黃芪多糖通過活化AMPK和促進(jìn)骨骼肌FAT/CD36轉(zhuǎn)位改善成肌細(xì)胞FFAs代謝*

胡陽(yáng)黔， 李 靜， 劉 堅(jiān)， 歐陽(yáng)靜萍， 宋 杰△

(1湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院，湖北 十堰 442000； 2湖北醫(yī)藥學(xué)院，湖北 十堰 442000； 3武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430079)

黃芪多糖通過活化AMPK和促進(jìn)骨骼肌FAT/CD36轉(zhuǎn)位改善成肌細(xì)胞FFAs代謝*

胡陽(yáng)黔1， 李 靜2， 劉 堅(jiān)2， 歐陽(yáng)靜萍3， 宋 杰1△

(1湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院，湖北 十堰 442000；2湖北醫(yī)藥學(xué)院，湖北 十堰 442000；3武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430079)

目的探討黃芪多糖(Astragaluspolysaccharides, APS)對(duì)骨骼肌游離脂肪酸(free fatty acids, FFAs)代謝的影響及其機(jī)制。方法培養(yǎng)小鼠C2C12成肌細(xì)胞；MTT法檢測(cè)不同濃度FFAs作用不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞活性的影響。根據(jù)MTT結(jié)果選取FFAs最適濃度和時(shí)間處理細(xì)胞并用APS干預(yù)，采用乙酰輔酶A合成酶-乙酰輔酶A氧化酶法檢測(cè)APS干預(yù)前后培養(yǎng)液FFAs濃度；Western blotting測(cè)APS干預(yù)前后細(xì)胞膜脂肪酸轉(zhuǎn)位酶(FAT/CD36)、總FAT/CD36、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(phosphorylated AMP-activated protein kinase, p-AMPK)和總AMPK蛋白表達(dá)。結(jié)果FFAs對(duì)細(xì)胞的毒性呈濃度和時(shí)間依賴性。與FFAs組比較，F(xiàn)FAs+APS組細(xì)胞膜FAT/CD36及p-AMPK蛋白表達(dá)增加(P<0.05)，而總FAT/CD36及總AMPK蛋白表達(dá)無明顯差異(P>0.05),同時(shí)培養(yǎng)液FFAs濃度降低，細(xì)胞活性增加(P<0.05)。結(jié)論APS可以增加骨骼肌細(xì)胞對(duì)FFAs的攝取利用，其機(jī)制可能與活化AMPK和促進(jìn)FAT/CD36轉(zhuǎn)位有關(guān)。

黃芪多糖； 游離脂肪酸； 腺苷酸活化蛋白激酶

目前研究認(rèn)為血漿游離脂肪酸(free fatty acids, FFAs)升高是引起胰島素抵抗的主要因素之一[1]。骨骼肌是游離脂肪酸攝取及胰島素抵抗發(fā)生的重要部位[2]。越來越多的證據(jù)表明FFAs通過干擾胰島素的作用、抑制葡萄糖代謝而導(dǎo)致胰島素抵抗，所以針對(duì)FFAs代謝可以提供一條很有前途的改善胰島素抵抗和治療2型糖尿病的途徑。本實(shí)驗(yàn)室毛先晴等[3]研究證實(shí)黃芪多糖(Astragaluspolysaccharides, APS)治療可明顯改善高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗。本研究在上述背景基礎(chǔ)上，就骨骼肌細(xì)胞對(duì)FFAs的代謝以及應(yīng)用黃芪多糖進(jìn)行干預(yù)，探討黃芪多糖對(duì)骨骼肌FFAs代謝的影響以及可能機(jī)制。

材 料 和 方 法

1主要試劑和儀器

小鼠C2C12成肌細(xì)胞購(gòu)自ATCC；低糖DMEM購(gòu)自Sigma；優(yōu)化水煎工藝從膜莢黃芪(上海藥材公司)中提取APS(80～120 kD)(湖北中醫(yī)學(xué)院藥用植物鑒定教研室鑒定)[4]；MTT和AMPK抑制劑compound C購(gòu)自Sigma；游離脂肪酸檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Wako；AMPKα Antibody購(gòu)自Cell Signaling Technology； p-AMPK 抗體購(gòu)自Upstate；脂肪酸轉(zhuǎn)位酶(fatty acid translocase,FAT/CD36)抗體購(gòu)自Santa Cruz；長(zhǎng)鏈游離脂肪酸(oleate∶palmitate=2∶1)購(gòu)自Sigma。

2細(xì)胞傳代和培養(yǎng)

C2C12成肌細(xì)胞用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3實(shí)驗(yàn)分組

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，倒出培養(yǎng)液，用無菌的緩沖液沖洗3次，0.25%胰酶消化，然后計(jì)數(shù)每個(gè)培養(yǎng)瓶的細(xì)胞密度，以1×109/L轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶。測(cè)FFAs作用時(shí)間分以下時(shí)間組：0、24 h、48 h和72 h；測(cè)FFAs作用濃度分以下濃度組：0、0.25、0.5和0.75 mmol/L。測(cè)培養(yǎng)液FFAs濃度變化、AMPK、p-AMPK及FAT/CD36表達(dá)情況，如下分組： (1)control組； (2)APS組，APS(200 mg/L)干預(yù)細(xì)胞24 h； (3)FFAs組， 0.25mmol/L FFAs干預(yù)細(xì)胞24 h；(4) FFAs+APS組， 0.25 mmol/L FFAs及APS(200 mg/L)共同干預(yù)細(xì)胞24 h； (5)FFAs+APS+compound C組，compound C+FFAs+APS共同干預(yù)細(xì)胞24 h。

4主要方法

4.1MTT實(shí)驗(yàn) (1)取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，以濃度2×107/L的細(xì)胞懸液接種96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)12 h細(xì)胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)液，按實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。(2)在24 h的前4 h各取培養(yǎng)板1塊，每孔加入濃度為5 g/L MTT 50 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸棄上清液后向每孔加入20% DMSO 100 μL，振蕩后在酶標(biāo)儀上以490 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度(A)。

4.2Western blotting檢測(cè) 將處理后的細(xì)胞裂解后，置4 ℃采用超速離心法分離提取總蛋白及胞膜蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒定量。煮沸5 min，SDS-PAGE分離蛋白后，轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，封閉、漂洗后加入Ⅰ抗于4 ℃孵育過夜，漂洗后再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗兔Ⅱ抗(1∶800稀釋，KPL公司)室溫孵育1 h，漂洗后ECL顯色，用高清晰度彩色病理細(xì)胞測(cè)量程序的圖形分析軟件系統(tǒng)測(cè)出相對(duì)吸光度值。

4.3培養(yǎng)液游離脂肪酸濃度測(cè)定 按試劑盒說明書步驟采用乙酰輔酶A合成酶(acetyl-CoA synthase,ACS)-乙酰輔酶A氧化酶(acetyl-CoA oxidase,ACOD)法測(cè)定。將培養(yǎng)液放置室溫，用自動(dòng)加樣器移取10 μL；加入400 μL發(fā)色試劑A；5 min后，加入200 μL發(fā)色劑B；10 min后，測(cè)定吸光度，主波長(zhǎng)546 nm，副波長(zhǎng)660 nm。FFAs濃度測(cè)定由全自動(dòng)生化儀完成，單位用mmol/L表示。

5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，并采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，組間差異用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

10.25mmol/LFFAs作用不同時(shí)間對(duì)C2C12細(xì)胞活性的影響

0.25 mmol/L FFAs作用不同時(shí)間(24、48和72 h)，各組細(xì)胞活性均明顯低于control組，隨著FFAs作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞活性逐漸降低，見表1。

△P<0.05vscontrol;▲P<0.05vs24 h.

2不同濃度FFAs作用24h對(duì)C2C12細(xì)胞活性的影響

不同濃度FFAs作用細(xì)胞24 h，各組細(xì)胞活性均明顯低于對(duì)照組，隨著FFAs作用濃度的增加，細(xì)胞活性逐漸降低，見表2。

30.25mmol/LFFAs與APS共同作用24h對(duì)C2C12細(xì)胞活性的影響

APS組與對(duì)照組差異無顯著(P>0.05)。FFAs+APS組細(xì)胞活性明顯高于FFAs組(P<0.05)，F(xiàn)FAs+APS+compound C組細(xì)胞活性與FFAs組比無顯著差異(P>0.05)，見表3。

表2不同濃度FFAs作用24h對(duì)C2C12細(xì)胞活性的影響

Table 2. The effects of different oncentrations of FFAs on viability of C2C12 myoblasts for 24 h (mean±SD.n=8)

Group0h24hControl0.817±0.0150.838±0.0470.25mmol/LFFAs0.814±0.0240.404±0.032△0.5mmol/LFFAs0.813±0.0430.212±0.047△▲0.75mmol/LFFAs0.825±0.0330.105±0.037△▲

△P<0.05vscontrol;▲P<0.05vs0.25 mmol/L FFAs.

表3APS對(duì)FFAs導(dǎo)致C2C12細(xì)胞活性變化的影響

Table 3. The effects of APS on FFA-induced viability changes of C2C12 myoblasts (mean±SD.n=8)

Group0h24hControl0.832±0.0150.821±0.024APS0.821±0.0770.833±0.019FFAs0.825±0.0770.414±0.040△FFAs+APS0.845±0.0690.775±0.046▲FFAs+APS+compoundC0.831±0.0250.423±0.057

△P<0.05vscontrol;▲P<0.05vsFFAs.

4培養(yǎng)液游離脂肪酸濃度測(cè)定

FFAs+APS組培養(yǎng)液FFAs濃度明顯低于FFAs組(P<0.05)，F(xiàn)FAs+APS+compound C組培養(yǎng)液濃度與FFAs組無顯著差異(P>0.05)。APS組及對(duì)照組按分組需要未加入FFAs處理,見表4。

表4APS干預(yù)對(duì)培養(yǎng)液中FFAs濃度的影響

Table 4. The effects of APS on the concentration of FFAs in the culture medium (mmol/L.Mean±SD.n=8)

Group0h24hControl00APS00FFAs0.250±0.0560.231±0.053FFAs+APS0.255±0.0410.134±0.023△FFAs+APS+compoundC0.261±0.0350.227±0.039

△P<0.05vsFFAs.

5AMPK、p-AMPK和FAT/CD36的表達(dá)

圖1顯示，各組總AMPK表達(dá)無顯著差異(P>0.05)；FFAs組p-AMPK較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)；而FFAs+APS組p-AMPK較FFAs組顯著增加(P<0.05)；FFAs+APS+compound C組p-AMPK與FFAs組相比無顯著差異(P>0.05)。各組總FAT/CD36表達(dá)無顯著差異(P>0.05)；FFAs組細(xì)胞膜FAT/CD36表達(dá)較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)；而FFAs+APS組細(xì)胞膜FAT/CD36表達(dá)較FFAs組和FFAs+APS+compound C組顯著增加(P<0.05)。

Figure 1. The expression of FAT/CD36, AMPK and p-AMPK proteins. C: control group; A: APS group; F: FFAs group; F+A: FFAs+APS group; F+A+CC: FFAs+APS+compound C group. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsC;▲P<0.05vsF or F+A+CC.

圖1FAT/CD36、AMPK和p-AMPK蛋白的表達(dá)

討 論

FFAs是引起胰島素抵抗的最主要非激素物質(zhì)之一, 這已經(jīng)為大量流行病學(xué)資料所證實(shí)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明, 在眾多心血管疾病的危險(xiǎn)因素中胰島素抵抗處于核心地位, 或者說胰島素抵抗是滋生多種代謝相關(guān)疾病的共同土壤。

無論是對(duì)STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病動(dòng)物模型，還是遺傳性2型糖尿病模型(KKAy小鼠)或胰島素抵抗模型，APS都具有增加胰島素敏感性、改善糖耐量、降低血糖和血脂、減少肝臟脂肪沉積以及減輕體重等作用[5-7]。

本研究通過培養(yǎng)小鼠C2C12成肌細(xì)胞，采用不同濃度FFAs作用持續(xù)不同時(shí)間，發(fā)現(xiàn)FFAs對(duì)C2C12細(xì)胞的毒性呈濃度和時(shí)間依賴性：FFAs濃度越高、作用時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞活性越低。FFAs采用了接近于臨床、更有利于反映病人實(shí)際的濃度(0.25 mmol/L)；為保證細(xì)胞的最佳活性，選取24 h作為FFAs的干預(yù)時(shí)間。與FFAs組比較，F(xiàn)FAs與APS共同作用于細(xì)胞后細(xì)胞活性明顯增加。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)證實(shí)FFAs增高可導(dǎo)致三羧酸循環(huán)減慢和枸櫞酸聚集，反饋調(diào)節(jié)而使糖氧化受到抑制、糖攝取減少、酯化增強(qiáng)、脂解減弱，進(jìn)而導(dǎo)致脂質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)蓄積和能量供應(yīng)短缺。FFAs組的細(xì)胞活性下降可能與此有關(guān)。而后續(xù)的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，F(xiàn)FAs+APS組中APS可以促進(jìn)FFAs的攝取和氧化，增強(qiáng)脂解，為細(xì)胞提供能量，從而改善了細(xì)胞活性。

為進(jìn)一步研究APS對(duì)C2C12細(xì)胞游離脂肪酸攝取的影響及其機(jī)制,我們采用上述濃度的FFAs處理細(xì)胞，用APS進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)APS可以促進(jìn)C2C12細(xì)胞對(duì)FFAs的攝取。對(duì)于上述機(jī)制的探索，我們注意到近年較受關(guān)注的FAT/CD36。FAT/CD36廣泛分布在心臟、小腸、骨骼肌、脂肪等組織，它對(duì)脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)具有重要作用。胞漿內(nèi)的FAT/CD36不能有效轉(zhuǎn)運(yùn)長(zhǎng)鏈脂肪酸。FAT/CD36從細(xì)胞內(nèi)庫(kù)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜是肌細(xì)胞攝取脂肪酸的重要調(diào)節(jié)機(jī)制[8]。本研究證實(shí)高FFAs抑制FAT/CD36由細(xì)胞內(nèi)庫(kù)向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位，從而不利于能源物質(zhì)攝取。Western blotting結(jié)果證實(shí)APS可增加高FFAs狀態(tài)下骨骼肌細(xì)胞FAT/CD36由細(xì)胞內(nèi)庫(kù)向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位。這可能是APS促進(jìn)FFAs攝取的機(jī)制。

隨后我們進(jìn)一步研究了APS促進(jìn)FAT/CD36轉(zhuǎn)位機(jī)制。我們先前研究發(fā)現(xiàn)APS可以活化AMPK[9]。Luiken等[10]研究發(fā)現(xiàn)，用AMPK的激活劑AICAR刺激心肌細(xì)胞可以增加脂肪酸的攝取，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)FAT/CD36轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上的含量增加。Chabowski等[11]研究發(fā)現(xiàn)，用AICAR長(zhǎng)期刺激心肌細(xì)胞后，F(xiàn)AT/CD36的mRNA和蛋白水平均顯著增加。Pandke等[12]使用AMPK的激動(dòng)劑β-胍基丙酸作用于心肌細(xì)胞后，其FAT/CD36的總蛋白及膜蛋白顯著增加。在本研究中，通過比較分析FFAs+APS+ compound C組與FFAs+APS組蛋白表達(dá)情況，說明在AMPK抑制劑存在的情況下，APS活化AMPK的通路被阻斷，進(jìn)而APS促進(jìn)FAT/CD36轉(zhuǎn)位的作用被抑制,證實(shí)APS是通過活化AMPK進(jìn)而促進(jìn)FAT/CD36向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位，從而增加FFAs的攝取。而AMPK活化后促進(jìn)FAT/CD36向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位的機(jī)制目前尚不清楚，需要我們繼續(xù)研究。

在我們先前研究中[9]還發(fā)現(xiàn)，在高FFAs處理24 h后的C2C12細(xì)胞，APS可以活化AMPK進(jìn)而抑制乙酰輔酶A羧化酶活性，從而促進(jìn)FFAs氧化分解，減少FFAs在細(xì)胞內(nèi)蓄積，同時(shí)為細(xì)胞提供能量。FFAs在細(xì)胞內(nèi)蓄積可導(dǎo)致細(xì)胞毒性，APS減輕脂質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)蓄積的作用具有重要的意義，它可能是APS減輕FFAs細(xì)胞毒性的重要機(jī)制。上述兩方面研究證實(shí),APS活化AMPK不僅可以增加FFAs攝取，而且可以促進(jìn)進(jìn)入細(xì)胞的FFAs氧化分解，為細(xì)胞提供能量，從而改善細(xì)胞脂代謝和細(xì)胞活性。

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APSimprovesfreefattyacidmetabolismbyactivatingAMPKandpromotingtranslocationofFAT/CD36inC2C12myoblasts

HU Yang-qian1, LI Jing2, LIU Jian2, OU-YANG Jing-ping3, SONG Jie1

(1DongfengAffiliatedHospitalofHubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,China;2HubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,China;3MedicalSchoolofWuhanUniversity,Wuhan430079,China.E-mail:doctorsongjie@163.com)

AIM: To investigate the effect ofAstragaluspolysaccharides (APS) on the metabolism of free fatty acids (FFAs) in C2C12 myoblasts.METHODSCultured C2C12 myoblasts were used in the study. The viability of C2C12 myoblasts treated with FFAs at different concentrations for different time was observed by MTT assay. The concentrations of FFAs in the medium were detected by acetyl-CoA synthase (ACS)-acetyl-CoA oxidase (ACOD) method. The expression of fatty acid translocase (FAT/CD36), AMPK and p-AMPK protein was examined by Western blotting.RESULTSFFAs decreased the viability of C2C12 myoblasts in a time- and concentration-dependent manner. Compared with FFAs group, the expression of cellular membrane FAT/CD36 and p-AMPK proteins increased in FFAs+APS group, but total AMPK and FAT/CD36 protein expression was not significantly changed. Meanwhile, the concentration of FFAs in the medium decreased and the cell viability increased in FFAs+APS group as compared with the group.CONCLUSIONAPS improves the metabolism of FFAs by activating AMPK and promoting translocation of FAT/CD36 in C2C12 myoblasts.

Astragaluspolysaccharides; Free fatty acids; AMP-activated protein kinases

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.04.011

1000- 4718(2013)04- 0637- 04

2012- 10- 08

2013- 03- 01

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30370673; No.30770734); 十堰市科技局科技項(xiàng)目(No.ZD2012037)

△通訊作者 Tel： 0719-8272543； E-mail： doctorsongjie@163.com