靶向MAG基因shRNA慢病毒載體的構(gòu)建及其對(duì)MAG基因表達(dá)的沉默*

陳 舒， 羅 銘， 蔡望青， 李方成， 何志威， 劉安民△

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院 1神經(jīng)外科， 2腫瘤科，廣東 廣州 510120； 3香港中文大學(xué)，中國 香港)

·實(shí)驗(yàn)技術(shù)·

靶向MAG基因shRNA慢病毒載體的構(gòu)建及其對(duì)MAG基因表達(dá)的沉默*

陳 舒1， 羅 銘2， 蔡望青1， 李方成1， 何志威3， 劉安民1△

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院1神經(jīng)外科，2腫瘤科，廣東 廣州 510120；3香港中文大學(xué)，中國 香港)

目的設(shè)計(jì)以MAG基因?yàn)榘悬c(diǎn)的短發(fā)夾狀RNA(shRNA)，構(gòu)建重組慢病毒載體并鑒定此RNA干擾體系對(duì)MAG基因表達(dá)的影響。方法將3條靶向大鼠MAG基因的shRNA片段插入至慢病毒載體pWPI，與pCDNA3-MAG-FLAG質(zhì)粒用Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，Western blotting法鑒定出最有效的shRNA。此重組質(zhì)粒與pAX2和pMD2G經(jīng)293T細(xì)胞包裝后，產(chǎn)生的重組慢病毒感染少突膠質(zhì)細(xì)胞，48 h后Western blotting法檢測(cè)MAG蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果經(jīng)雙酶切后測(cè)序鑒定，構(gòu)建了MAGshRNA慢病毒載體pWPI-MAG，鑒定出shRNA-2為最為有效的shRNA。重組慢病毒能明顯抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞中MAG的表達(dá)。結(jié)論慢病毒介導(dǎo)的shRNA干擾技術(shù)可特異性阻斷MAG的表達(dá)，為進(jìn)一步探討MAG特異性shRNA治療神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘損傷奠定了基礎(chǔ)。

短發(fā)夾狀RNA； 髓鞘相關(guān)糖蛋白； 慢病毒

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)后的病理損傷機(jī)制至今尚不完全明確[1]。近來的研究發(fā)現(xiàn)，ICH后存在脫髓鞘的白質(zhì)纖維損害，神經(jīng)通路受損是ICH后神經(jīng)功能的缺損重要原因[2]。近期我們研究發(fā)現(xiàn)，ICH后維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)纖維髓鞘結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定重要結(jié)構(gòu)的髓鞘相關(guān)糖蛋白(myelin-associated glycoprotein,MAG)顯著升高，MAG是反映ICH后脫髓鞘病變的敏感標(biāo)記物[3-4]。許多研究證實(shí)，髓鞘的相關(guān)抑制因子(如MAG等)是神經(jīng)再生的關(guān)鍵抑制因素[5-6]。靶向干擾技術(shù)可沉默目的基因的表達(dá)[7-8]。本研究采用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建重組慢病毒載體，篩選鑒定出的shRNA能高效、特異性抑制MAG的表達(dá)，為研究MAG調(diào)控髓鞘損傷和再生治療提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1主要試劑、質(zhì)粒、菌種及細(xì)胞株

大腸桿菌DH5α和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen，人少突膠質(zhì)細(xì)胞株及293T細(xì)胞自ATCC引進(jìn)?；驕y(cè)試儀為ABI PRISM377 DNA測(cè)試儀，攜帶綠色熒光蛋白基因的慢病毒載體系統(tǒng)pWPI 和其包裝質(zhì)粒pAX2、pMD2G由香港中文大學(xué)惠贈(zèng)，pWPI具有綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)標(biāo)志。限制性內(nèi)切酶NotⅠ、PmeI和T4 DNA連接酶購自Bio-Lab，DNA聚合酶Klenow大片段購自Promega，質(zhì)粒抽提試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Qiagen，鼠抗人MAG單克隆抗體購自Santa Cruz，兔抗GFP多克隆抗體購自Abcam。

2MAG基因shRNA靶序列的設(shè)計(jì)

根據(jù)MAG(NM_017190.4)基因信息，設(shè)計(jì)shRNA1、shRNA2和shRNA3三條針對(duì)MAG基因編碼序列區(qū)163～2043的siRNA序列。siRNA1：5’-GGAGAUGAAUUCCUCUGUGTT-3’；siRNA2：5’-GGUGUCACUGCUACACUUCTT-3’；siRNA3：5’-GGCGUCUGGUAUUUCAACATT-3’；同時(shí)設(shè)計(jì)一條序列negative用于對(duì)照組實(shí)驗(yàn)，通過BLAST驗(yàn)證該序列對(duì)于任何基因無干擾效果。陰性對(duì)照：5’-TTCTCCGAGCGTGCACGT-3’。根據(jù)上述4條shRNA序列，設(shè)計(jì)4對(duì)互補(bǔ)的單鏈DNA，包括shRNA的正義鏈和反義鏈，送上海吉瑪公司合成。單鏈DNA的正義鏈序列按5’向3’順序依次為：酶切位點(diǎn)(NotⅠ)、干擾序列(19 bp)、loop環(huán)、干擾序列的反向互補(bǔ)序列、終止信號(hào)和酶切位點(diǎn)(PmeⅠ)。

3將合成的shRNA序列插入到載體pWPI中

將合成的單鏈DNA片段退火形成雙鏈DNA，分別定向克隆至NotⅠ和PmeⅠ雙酶切后的空載體pWPI中，獲得重組慢病毒載體，轉(zhuǎn)化DH5α，涂布Amp抗性的LB平板，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取陽性菌落接種于Amp+LB液體培養(yǎng)基中，將每個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定。利用基因克隆時(shí)的引物, 運(yùn)用DYEnamic ET terminator cycle 測(cè)序試劑盒在ABI PRISM377 DNA sequencer對(duì)pWPI-MAG中MAG基因進(jìn)行自動(dòng)測(cè)序, 與GenBank中正常MAG開放閱讀框序列比較。測(cè)序正確的菌株采用高純度質(zhì)粒中量抽提試劑盒抽提，用于后續(xù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

4有效干擾序列的篩選

用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前24 h于6孔板中接種細(xì)胞，密度為1×105cells/well，待細(xì)胞生長(zhǎng)至約70%匯片時(shí)換無血清DMEM培養(yǎng)基。將3種帶有shRNA的重組慢病毒載體pWPI-MAG-shRNA1/2/3分別與真核表達(dá)載體混合物經(jīng)LipofectamineTM2000共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，并設(shè)立空慢病毒載體作為對(duì)照。具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。培養(yǎng)72 h后收集包含病毒的細(xì)胞，以Western blotting 法評(píng)定3種siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的干擾效果，篩選出最有效的siRNA。

天啊，從2.6萬到24萬不等？看電影《唐山大地震》時(shí)，蘇楠哭得一塌糊涂。難道，它比唐山大地震還慘烈？蘇楠不信，繼續(xù)搜。如果一切屬實(shí)的話，這可是遂平繼嵖岈山衛(wèi)星人民公社之后又一件聞名全國的事件。

5慢病毒的包裝與滴度測(cè)定

將293T細(xì)胞置于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)盤中，培養(yǎng)過夜后將篩選出的重組慢病毒載體pWPI-shRNA與包裝質(zhì)粒pAX2和pMD2G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。同時(shí)設(shè)立空載體為對(duì)照組。72 h后收集含病毒的細(xì)胞培養(yǎng)上清，并用0.45 μm孔徑的濾器過濾。將粗提液進(jìn)行慢病毒純化和濃縮試劑盒純化濃縮，-80 ℃保存。取出部分慢病毒濃縮液系列稀釋后感染293T細(xì)胞，利用綠色熒光蛋白表達(dá)測(cè)定慢病毒滴度。

6慢病毒感染少突膠質(zhì)細(xì)胞

將少突膠質(zhì)細(xì)胞以1×109/L的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量和制備的3種病毒滴度，以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)不同值感染少突膠質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)添加polybrene至8 mg/L ，感染12 h后換液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后于熒光顯微鏡下觀察感染細(xì)胞陽性率。將備用的病毒液感染48 h后，目的細(xì)胞出現(xiàn)熒光，用于細(xì)胞的蛋白提取及檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

7少突膠質(zhì)細(xì)胞株中MAG蛋白表達(dá)的檢測(cè)

用預(yù)冷的PBS溶液洗滌各組細(xì)胞3次，加入PMSF裂解液裂解細(xì)胞，放置冰上30 min，收集細(xì)胞裂解物至1.5 mL的EP管中離心抽提上清，用Bradford蛋白濃度測(cè)量試劑盒測(cè)定標(biāo)本中蛋白質(zhì)的濃度。每孔取10 μg上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜上，200 V、1.5 h。用含有5%脫脂奶粉Tris緩沖液封閉1 h后，加入1∶500稀釋的兔抗MAG多克隆抗體，37 ℃孵育1 h。用TBST洗膜3次后，加入1∶1 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，繼續(xù)孵育1 h。洗膜3次后，ECL發(fā)光試劑對(duì)PVDF膜進(jìn)行顯色反應(yīng)，顯影。以β-actin作為內(nèi)參照。

8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組資料間的比較采用Student’st檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

構(gòu)建含有MAG-shRNA的重組慢病毒質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后提取質(zhì)粒，與空載體均經(jīng)NotⅠ和PmeI雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。shRNA1、shRNA2和shRNA3質(zhì)粒DNA測(cè)序結(jié)果證實(shí)重組的RNA干擾慢病毒載體均有一段與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合成的靶向鏈相符。測(cè)序結(jié)果顯示, pWPI-MAG中MAG序列與GenBank NM_017190.4 中MAG序列一致，重組pWPI-MAG構(gòu)建成功，見圖1。

Figure 1. Partial sequencing maps of pWPI-MAGpositive clones. A:shRNA1; B:shRNA2; C:shRNA3.

圖1pWPI-MAG陽性克隆的部分序列

2慢病毒滴度測(cè)定和細(xì)胞的感染效率

重組慢病毒載體在293T細(xì)胞中成功組裝并濃縮。應(yīng)用濃縮系列稀釋后感染293T細(xì)胞，通過觀察綠色熒光蛋白表達(dá)測(cè)定慢病毒滴度，病毒滴度均可達(dá)1012TU/L。構(gòu)建的3種重組慢病毒載體pWPI-MAG-shRNA1/2/3均可有效感染293T細(xì)胞，感染效率無明顯差異(P>0.05)，且隨MOI的增加感染效率也隨之增加，在MOI=10～500時(shí)，增加最為明顯，而MOI <10時(shí)，感染效率較低，而>500時(shí)感染效率進(jìn)入平臺(tái)期。在MOI=50的情況下，感染效率均可達(dá)70%～90%，見圖2。

Figure 2. pWPI-MAG-shRNA transfected into 293T cells (×200).A:light microscope;B:fluorescence microscope.

圖2pWPI-MAG-shRNA轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞

3有效干擾MAG表達(dá)質(zhì)粒的篩選

收集病毒感染的293T細(xì)胞，提取總蛋白進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，結(jié)果顯示，siRNA2組干擾效果最好，MAG的表達(dá)明顯被抑制，而shRNA1/3、control shRNA及空質(zhì)粒組幾乎沒有干擾效果，見圖3。

Figure 3. The MAG protein expression in 293T cells. Control:empty plasmid transfection.

圖3MAG特異性shRNA對(duì)293T細(xì)胞MAG蛋白表達(dá)的影響

4慢病毒載體抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞MAG蛋白的表達(dá)

將篩選出的重組慢病毒載體pWPI-MAG-shRNA2與包裝質(zhì)粒pAX2和pMD2G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，利用合成的pWPI-MAG-shRNA病毒液可直接感染少突膠質(zhì)細(xì)胞，48 h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率達(dá)80%。將感染了pWPI-MAG-shRNA的少突膠質(zhì)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，獲得可以穩(wěn)定低表達(dá)MAG的少突膠質(zhì)細(xì)胞株。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，pWPI-MAG-shRNA2轉(zhuǎn)染的少突膠質(zhì)細(xì)胞株MAG蛋白的表達(dá)明顯降低，見圖4。

討 論

在我國ICH發(fā)病率為每年60～80人次/10萬人口，ICH急性期病死率高，即使幸存者中約有75%不同程度喪失勞動(dòng)能力，重度致殘者占40%以上，給社會(huì)和家庭帶來了巨大的負(fù)擔(dān)。由于對(duì)ICH的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，臨床實(shí)踐中還缺乏統(tǒng)一和有效的治療方法。ICH后的占位效應(yīng)可對(duì)鄰近的組織產(chǎn)生機(jī)械壓迫和損傷，導(dǎo)致相應(yīng)的神經(jīng)功能表現(xiàn)[1]。近來研究發(fā)現(xiàn)，ICH后可引起血腫周圍髓鞘和軸索損傷，維持神經(jīng)纖維髓鞘結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定的MAG等出現(xiàn)明顯改變；由此導(dǎo)致的脫髓鞘損傷是ICH后神經(jīng)功能缺損的重要原因[2-4]。

Figure 4. Protein expression of MAG in oligodendrocytes after lentivirus infection detected by Western blotting. Control: empty plasmid transfection. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol.

圖4Westernblotting檢測(cè)慢病毒感染少突膠質(zhì)細(xì)胞后MAG蛋白的表達(dá)

MAG是一種跨膜糖蛋白，定位于直接和軸突相接觸的髓鞘膜的最里層，它通過介導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞與軸突的相互作用參與髓鞘的形成及其完整性的維持；MAG在髓鞘和軸突界面的特殊定位以及它在發(fā)育中的早期表達(dá)，提示該分子可能介導(dǎo)了軸突與膠質(zhì)細(xì)胞間的早期相互作用，參與髓鞘化的啟動(dòng)及髓鞘化軸突與膠質(zhì)突起之間穩(wěn)定連接的維持[9]。MAG在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有維持髓鞘完整性和抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突再生的作用[5-6]；而通過免疫耗竭法除去MAG后，可明顯減少髓鞘對(duì)軸突生長(zhǎng)的抑制作用[9]。在合適的微環(huán)境下可以利于髓鞘的再生，即可以通過抑制阻礙再生和增強(qiáng)促進(jìn)再生的因素來促進(jìn)神經(jīng)的再生能力[10]。因此，對(duì)MAG與ICH后髓鞘損傷的關(guān)系研究，有助于進(jìn)一步闡明髓鞘損傷機(jī)制，為髓鞘再生的治療尋找新的分子治療靶點(diǎn)。

RNA干擾是由雙鏈RNA介導(dǎo)的、在mRNA水平關(guān)閉相應(yīng)基因表達(dá)的過程，具有普遍性、高效性、特異性和記憶性，以及簡(jiǎn)單、快速關(guān)閉特定基因功能的優(yōu)點(diǎn)[11]。利用RNA干擾技術(shù)能夠在轉(zhuǎn)錄后水平高效特異地阻斷基因的表達(dá)通路，影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游反應(yīng)[7-8]。依據(jù)RNA干擾的技術(shù)原理，本研究首先設(shè)計(jì)了3條靶向MAG基因的shRNA片段，其相對(duì)分子量小，如果直接瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，干擾作用效果不持久。由于重組慢病毒基因轉(zhuǎn)移方法具有高效、快速和持續(xù)表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)[3-4,7-8，11]，為RNA干擾技術(shù)應(yīng)用于治療創(chuàng)造可能。本實(shí)驗(yàn)將重組質(zhì)粒與真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，篩選到有效的干擾序列為shRNA2;進(jìn)一步將針對(duì)MAG的干擾載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人少突膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)干擾載體shRNA2對(duì)MAG基因有顯著沉默效果，帶有干擾序列shRNA2的重組慢病毒能明顯抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)MAG蛋白的表達(dá)。這為深入研究MAG在髓鞘損傷的發(fā)病機(jī)制和髓鞘再生的靶向治療奠定基礎(chǔ)。

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ConstructionofshorthairpinRNAlentiviralvectortargetingMAGgeneanditssilencingeffectonMAGgene

CHEN Shu1, LUO Ming2, CAI Wang-qing1, LI Fang-cheng1, HE Zhi-wei3, LIU An-min1

(1DepartmentofNeurosurgery,2DepartmentofOncology,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China;3TheChineseUniversityofHongkong,Hongkong,China.E-mail:docliuam@yahoo.com.cn)

AIM: To construct lentiviral vector-based short hairpin RNA (shRNA) targeting myelin-associated glycoprotein (MAG) gene and to evaluate its inhibitory effect on the expression ofMAGgene.METHODSThree shRNA fragments targetingMAGgene (shRNA1, shRNA2 and shRNA3) were designed and cloned into lentiviral vector pWPI. The three recombinant plasmids were identified by enzyme digestion and sequencing. Positive plasmids were co-transfected with pCDNA3-MAG-FLAG into 293T cells, and the most effective shRNA for knockdown ofMAGgene was screened by Western blotting. Cells transfected with empty pWPI served as a control. Oligodendrocytes were infected with recombinant lentivirus that was produced by 293T packaging cells co-transfected with the most effective shRNA, pAX2 and pMD2G. After 48 h, the expression of MAG protein was measured by Western blotting.RESULTSTheMAGshRNA lentiviral vectors were confirmed by double enzyme digestion and sequencing, and shRNA2 showed the highest inhibitory efficacy among the three shRNA fragments. Recombinant lentivirus carrying shRNA-2 markedly decreased the expression of MAG protein in oligodendrocytes.CONCLUSIONLentiviral vector-based shRNA targetingMAGgene specifically knocks down the gene expression, which provides a useful tool for investigating the role ofMAG-specific shRNA in regulating myelination of central nerve system.

Short hairpin RNA; Myelin-associated glycoprotein; Lentivirus

R737.25

A

1000- 4718(2013)09- 1725- 04

2013- 03- 19

2013- 07- 12

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. S2011010002638); 廣東省科技社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(No. 2012B031800356)

△通訊作者 Tel: 020-81332016; E-mail: docliuam@yahoo.com.cn

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.034