帕金森病相關血清蛋白質(zhì)標志物的篩選及鑒定*

周 婷， 劉池波， 徐小輝， 梁海燕

(臺州學院醫(yī)學院附屬臺州市立醫(yī)院 1神經(jīng)內(nèi)科， 2檢驗科，浙江 臺州 318000)

帕金森病相關血清蛋白質(zhì)標志物的篩選及鑒定*

周 婷1△， 劉池波2， 徐小輝1， 梁海燕1

(臺州學院醫(yī)學院附屬臺州市立醫(yī)院1神經(jīng)內(nèi)科，2檢驗科，浙江 臺州 318000)

目的探討并初步鑒定帕金森病患者血清中相關蛋白質(zhì)作為特異標志物的可能性。方法應用表面增強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)結(jié)合納米磁珠技術檢測44例帕金森病和60例健康對照的血清標本,應用生物信息學方法篩選差異蛋白峰,經(jīng)高效液相色譜(HPLC)分離出差異蛋白，酶解后進行液質(zhì)聯(lián)用串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析，利用Xcalibur的程序組件BioWorks 3.2完成蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫鑒定分析。結(jié)果經(jīng)SELDI-TOF-MS結(jié)合納米磁珠技術篩選出質(zhì)荷比m/z位于8 937的蛋白質(zhì)在帕金森病中高表達(帕金森病組表達強度為27.47±16.58,正常組表達強度為5.01±3.47),有顯著差異(P<0.01);6 636和8 697的蛋白質(zhì)在帕金森病中低表達(帕金森病組表達強度為5.43±2.66和20.22±9.57,正常組表達強度為18.85±7.56和51.13±26.22), 有顯著差異(P<0.01)。聯(lián)合上述3種潛在蛋白質(zhì)標志物,可區(qū)分帕金森病組和對照組，其中帕金森病患者檢出率為90.0%(27/30),健康者檢出率為92.5%(37/40)。對m/z為6 636、8 697和8 937的標志物進行鑒定,結(jié)果分別為載脂蛋白C-I、載脂蛋白 C-III 和補體成分3a。結(jié)論鑒定出的載脂蛋白 C-I、載脂蛋白C-III和補體成分3a在帕金森病的診斷中具有一定價值,值得進一步研究和探討。

帕金森??； 蛋白質(zhì)組； 表面增強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法； 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用串聯(lián)質(zhì)譜

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)，又名震顫麻痹(shaking palsy)，是一種中老年人常見的緩慢進展的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是中老年人致殘的主要原因之一。臨床上以靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢步態(tài)障礙為主要特征，患病率與發(fā)病率隨著年齡的增加而遞增[1]。目前臨床上診斷帕金森病尚無特異敏感的生化指標和影像學檢查可作為確診的依據(jù)。所以診斷主要依據(jù)臨床癥狀和對左旋多巴治療的反應，但這些方法往往只能發(fā)現(xiàn)中晚期病例，且容易漏診和誤診。目前帕金森病的治療主要在于改善運動癥狀，而非延緩疾病的進程，所以早期診斷帕金森病，為帕金森病的早期干預及延緩病損提供了可能。因此，探索和建立一種簡單、快速、敏感性高和準確性強的帕金森病快速診斷技術已經(jīng)成為臨床醫(yī)學上亟待解決的問題。表面增強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(surface-enhanced laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS) 是近年來出現(xiàn)的一種新型的蛋白質(zhì)組學研究方法[2-4]，可用于直接檢測臨床各種類型標本，如血清、胸腹水、尿液、腦脊液等，實現(xiàn)了質(zhì)譜技術用于臨床標本檢測的飛躍[5-6]。我們利用SELDI-TOF-MS結(jié)合納米磁珠技術對44例帕金森病和60例健康對照的血清標本進行差異蛋白篩選，再結(jié)合高效液相色譜(high-performance liquid chromatography，HPLC)、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)及液質(zhì)聯(lián)用串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatograph-mass spectrometry tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)對帕金森病差異蛋白進行鑒定分析。

材 料 和 方 法

1研究對象

收集2011年1月～2012年2月我院住院及門診的PD患者44例，男性24例，女性20例，年齡(67.41±12.87)歲(54～82歲)；病程(3.25±4.36)年(0.5～16年)。入選標準：(1)符合2006年中華醫(yī)學會神經(jīng)病學分會運動障礙及PD學組所制訂的診斷標準[7]；(2)均經(jīng)CT或MRI檢查，除有老年性腦改變外，未見特殊異常；(3)排除腦血管疾病、腦炎等原因所導致的帕金森綜合征。所有帕金森病患者和健康者血清均來自浙江省臺州市立醫(yī)院，隨機分成實驗組與驗證組(training set為實驗組,blind set為驗證組，見表1)。本實驗經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會批準，受試者均簽署知情同意書。所有外周血標本均在清晨空腹采血，采集后立即放入4 ℃冰箱內(nèi)靜置1～2 h，然后4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，分離血清后，在冰上將血清轉(zhuǎn)移到新的PCR管中分裝，放入-80 ℃內(nèi)冰箱保存待檢。

表1 44例帕金森病患者和60例對照組分組情況

2儀器和試劑

乙腈(acetonitrile,ACN)、三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)、芥子酸(sinapinic acid，SPA)、尿素、二硫蘇糖醇(DL-dithiothreitol，DTT)、3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽{3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate，CHAPS}、Tris-HCl、H2O等購自Sigma，SELDI-TOF-MS (PBS IIC)質(zhì)譜儀購自Ciphergen Biosystems，弱陽離子交換型(WCX)納米磁珠、結(jié)合緩沖液、洗脫液等購自北京賽爾迪公司。MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀(AXIMA-CFRTMPlus)購于Kratos Analytical,HPLC購于Shimadzu，Xcalibur的程序組件BioWorks 3.2數(shù)據(jù)庫購自Thermo Finnigan。

3帕金森病SELDI-TOF-MS分析

將WCX納米磁珠分裝于PCR管中，置于磁性處理器上，吸取液體。再依次加入100 μL結(jié)合緩沖液，混勻后放置5 min，然后把PCR管置于磁性處理器上，吸取液體，重復上述操作1次。向每個裝有納米磁珠的PCR管中加入100 μL稀釋好的血清樣品，混勻后室溫放置15 min。將PCR管置于磁性處理器上，吸去未結(jié)合樣品。每管加入100 μL結(jié)合緩沖液，混勻后放置5 min，然后將PCR管置于磁性處理器上，吸取液體，重復上述操作1次。每管加入10 μL洗脫液混勻，放置5 min后置于磁性處理器上。取5 μL上清液移到另一個PCR管中，加人5 μL飽和SPA溶液充分混勻，吸取1 μL點樣到Au芯片上，待干后放入儀器讀取。SPA飽和溶液為芥子酸在50% ACN和0.5% TFA的飽和溶液。質(zhì)譜儀參數(shù)設定為激光強度190，靈敏度8，優(yōu)化范圍2 000～20 000質(zhì)荷比(mass/charge rato,m/z)。每條芯片取1點用同一正常人血清作內(nèi)參照，芯片間 CV≤10%。檢測前用ALL-IN-ONE多肽標準芯片校正,系統(tǒng)質(zhì)量偏差≤0.1%。原始數(shù)據(jù)先以ProteinChip 3.0軟件校正。

4蛋白質(zhì)的純化分析

將血清溶解后取出100 μL血清，加入350 μL水，700 μL純乙腈。將上述混合液體置入-20 ℃的冰箱內(nèi)，30 min后取出，3 000 r/min離心10 min。上清液轉(zhuǎn)入PCR管中凍干20 min。將凍干的樣品上樣至HPLC中。收集不同時點的純化液體，將純化出的蛋白液置入PCR管中凍干約20 μL。各取所收集組分0.5 μL，分別加入1.5 μL基質(zhì)溶液[10 g/Lα-氰基-4-羥基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, CHCA)]，混合后點于靶板上，靜置結(jié)晶、干燥后用MALDI-TOF-MS檢測。檢測條件：脈沖氮激光(337 nm)作為離子解吸電離源，加速電壓20 kV，采用線性分析模式，質(zhì)量范圍：3 000～20 000 (m/z)。找出SELDI-TOF-MS所篩選質(zhì)荷峰值的特異樣本。

5目標蛋白質(zhì)的LC-MS/MS分析

取20 μL純化的目標蛋白質(zhì)，加60 μL 8 mol/L尿素，使尿素的終濃度為6 mol/L，室溫振蕩20 min；加入0.8 μL 1 mol/L DTT，使其終濃度為10 mol/L，室溫振蕩1 h；再加入3.2 μL 1 mol/L碘乙酰胺，使其終濃度為40 mol/L，避光放置45 min；加入3.2 μL 1 mol/L DTT，終濃度為40 mol/L，振蕩20 min；加入400 μL 50 mol/L NH4HCO3稀釋樣品溶液，使尿素終濃度降為1 mol/L，pH 約8.0。每支樣品中加入0.1 μg蛋白酶K，37 ℃水浴1 h，加入甲酸調(diào)溶液pH<3，終止酶解反應。目標蛋白的酶解產(chǎn)物用LC-MS/MS進行分析。樣品溶液可以通過特定裝置直接上樣于自制的C18毛細管液相色譜柱。色譜柱及色譜條件：自制毛細管柱內(nèi)徑為100 μm，填料部分長100 mol/L，填料粒徑5 μm。流動相A：水，0.1%甲酸；流動相B：乙腈，0.1%甲酸；洗脫程序：100% A(0 min)→100%A (5 min)→5% B(5.1min)→65%B(60 min) →100% B (75 min) →100% B (85 min)；流速：200～800 nL/min。質(zhì)譜條件：采用數(shù)據(jù)依賴模式(data-dependent mode)，掃描質(zhì)量范圍：400～2 000 (m/z) ，每次選取全掃描(full scan)中5個信號最強的離子峰(母離子)進行二級質(zhì)譜(MS2)分析。

6LC-MS/MS分析數(shù)據(jù)的檢索

數(shù)據(jù)檢索利用Xcalibur的程序組件BioWorks 3.2完成，根據(jù)二級離子譜圖在NCBI的人類蛋白數(shù)據(jù)庫中檢索肽段序列。檢索參數(shù)設置見參考文獻[8]。

7統(tǒng)計學處理

帕金森病SELDI蛋白指紋圖譜用Biomarker Wizard 3.1軟件和Biomarker Patterns 4.0.1軟件進行分組及相關性分析，帕金森病組與對照組之間蛋白質(zhì)峰強度比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1帕金森病血清蛋白指紋圖譜分析

30例帕金森病患者和40例對照者血清的蛋白指紋圖譜經(jīng)標準化后，用 Biomarker Wizard軟件分析，在分子質(zhì)量2 000～20 000范圍內(nèi)共檢測到143個蛋白峰，見圖1。

Figure 1. Representative protein spectrum of a Parkinson disease sample detected by SELDI-TOF-MS combined with WCX magnetic beads，showing the protein mass/charge ratio between 2 000 and 20 000．A:healthy control; B: Parkinson’s disease.

圖1經(jīng)SELDI-TOF-MS結(jié)合WCX納米磁珠檢測帕金森病的血清蛋白質(zhì)指紋表達圖譜

2帕金森病血清蛋白指紋圖譜數(shù)據(jù)分析及帕金森病診斷模型的建立

經(jīng)Biomarker Patterns軟件進一步分析顯示，帕金森病患者外周血清蛋白質(zhì)表達譜與對照組相比，m/z為6 636、8 697和8 937的3個蛋白峰的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，其中m/z為8 937的蛋白峰在帕金森病組中明顯高于對照組，而m/z為6 636和8 697的蛋白峰則在對照組中相對高表達(P<0.01),見表2。用此模型分析30例帕金森病患者與40例對照者的質(zhì)譜結(jié)果，帕金森病患者檢出率為90.0%(27/30),健康者檢出率為92.5%(37/40)，見表3。根據(jù)差異蛋白及其特定組合，理論上可以區(qū)分帕金森病組與對照組。

表2帕金森病組與對照組血清蛋白質(zhì)峰強度的比較

Table 2. Conparison of signal intensity of various serum protein peaks between Parkinson’s disease and healthy control

Groupm/z663686978937Parkinsondisease5.43±2.66**20.22±9.57**27.47±16.58**Healthycontrol18.85±7.5051.13±26.225.01±3.47

**P<0.01vshealthy control.

3診斷模型的驗證

采用14例帕金森病患者與20例對照者檢測得到的蛋白指紋圖譜對已建立的帕金森病診斷模型進行驗證，驗證結(jié)果表明其對帕金森病診斷的帕金森病患者檢出率為85.7%(12/14)，健康者檢出率為90.0%(18/20),見表3。

表3帕金森病診斷模型的診斷特性

Table 3. Prediction results of the diagnostic model for Parkinson’s disease

GroupSampleCaseNo.Correctly-classifiedNo.Accuracy(%)TrainingsetParkinsondisease302790.0control403792.5BlindsetParkinsondisease141285.7Healthycontrol201890.0

4差異蛋白質(zhì)峰的純化

將帕金森病的3個差異蛋白質(zhì)峰(6 636、8 697和8 937)經(jīng)HPLC分離純化后，收集到不同的PCR管中，經(jīng)MALDI-TOF-MS檢測，發(fā)現(xiàn)3個純化樣本分別是相對分子質(zhì)量為6 632.9、8 697.2和8 933.1的特異蛋白質(zhì),見圖2。

5質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫檢索

將上述3管的蛋白質(zhì)樣品酶解后，采用LC-MS/MS測定該蛋白質(zhì)的酶解肽段，數(shù)據(jù)經(jīng)過Xcalibur的程序組件BioWorks 3.2 完成，根據(jù)二級離子譜圖在NCBI的人類蛋白數(shù)據(jù)庫中檢索肽段序列。最終鑒定m/z為6 636、8 697和8 937的標志物分別為載脂蛋白C-I、載脂蛋白 C-III 和補體3a(complement 3a,C3a)，見表4。

討 論

SELDI-TOF結(jié)合HPLC及LC-MS/MS技術組合是近年出現(xiàn)的一種新的蛋白質(zhì)研究方法，它集臨床蛋白質(zhì)組學差異蛋白篩選、鑒定為一體的較理想的技術平臺[9]。目前已在自身免疫性疾病[10]、感染性疾病[11]及惡性腫瘤[12-14]等多種疾病標志物篩選方面取得了突破性的進展，并且篩選出許多與疾病相關的新型生物標志物為臨床疾病的診斷和治療提供新的選擇[15-16]。

Figure 2. MALDI-TOF-MS atm/zof spectra of the three purified potential protein markers atm/zof 6 636, 8 697 and 8 937.

圖2m/z6636、8697和8937的3個差異蛋白經(jīng)蛋白純化后的MALDI-TOF-MS圖

在本研究中，我們通過SLEDI-TOF-MS技術結(jié)合WCX納米磁珠篩選出m/z6 636、8 697和8 937的蛋白質(zhì)標志物3個，其中8 937在帕金森病血清中高表達，6 636和8 697在帕金森病血清中低表達。由這3個標志物組合的診斷模型對帕金森病患者檢出率為90.0%(27/30),健康者檢出率為92.5%(37/40)。提示可以將這3個蛋白質(zhì)標志物作為帕金森病血清學診斷的指標。通過本研究建立的診斷模型對14例帕金森病組與20例對照組進行驗證，驗證結(jié)果對帕金森病患者檢出率為85.7%(12/14)，健康者檢出率為90.0%(18/20)。結(jié)合HPLC及LC-MS/MS技術對m/z為6 636、8 697和8 937的標志物進行鑒定,結(jié)果為載脂蛋白 C-I、載脂蛋白C-III 和C3a。

表4 帕金森病差異蛋白質(zhì)的氨基酸序列

m/z為6 636的蛋白為載脂蛋白 C-I，主要是在肝臟合成，極少一部分是由小腸合成，其主要的生物學功能是參與脂類代謝。目前已有報道關于應用SELDI-TOF技術篩選胰腺癌[17]和非小細胞肺癌[18]患者血清中的差異蛋白，發(fā)現(xiàn)m/z6 636的蛋白在胰腺癌和非小細胞肺癌患者血清中低表達，并鑒定為載脂蛋白 C-I，與本研究中m/z6 636的蛋白為同一蛋白。但至今，國內(nèi)外有關載脂蛋白 C-I與帕金森病的相關性研究報道甚少，有待進一步研究。m/z為8 697的蛋白為載脂蛋白C-III，載脂蛋白 C-III是由79個氨基酸殘基組成的分子量為8 800的糖蛋白，主要在肝臟合成，其次在小腸。載脂蛋白C-III主要分布于富三酰甘油脂蛋白和高密度脂蛋白(HDL)中。目前已有報道載脂蛋白C-III是心血管疾病的重要危險因素，可引起脂質(zhì)代謝異常，其直接參與致血管內(nèi)皮細胞功能失調(diào)過程，幾乎參與動脈粥樣硬化形成的全過程，被視為一個獨立的促炎和促粥樣硬化因素。此外，載脂蛋白C-III還具有阻止肝細胞攝取含載脂蛋白E的乳糜微粒殘體的作用。同時，F(xiàn)an等[12]通過SELDI技術篩選乳頭狀甲狀腺癌，發(fā)現(xiàn)m/z為8 697的蛋白在乳頭狀甲狀腺癌中低表達，與本研究中m/z8 697的蛋白相同。載脂蛋白C-III在帕金森病患者血清中呈低表達，提示帕金森病的發(fā)生可能對載脂蛋白C-III的表達起抑制作用。這可能與帕金森病的發(fā)生對載脂蛋白C-III合成部位的損害有關，載脂蛋白C-III表達下調(diào)的原因有待于進一步研究。m/z為8 937的蛋白峰鑒定為C3a。補體具有調(diào)節(jié)炎癥及免疫反應的功能，C3是由α和β鏈組成的，是血清中含量最豐富的補體成分，C3可裂解為C3a和C3b， C3a具有作為配體與細胞表面相應受體結(jié)合后,激發(fā)細胞脫顆粒,釋放組胺之類的血管活性介質(zhì)，從而增強血管通透性并刺激內(nèi)臟平滑肌收縮的功能，是一種過敏毒素。同時可對免疫應答的各個環(huán)節(jié)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，可成為炎癥的一種生物標志物。在本研究中，C3a在帕金森病中高表達，其機制尚不清楚，可能作為一種因子參與帕金森的發(fā)生與發(fā)展。

本研究鑒定出的載脂蛋白C-I、載脂蛋白C-III 和C3a在帕金森病診斷中的聯(lián)合應用具有較高的準確性，該聯(lián)合檢測模型可作為帕金森病的一種新的診斷方法。但由于這3個蛋白分別在胰腺癌、非小細胞肺癌以及乳頭狀甲狀腺癌中均有不同表現(xiàn)，并非帕金森病特有蛋白，因此在下一步研究中，我們將利用這3個蛋白組成的診斷模型擴大在帕金森病患者中的臨床早期診斷應用，并將該模型用于帕金森病的療效觀察中，以了解該模型在帕金森病診斷、療效觀察中的更多臨床意義。

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ScreeningandidentificationofspecificserumbiomarkersofParkinsondisease

ZHOU Ting1, LIU Chi-bo2, XU Xiao-hui1, LIANG Hai-yan1

(1DepartmentofNeurology,2DepartmentofClinicalLaboratory,TaizhouMunicipalHospitalAffiliatedtoTaizhouUniversitySchoolofMedicine,Taizhou318000,China.E-mail:dr_zhouting@yahoo.com.cn)

AIM: To screen the possible serum biomarkers of Parkinson’s disease.METHODSThe surface-enhanced laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (SELDI-TOF-MS) was used to screen the serum samples from 44 cases of Parkinson’s disease and 60 control subjects. The differentially expressed protein peaks were selected and isolated with high-performance liquid chromatography (HPLC), and processed with enzyme before analysis by liquid chromatography-mass spectrometry tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The data mining was performed by Xcalibur program component BioWorks 3.2.RESULTSThree differentially expressed protein peaks were selected as potential serum biomarkers from the patients of Parkinson’s disease: the protein at 8 937m/zpeak showed significant increase (27.47±16.58 in Parkinson’s disease group, and only 5.01±3.47 in control group), and the proteins at 6 636 and 8 697m/zpeaks showed significant decreases (5.43±2.66 and 20.22±9.57, respectively, in Parkinson’s disease group, and 18.85±7.56 and 51.13±26.22, respectively, in control group). The proteins at 6 636, 8 697 and 8 937m/zpeaks were identified as apolipoprotein C-I, apolipoprotein C-III and complement 3a,respectively. Combined use of these 3 biomarkers effectively distinguished the subjects between Parkinson’s disease group and control group. The detection rate of the patients with Parkinson’s disease was 90.0% (27/30), and the detection rate of the healthy sibkects was 92.5% (37/40).CONCLUSIONThe apolipoprotein C-I, apolipoprotein C-III and complement component 3a identified as potential markers of Parkinson’s disease have diagnostic value in clinical application.

Parkinson disease; Proteome; Surface-enhanced laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry; Liquid chromatography-mass spectrometry tandem mass spectromery

R741.04

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.04.016

1000- 4718(2013)04- 0664- 06

2012- 08- 31

2013- 03- 04

臺州市市級科技資金資助項目(No.102KY11)

△通訊作者 Tel: 0576-88858166; E-mail: dr_zhouting@yahoo.com.cn