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)凋亡及bcl-2、bax和caspase-3 mRNA表達(dá)的影響。方法建立Hcy (3 mmol/L)所致培養(yǎng)HUVECs核損傷模型，TSG(1和10 μmol/L)提前2 h預(yù)孵育，然后再以Hcy處理，作為TSG保護(hù)組。用Hoechst 33342核染色法觀察HUVECs細(xì)胞核損傷狀態(tài)，以流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況，用實時熒光定量RT-PCR法檢bcl-2、bax和caspase-3 mRNA的表達(dá)。結(jié)果經(jīng)3 mmol/L Hcy處理后，與正常培養(yǎng)的細(xì)胞相比，HUVECs核損傷加重，凋亡細(xì)胞比例升高，bcl-2表達(dá)降低(P<0.01)，bax和caspase-3表達(dá)增加(P<0.01)。TSG 1 μmol/L和10 μmol/L預(yù)孵育后再經(jīng)3 mmol/L Hcy處理，與單經(jīng)3 mmol/L Hcy損傷模型組相比，HUVECs細(xì)胞核損傷降低，凋亡率下降，bcl-2的表達(dá)增加(P<0.05)，bax和caspase-3表達(dá)降低(P<0.05)。結(jié)論TSG具有降低Hcy所致HUVECs的細(xì)胞損傷和抑制凋亡的作用，其機(jī)制可能與影響bcl-2、bax和caspase-3的表達(dá)有關(guān)。

二苯乙烯苷； 同型半胱氨酸； 細(xì)胞凋亡； Bcl-2； Bax； 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

血漿同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)水平升高是冠心病、腦血管疾病以及外周阻塞性血管疾病等心腦血管疾病的一個重要獨立危險因素[1-2]。體外細(xì)胞培養(yǎng)顯示Hcy 能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[3-4]；Hcy可損傷血管內(nèi)皮促進(jìn)動脈粥樣斑塊形成[5]。

何首烏(Polygonummultiflorum)2,3,5,4’-四羥基反式二苯乙烯-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(2,3,5,4’- tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside, TSG)可有效抑制高血脂癥模型大鼠的血脂升高，降低主動脈、冠狀動脈和頸總動脈脂質(zhì)條紋面積，減少肝臟中的脂質(zhì)沉積。TSG還能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放一氧化氮(nitric oxide, NO)并具有很強(qiáng)的抗氧化特性[6]，抑制單核細(xì)胞分泌黏附分子和抑制內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞的黏附[7]。目前關(guān)于TSG抗凋亡分子研究報道較少。特別是其對Hcy所致血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡干預(yù)作用不明。

本實驗通過對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的培養(yǎng)，研究應(yīng)用TSG干預(yù)對Hcy誘導(dǎo)HUVECs凋亡及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響，初步探討TSG抑制Hcy誘導(dǎo)HUVECs凋亡的可能分子作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

HUVECs由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所藥理室提供。Hcy購自Sigma，DMEM培養(yǎng)基系Gibco產(chǎn)品，TSG為山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所分離，純度99%，胰蛋白酶和EDTA 混合液由Gibco生產(chǎn)，胎牛血清由杭州四季青生物工程材料有限公司生產(chǎn)，Hoechst 33342細(xì)胞核凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，RNA提取試劑由Promega生產(chǎn)，逆轉(zhuǎn)錄及SYBR GreenⅠReal Time PCR試劑由大連寶生物公司生產(chǎn)，引物由上海博彩生物公司合成。

2方法

HUVECs的培養(yǎng)和傳代方法同文獻(xiàn)[8]，實驗使用復(fù)蘇培養(yǎng)3～5代的細(xì)胞。

2.1細(xì)胞核形態(tài)學(xué)染色觀察 將HUVECs 按2×104cells/well的密度接種于24孔板內(nèi)，以含10% FBS DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細(xì)胞長至50%時，改換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化于G0期(細(xì)胞同步化)后，進(jìn)行以下實驗。

實驗分為以下5組：正常培養(yǎng)基組、Hcy 3.0 mmol/L組、TSG(1 μmol/L、10 μmol/L)預(yù)孵育2 h再各加Hcy 3.0 mmol/L處理組。Hcy培養(yǎng)36 h后進(jìn)行Hoechst 33342核染色檢測。實驗重復(fù)4次。

2.2Annexin V-FITC/PI雙染 取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×109/L，種于25 mL培養(yǎng)瓶中。待細(xì)胞長至相互接觸，改換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化于G0期(細(xì)胞同步化)后，按上一步的分組方法進(jìn)行處理。加入Hcy作用36 h后，以0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，1 200 r/min離心3 min，棄上清，PBS清洗，離心收集細(xì)胞，按照試劑盒說明，立即以Annexin V-FITC/PI雙染，用流式細(xì)胞儀檢測(激發(fā)波長為488 nm；發(fā)射波長為530 nm和575nm)細(xì)胞凋亡。CellQuest軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.3實時熒光定量RT-PCR檢測相關(guān)基因的表達(dá) 將HUVECs按1×105cells/well的密度接種于25 mL培養(yǎng)瓶，以含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細(xì)胞長至相互接觸，改換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化于G0期(細(xì)胞同步化)后，分為下列實驗組：正常對照組、Hcy(3 mmol/L)模型組、TSG1組和TSG10組(1和10 μmol/L TSG預(yù)孵育2 h再各加Hcy 3 mmol/L繼續(xù)培養(yǎng)12 h)。各處理組重復(fù)6次。

實驗結(jié)束后傾去上清液，以PBS快速洗滌3次，參照TRIzol試劑說明裂解細(xì)胞備以提取總RNA。

引物序列如表1。實時熒光定量PCR 25 μL反應(yīng)體系由以下成份組成：12.5 μL 2 × Power SYBR? Green PCR Master Mix，1.0 μmol/L 的上、下游引物(序列見表1)，1 μL的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，水。反應(yīng)程序為：95 ℃ 10 min；循環(huán)反應(yīng)為95 ℃ 8 s，60 ℃ 40 s，40個循環(huán)，在各循環(huán)的60 ℃ 40 s步驟進(jìn)行熒光檢測；最后為熔解曲線步驟。每個樣品目的基因的表達(dá)閾值與內(nèi)參照基因(mitochondrial ATP synthase 6，mATPsy6)表達(dá)閾值的差ΔCt為其相對表達(dá)量。各處理組目的基因的ΔCt與正常對照組目的基因的ΔCt差值計為ΔΔCt，以2-ΔΔCt表示為目的基因在藥物處理組的表達(dá)量與在正常組表達(dá)量的比值。

3統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊者用LSD檢驗，方差不齊者用Dunnett’s T3檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1TSG對Hcy所致HUVECs細(xì)胞核形態(tài)學(xué)改變的影響

以Hoechst 33342染色，熒光顯微鏡下觀察TSG 對Hcy所致HUVECs細(xì)胞核形態(tài)學(xué)改變的影響。結(jié)果顯示與對照組相比，Hcy模型組以3 mmol/L Hcy孵育HUVECs 36 h，細(xì)胞核具凋亡形態(tài)特點，即胞核染色質(zhì)凝集、邊聚化、胞核呈亮藍(lán)色熒光的細(xì)胞比例增多，見圖1。

表1 實時熒光定量PCR的引物序列

分別以TSG 1 μmol/L和10 μmol/L預(yù)孵育HUVECs 2 h后，再以3 mmol/L Hcy孵育36 h，與Hcy處理相比，TSG處理可明顯減輕Hcy誘發(fā)的內(nèi)皮細(xì)胞核形態(tài)損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞核中染色體凝集、邊聚化的細(xì)胞比例減少，細(xì)胞核形態(tài)正常的細(xì)胞增多。顯示了TSG抑制Hcy對HUVECs細(xì)胞核損傷的作用，TSG 10 μmol/L降低Hcy所致HUVECs的損傷作用更好，見圖1。

Figure 1. Effect of TSG on HUVEC nuclear morphology damaged by Hcy. A：control; B：Hcy 3 mmol/L; C：TSG 1 μmol/L + Hcy 3 mmol/L; D：TSG 10 μmol/L + Hcy 3 mmol/L.

圖1TSG對Hcy所致HUVECs細(xì)胞核形態(tài)學(xué)損傷的影響

2TSG對Hcy所致HUVECs細(xì)胞凋亡的影響

Annexin V與PI染色后，通過流式細(xì)胞儀檢測TSG對Hcy所致HUVECs細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，Hcy孵育36 h，細(xì)胞凋亡率為23.63%，而以TSG 1 μmol/L和10 μmol/L預(yù)孵育HUVECs 2 h后再以Hcy處理36 h，細(xì)胞凋亡率分別降為7.02%和2.95%，見圖2。這說明TSG能抑制Hcy所致的HUVECs凋亡。

Figure 2. Effect of TSG on HUVEC apoptosis induced by Hcy.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vsHcy group.

圖2TSG對Hcy所致HUVECs凋亡的影響

3TSG對Hcy所致HUVECs細(xì)胞凋亡相關(guān)分子表達(dá)的影響

3.1何首烏TSG對同型半胱氨酸致內(nèi)皮細(xì)胞bcl-2 mRNA表達(dá)的影響 實時熒光定量RT-PCR結(jié)果檢測顯示， HUVECs模型組以3 mmol/L Hcy孵育12 h后，與對照組相比，其bcl-2 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01)。

HUVECs以何首烏TSG 1 μmol/L和10 μmol/L孵育2 h再給予3 mmol/L Hcy孵育12 h處理，與Hcy模型組相比，bcl-2 mRNA的表達(dá)顯著增加。TSG的2個處理濃度與模型組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

Figure 3. Effect of TSG on bcl-2 mRNA expression in HUVECs induced by Hcy.Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsHcy group.

圖3TSG對Hcy所致HUVECsbcl-2mRNA表達(dá)的影響

3.2何首烏TSG對Hcy致血管內(nèi)皮細(xì)胞bax mRNA表達(dá)的影響 Hcy模型組HUVECs bax mRNA表達(dá)較正常對照組顯著升高(P<0.05)。

以10 μmol/L何首烏TSG孵育2 h再給予3 mmol/L Hcy孵育12 h處理HUVECs，與Hcy模型組相比，HUVECs bax mRNA表達(dá)降低(P<0.05)，見圖4。

3.3何首烏TSG對Hcy致血管內(nèi)皮細(xì)胞caspase-3 mRNA表達(dá)的影響 Hcy模型組HUVECs的caspase-3 mRNA表達(dá)較正常對照組顯著升高(P<0.01)。

HUVECs以1 μmol/L和10 μmol/L何首烏TSG孵育2 h再給予3.0 mmol/L Hcy孵育12 h處理，與Hcy模型組相比，caspase-3 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)，見圖5。

討 論

Hcy作為動脈粥樣硬化獨立危險因素之一近年來越來越受到重視，它可以通過損傷內(nèi)皮細(xì)胞引起細(xì)胞凋亡、促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放等多方面引起動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展[9]。Hcy主要是通過激活細(xì)胞凋亡的細(xì)胞膜途徑和線粒體途徑進(jìn)而促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。Hcy可抑制內(nèi)皮細(xì)胞bcl-2[10-11]的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞Bax[10-11]和Fas[12]的表達(dá)，進(jìn)而激活caspase-3[9-10]、caspase-6和p38的表達(dá)，產(chǎn)生促凋亡作用。本實驗結(jié)果證實Hcy誘導(dǎo)HUVECs凋亡時，HUVECs bax和casepase-3 mRNA表達(dá)較正常對照組顯著升高；而bcl-2 mRNA的表達(dá)呈下降的趨勢。

Figure 4. Effect of TSG on bax mRNA expression in HUVECs induced by Hcy.Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsHcy group.

圖4TSG對Hcy所致HUVECsbaxmRNA表達(dá)的影響

Figure 5. Effect of TSG on caspase-3 mRNA expression in HUVECs induced by Hcy.Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsHcy group.

圖5TSG對Hcy所致HUVECscaspase-3mRNA表達(dá)的影響

何首烏作為傳統(tǒng)中藥，其TSG具有降血脂、防治動脈粥樣硬化、抗衰老、提高免疫功能作用[13-14]。TSG還能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO并具有很強(qiáng)的抗氧化特性[6]，抑制單核細(xì)胞分泌黏附分子和抑制內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞的黏附[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)TSG預(yù)孵育可降低Hcy所致HUVECs細(xì)胞核損傷，降低凋亡細(xì)胞的比例。這一作用可能與何首烏TSG可提高Hcy損傷狀態(tài)下HUVECs的凋亡抑制基因bcl-2的表達(dá)有關(guān)，同時還可能與TSG降低Hcy損傷狀態(tài)下所致培養(yǎng)的HUVECs的促凋亡基因bax和caspase-3 mRNA的表達(dá)有關(guān)。推測TSG這一作用的原因可能與高濃度Hcy損傷內(nèi)皮細(xì)胞主要是通過增加氧化損傷、而TSG具有抗氧化特性有關(guān)，但目前缺乏相關(guān)研究的直接證據(jù)，還需進(jìn)一步研究證實。

本研究結(jié)果為臨床應(yīng)用TSG提供了一定的基礎(chǔ)研究依據(jù)，為何首烏心血管活性的作用機(jī)制提供了一個新的補(bǔ)充，但TSG的抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的活性有待從不同的角度進(jìn)一步證實，且其抑制凋亡的機(jī)理亦需從多個途徑展開。

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Effectsoftetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucosideonapoptosisandexpressionofbcl-2/bax/caspase-3inHUVECstreatedwithhomocysteine

LI Jun1, 2, WANG Guo-rong1, ZHANG Xiu-qin1, WANG Yan1, MU Yan-ling1, 2, YAO Qing-qiang1, 2

(1InstituteofMateriaMedica,2ShandongProvincalKeyLaboratoryofRareandUncommonDiseases,ShandongAcademyofMedicalSciences,Jinan250062,China.E-mail:yao_imm@163.com)

AIM: To explore the effects of tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside (TSG) fromPolygonummultiflorumon the apoptosis and the mRNA expression of bcl-2, bax and caspase-3 in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) treated with homocysteine (Hcy).METHODSCultured HUVECs were treated with Hcy (3 mmol/L) to establish a Hcy-damaged model. HUVECs in TSG treated groups were pre-incubated with TSG at concentrations of 1 μmol/L and 10 μmol/L for 2 h before treated with Hcy. Cell nuclear damage was detected by Hoechst 33342 staining. Cell apoptosis was determined by flow cytometry. The mRNA expression of bcl-2, bax and caspase-3 was measured by real-time fluorescence quantitative RT-PCR.RESULTSAfter treatment with Hcy at concentration of 3 mmol/L, the nuclear damage and apoptotic rate of HUVECs were higher than that in normal group. The expression of bcl-2 was lower, and the expression of Bax and caspase-3 was higher than that in normal group. On the other hand, pre-incubation with TSG at concentrations of 1 μmol/L and 10 μmol/L decreased the nuclear damage and cell apoptosis, increased the expression of bcl-2, and decreased the expression of bax and caspase-3 as compared with the cells only treated with Hcy.CONCLUSIONTSG reduces the apoptosis of HUVECs induced by Hcy, and the mechanism might be associated with regulating the expression of bcl-2, bax and caspase-3.

Tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside; Homocysteine; Apoptosis; Bcl-2; Bax; Caspase-3

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.04.030

1000- 4718(2013)04- 0743- 05

2012- 07- 09

2013- 02- 28

山東省自然科學(xué)基金資助項目(No. ZR2008C317)

△通訊作者 Tel: 0531-82919960; E-mail: yao_imm@163.com