Nrf2過表達(dá)對乙醇刺激下肝星狀細(xì)胞激活與增殖及合成I型膠原的影響*

劉 曼， 何 月， 張吉翔

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江西省分子重點實驗室，江西 南昌 330006)

Nrf2過表達(dá)對乙醇刺激下肝星狀細(xì)胞激活與增殖及合成I型膠原的影響*

劉 曼， 何 月， 張吉翔△

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江西省分子重點實驗室，江西 南昌 330006)

目的探討核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)過表達(dá)對乙醇誘導(dǎo)下大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6激活與增殖及I型膠原mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響。方法采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法對HSC-T6進(jìn)行pEGFP-Nrf2重組質(zhì)粒及pEGFP-N1空載質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染，將細(xì)胞分為正常對照組、乙醇刺激組、乙醇刺激+pEGFP-Nrf2質(zhì)粒組和乙醇刺激+ pEGFP-N1空載質(zhì)粒組。采用RT-PCR及Western blotting方法對HSC-T6中Nrf2、I型膠原及α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)mRNA及蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測，采用MTT法對HSC-T6細(xì)胞增殖水平進(jìn)行檢測，采用流式細(xì)胞術(shù)對HSC-T6細(xì)胞周期分布進(jìn)行檢測。結(jié)果(1) 熒光顯微鏡下觀察顯示pEGFP-Nrf2質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染HSC-T6，轉(zhuǎn)染后48h Nrf2 mRNA及蛋白表達(dá)水平較其余組顯著升高(P<0.05)。(2) 乙醇刺激組與乙醇刺激+ pEGFP-N1空載質(zhì)粒組之間細(xì)胞增殖水平、I型膠原、α-SMA mRNA及蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，均明顯高于正常對照組(P<0.05)，細(xì)胞周期分布G1期比例下降，S期比例升高(P<0.05)，而乙醇刺激+ pEGFP-Nrf2質(zhì)粒組細(xì)胞增殖水平及I型膠原、α-SMA mRNA及蛋白表達(dá)水平與乙醇刺激組及乙醇刺激+ pEGFP-N1空載質(zhì)粒組相比均顯著下降(P<0.05)，細(xì)胞周期分布G1期比例顯著上升，S期比例顯著下降(P<0.05)，呈G1/S期阻滯。結(jié)論Nrf2過表達(dá)可顯著抑制乙醇對HSC-T6 I型膠原及α-SMA mRNA及蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用，使HSC-T6細(xì)胞周期發(fā)生G1/S期阻滯，抑制乙醇誘導(dǎo)的HSC-T6增殖水平的升高，提示其對乙醇誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞活化具有負(fù)性調(diào)控作用。

肝纖維化； 肝星狀細(xì)胞； 核因子E2相關(guān)因子2； I型膠原； α-平滑肌肌動蛋白

氧化應(yīng)激致肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells, HSCs)活化是酒精性肝纖維化(alcoholic liver fibrosis，ALF)發(fā)生的中心環(huán)節(jié)[1]。過度攝入的乙醇及其代謝產(chǎn)物是引起肝臟內(nèi)氧化應(yīng)激的主要介質(zhì)，當(dāng)肝內(nèi)處于持續(xù)氧化應(yīng)激的環(huán)境時，肝星狀細(xì)胞被激活，表型向肌成纖維樣細(xì)胞(myofibroblast-like cells)轉(zhuǎn)化，分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)導(dǎo)致肝內(nèi)基質(zhì)沉積，最終引起肝纖維化乃至肝硬化[2]。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)作為調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，可增強細(xì)胞對氧化應(yīng)激和親電子化學(xué)物質(zhì)的抗性[3]。而Nrf2對乙醇誘導(dǎo)下HSCs活化水平的影響，目前國內(nèi)外尚未見報道。為此，本研究應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，以乙醇刺激HSCs增殖活化，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下瞬時轉(zhuǎn)染Nrf2重組質(zhì)粒，探討Nrf2對乙醇誘導(dǎo)下HSCs增殖水平、細(xì)胞周期分布及活化標(biāo)志蛋白α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、 I型膠原(collagen type I, ColⅠ)mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響。

材 料 和 方 法

1材料

大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6購自湘雅細(xì)胞庫，系SV40轉(zhuǎn)染SD大鼠HSCs而成，具有活化HSCs的表型[4]。pEGFP-Nrf2重組質(zhì)粒及空載質(zhì)粒pEGFP-N1合成于Invitrogen(項目編號：KL120712001)。轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自Invitrogen。培養(yǎng)基DMEM購自HyClone。胰蛋白酶和胎牛血清購自Solarbio。TRIzol RNA提取試劑盒和DMSO購自北京全式金生物技術(shù)公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa。各目的基因引物由上海生工生物工程公司合成。2×Taq PCR SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)公司?？偟鞍滋崛≡噭┖匈徸员本┢绽R基因技術(shù)有限公司。兔抗Nrf2多克隆抗體、兔抗α-SMA多克隆抗體、兔抗Col I多克隆抗體和鼠抗β-肌動蛋白單克隆抗體購自Proteintech。辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗及山羊抗鼠Ⅱ抗購自北京中杉金橋公司。FACSCalibar流式細(xì)胞儀為Beckton Dickinson產(chǎn)品。

2方法

2.1HSC-T6細(xì)胞的培養(yǎng)及傳代 HSC-T6復(fù)蘇后采用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng),置于5% CO2、37 ℃孵箱培養(yǎng)。細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)至80%～90%融合度左右進(jìn)行傳代。將濃度為1×108cells/L HSC-T6細(xì)胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL，37 ℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)24 h后隨機分為4組：(1)正常對照組；(2)乙醇刺激組；(3)乙醇刺激+pEGFP-Nrf2質(zhì)粒組；(4)乙醇刺激+ pEGFP-N1空質(zhì)粒組。(2)～(4)組中乙醇終濃度均為100 mmol/L[5]，每組設(shè)3復(fù)孔。

2.2pEGFP-Nrf2質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24 h在不含抗生素的培養(yǎng)基中接種適量細(xì)胞使轉(zhuǎn)染時細(xì)胞的匯合度達(dá)到50%左右。以LipofectamineTM2000作為轉(zhuǎn)染介質(zhì)，參考LipofectamineTM2000試劑盒說明書，混合轉(zhuǎn)染試劑及質(zhì)粒再按組加入繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h后棄培養(yǎng)基，更換新鮮無雙抗培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至48h后收集細(xì)胞。

2.3RT-PCR檢測pEGFP-Nrf2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對HSC-T6中Nrf2、α-SMA和Col I mRNA表達(dá)的影響 HSC-T6分組處理完成收集細(xì)胞后,采用TRIzol試劑進(jìn)行細(xì)胞總RNA提取，紫外分光光度計檢測濃度。逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。目的基因引物序列見表1。參照Two-Step RT-PCR試劑盒操作說明書進(jìn)行RT-PCR，總反應(yīng)體積50.0 μL，其中2× TransTaqTMHiFi PCR SuperMixⅡ 25.0 μL，ddH2O 21.0 μL，上游引物 1 μL(10.0 μmol/L)，下游引物 1 μL (10.0 μmol/L)，cDNA 2 μL。擴(kuò)增條件：Nrf2：94 ℃ 5 min；94 ℃ 35 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。α-SMA：94 ℃ 5 min；94 ℃ 35 s，63 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。Col I：94 ℃ 5 min；94 ℃ 35 s，62 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。β-actin ：94 ℃ 5 min；94 ℃ 35 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，用暗箱式紫外投射儀觀察電泳結(jié)果并照相。結(jié)果用BANDLEAD 3.00軟件計算基因相對表達(dá)值。實驗均重復(fù)3次。目的基因相對表達(dá)值以目的基因條帶/β-actin基因條帶的吸光度值進(jìn)行分析。

表1 引物序列

2.4Western blotting檢測pEGFP-Nrf2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對HSC-T6中Nrf2、α-SMA和ColⅠ蛋白表達(dá)水平的影響 HSC-T6細(xì)胞分組處理完成收集細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞總蛋白提取和測定：棄培養(yǎng)基，用無菌磷酸鹽緩沖溶液洗滌后消化收集細(xì)胞；按照蛋白抽提試劑盒說明書，分別加入蛋白裂解液及抽提試劑，4 ℃離心機離心收集蛋白，BCA法測定各組蛋白濃度后，取20～40 μg細(xì)胞總蛋白經(jīng)5×上樣緩沖液和3%SDS配平蛋白至同體積后進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以5%脫脂奶粉封閉后，分別與Nrf2Ⅰ抗(1∶1 000)、α-SMAⅠ抗(1∶800)、ColⅠⅠ抗(1∶800)和β-actinⅠ抗(1∶1 000)孵育過夜，洗滌后加入相應(yīng)Ⅱ抗，加入底物化學(xué)發(fā)光試劑后X膠片曝光，曝光顯影的目的條帶用Quantity One 4.62處理軟件進(jìn)行半定量分析，以內(nèi)參照為參考標(biāo)準(zhǔn)計算出目的條帶標(biāo)準(zhǔn)化后的吸光度值，以此判斷蛋白相對表達(dá)量。實驗均重復(fù)3次。

2.5MTT檢測細(xì)胞增殖能力 轉(zhuǎn)染前24 h用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，以1×104cells/well濃度接種于96孔板中，每組分別接種6個復(fù)孔，空白調(diào)零孔只加不含細(xì)胞的培養(yǎng)基。實驗處理后，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，加入150 μL DMSO，置搖床上避光低速振蕩15 min，酶標(biāo)儀測定492 nm處各孔的吸光度(A)，計算各組平均值。

2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布 取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度并將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，24 h待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行細(xì)胞處理。處理完成后消化收集各組細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞1次，再用700 mL/L冷乙醇4 ℃固定過夜。染色前用PBS洗去固定液，按照Cell Cycle Detection Kit 提供的方法加入RNase A 37 ℃水浴30 min，再加入碘化丙啶4 ℃避光30 min，應(yīng)用FACSCalibar流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期，得出細(xì)胞各周期的百分率。

3統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1pEGFP-Nrf2/N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)果

通過LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方式將Nrf2重組質(zhì)粒pEGFP-Nrf2和空質(zhì)粒pEGFP-N1轉(zhuǎn)染入HSC-T6細(xì)胞24 h后，熒光顯微鏡下可見pEGFP-Nrf2組和pEGFP-N1組均有綠色熒光蛋白表達(dá)，見圖1。pEGFP-Nrf2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后HSC-T6細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)水平與對照組相比均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

Figure 1. The green fluorescent protein expression of pEGFP-Nrf2 and pEGFP-N1 under fluorescence microscope(×100).

圖1熒光顯微鏡下觀察重組質(zhì)粒pEGFP-Nrf2及空質(zhì)粒pEGFP-N1綠色熒光蛋白的表達(dá)

Figure 2. Western blotting analysis of Nrf2 protein expression in HSC-T6 cells after plasmid transfection. A：control group; B: pEGFP-Nrf2 group; C: pEGFP-N1(control vector) group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2Westernblotting檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后HSC-T6細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白的表達(dá)

2各組細(xì)胞內(nèi)α-SMA和ColⅠmRNA的表達(dá)

與空白對照組相比，乙醇刺激組和pEGFP-N1空載質(zhì)粒+乙醇刺激組α-SMA和ColⅠmRNA表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)，兩組之間相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而轉(zhuǎn)染pEGFP-Nrf2質(zhì)粒+乙醇刺激組α-SMA和ColⅠmRNA表達(dá)水平較乙醇刺激組、pEGFP-N1空載質(zhì)粒+乙醇刺激組顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

3各組細(xì)胞內(nèi)α-SMA和ColⅠ蛋白的表達(dá)

與空白對照組相比，乙醇刺激組和pEGFP-N1空載質(zhì)粒+乙醇刺激組α-SMA和ColⅠ蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，兩組之間相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而轉(zhuǎn)染pEGFP-Nrf2質(zhì)粒+乙醇刺激組α-SMA和ColⅠ蛋白表達(dá)水平較乙醇刺激組和pEGFP-N1空載質(zhì)粒+乙醇刺激組顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

4各組細(xì)胞增殖水平比較

乙醇刺激組和乙醇刺激+空載質(zhì)粒組所測得A值與空白組相比顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而這兩組之間相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；乙醇刺激+pEGFP-Nrf2組所測得A值與乙醇刺激組和乙醇刺激+空載質(zhì)粒組相比顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

Figure 3. Expression levels of Nrf2,α-SMA and ColⅠ mRNA in HSC-T6 cells detected by RT-PCR. M: marker；A：control group; B: ethanol group; C: ethanol + pEGFP-Nrf2 group; D: ethanol + pEGFP-N1(control vector) group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsA;#P<0.05vsB or D.

圖3RT-PCR檢測HCS-T6細(xì)胞Nrf2、α-SMA和Col1mRNA的表達(dá)

5各組細(xì)胞周期分布情況

與空白對照組細(xì)胞相比，乙醇刺激組和乙醇刺激+空載質(zhì)粒組G1期細(xì)胞比例下降，S期細(xì)胞比例上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而這兩組之間各期細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；pEGFP-Nrf2轉(zhuǎn)染+乙醇刺激組所測得細(xì)胞G1期比例較乙醇刺激組和乙醇刺激+空載質(zhì)粒組顯著升高，而S期細(xì)胞比例顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示Nrf2過表達(dá)可使乙醇刺激下的HSC-T6細(xì)胞發(fā)生G1/S期阻滯。各組G2期細(xì)胞比例相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖5。

Figure 4. The expression of Nrf2,α-SMA and Col I proteins. A：control group; B: ethanol group; C: ethanol + pEGFP-Nrf2 group; D: ethanol + pEGFP-N1(control vector) group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsA;#P<0.05vsB or D.

圖4Nrf2、α-SMA及ColI蛋白的表達(dá)

表2各組細(xì)胞增殖水平比較

Table 2. Comparison of the cell proliferation among the four groups(Mean±SD.n=6)

GroupAvalueControl0.533±0.128Ethanol1.219±0.157*Ethanol+pEGFP-Nrf20.828±0.124#Ethanol+pEGFP-N11.241±0.143*

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsethanol group or ethanol+pEGFP-N1 group.

討 論

酒精性肝纖維化是長期過量飲酒導(dǎo)致的一種慢性肝臟疾病，最初表現(xiàn)為酒精性脂肪肝，進(jìn)而發(fā)展為酒精性肝炎、肝纖維化乃至肝硬化[6]。酒精性肝病是歐美國家人群中慢性肝病的主要原因[7]，近年來在我國發(fā)病率也呈現(xiàn)上升趨勢[8]，嚴(yán)重威脅國民健康。目前認(rèn)為，肝纖維化是酒精性肝病發(fā)病過程中的轉(zhuǎn)折點，在此階段如能及時去除導(dǎo)致肝纖維化的不利因素有可能中止肝纖維化的進(jìn)程甚至使病變向良性方面轉(zhuǎn)歸[9]。因此，對酒精性肝纖維化的發(fā)病機制及治療靶點的研究勢在必行。

過度攝入的乙醇及其代謝產(chǎn)物攻擊細(xì)胞膜產(chǎn)生大量活性氧促發(fā)脂質(zhì)過氧化酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)并導(dǎo)致過氧化產(chǎn)物大量堆積，由此引起肝臟內(nèi)持續(xù)氧化應(yīng)激狀態(tài)，可直接攻擊HSCs促其活化，也可通過誘導(dǎo)NF-κB、AP-1和MAPK等炎癥信號通路活化，導(dǎo)致肝Kupffer細(xì)胞激活并進(jìn)一步分泌大量細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長因子 β(transforming growth factor β,TGF-β)、血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF) 等進(jìn)而激活HSCs[1]。HSCs活化后表型向肌成纖維樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，細(xì)胞增殖水平升高，表達(dá)其活化標(biāo)志蛋白α-SMA,分泌大量細(xì)胞因子及以Col I為主的細(xì)胞外基質(zhì)導(dǎo)致肝內(nèi)基質(zhì)沉積，最終引起肝纖維化乃至肝硬化[10]。因此，抑制乙醇及其代謝產(chǎn)物導(dǎo)致的肝內(nèi)氧化應(yīng)激水平對于逆轉(zhuǎn)乙醇誘導(dǎo)的HSCs活化及肝纖維化進(jìn)展具有重要意義。

Nrf2屬于堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族(basic leucine-zipper,bZIP)中調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子[11]。通常情況下，Nrf2與其特異性受體Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白 1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)偶聯(lián)結(jié)合于胞漿而使Nrf2活性處于相對抑制狀態(tài)。Keap1是一個富含巰基的蛋白，在接受細(xì)胞外信號如氧化應(yīng)激等刺激后，Keap1巰基交聯(lián)并發(fā)生構(gòu)型轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致Nrf2與Keap1解偶聯(lián)因此活化并發(fā)生核轉(zhuǎn)移。Nrf2進(jìn)入核內(nèi)與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)結(jié)合，啟動Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶基因的表達(dá)，包括血紅素氧合酶1、NAD(P)H:醌氧化還原酶1、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽等，增強細(xì)胞對氧化應(yīng)激和親電子化學(xué)物質(zhì)的抗性。Nrf2 -Keap1抗氧化系統(tǒng)與疾病的關(guān)系是近幾年的研究熱點，在預(yù)防肺纖維化、糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等方面均有報道[12-14]，近年研究認(rèn)為Nrf2對各類肝臟疾病也具有重要保護(hù)作用[15]。Wu等[3]提出，Nrf2活化對乙醇誘導(dǎo)的肝內(nèi)氧化應(yīng)激及肝臟損傷具有重要保護(hù)作用，然而該研究并未在細(xì)胞水平研究Nrf2對HSCs活化的影響。此外，Oh等[16]研究發(fā)現(xiàn)，蘿卜硫素可通過活化Nrf2而抑制促纖維化信號通路TGF-β/Smad活性，提示Nrf2在抑制肝纖維化進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。然而，上述研究均未靶向HSCs研究Nrf2過表達(dá)對乙醇誘導(dǎo)下HSCs活化情況的影響。本研究通過脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染Nrf2重組質(zhì)粒上調(diào)Nrf2表達(dá)，觀察Nrf2過表達(dá)對乙醇誘導(dǎo)下HSC-T6細(xì)胞增殖水平及α-SMA、Col I表達(dá)的影響。實驗結(jié)果表明，pEGFP-Nrf2成功轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞，可有效過表達(dá)Nrf2；與空白對照組相比，乙醇刺激可顯著升高HSC-T6細(xì)胞增殖水平并促進(jìn)α-SMA、ColⅠmRNA及蛋白表達(dá)，而在乙醇刺激的基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染pEGFP-Nrf2使Nrf2過表達(dá)，可顯著抑制乙醇刺激引起的HSC-T6細(xì)胞增殖水平及α-SMA、ColⅠ表達(dá)的升高。

Figure 5. Flow cytometric analysis of cell cycle. A：control group; B: ethanol group; C: ethanol + pEGFP-Nrf2 group; D: ethanol + pEGFP-N1(control vector) group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsA;#P<0.05vsB or D.

圖5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

既往研究表明，Nrf2在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用[17-18]，然而針對HSCs研究Nrf2對乙醇刺激下HSCs細(xì)胞周期分布的影響目前尚無人研究。為探討Nrf2是否通過影響HSCs細(xì)胞周期分布進(jìn)而調(diào)控HSCs增殖活化，本實驗采用流式細(xì)胞術(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)pEGFP-Nrf2轉(zhuǎn)染+乙醇刺激組細(xì)胞G1期比例較乙醇刺激組與乙醇刺激+空載質(zhì)粒組顯著升高，而S期細(xì)胞比例顯著下降，細(xì)胞周期分布呈現(xiàn)G1/S期阻滯現(xiàn)象。推測其原因，Nrf2可能通過抑制乙醇刺激下HSCs的氧化應(yīng)激水平進(jìn)而影響細(xì)胞周期分布，也可能直接參與細(xì)胞周期蛋白的調(diào)控，因此進(jìn)一步探究Nrf2對HSCs中細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的影響也許能為Nrf2調(diào)控乙醇誘導(dǎo)的HSCs活化的研究領(lǐng)域提供新思路。

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EffectsofNrf2overexpressiononproliferation,activationandcollagentypeIsynthesisinculturedhepaticstellatecellsstimulatedbyethanol

LIU Man, HE Yue, ZHANG Ji-xiang

(DepartmentofGastroenterology,theSecondAffiliatedHospital,JiangxiProvincialKeyLaboratoryofMolecularMedicine,NanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail:jixiangz@tom.com)

AIM: To investigate the effects of nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2) overexpression on the proliferation, cell cycle distribution, collagen type I (Col I) synthesis and alpha-smooth muscle actin (α-SMA) expression in cultured hepatic stellate cell line HSC-T6 stimulated by ethanol.METHODSCultured HSC-T6 cells were transfected with pEGFP-Nrf2 or pEGFP-N1 (empty vector) plasmid by liposome transient transfection. The cells were divided into control group, ethanol group, ethanol+pEGFP-Nrf2 group and ethanol+pEGFP-N1 group. The mRNA expression of Nrf2, α-SMA and Col I was determined by RT-PCR, and their protein expression was detected by Western blotting. Cell proliferation was assessed by MTT assay, and cell cycle was detected by flow cytometry.RESULTSThe pEGFP-Nrf2 plasmid was successfully transfected into HSC-T6 cells, and the mRNA and protein expression of Nrf2 was higher than other three groups 48 h after transfection (P<0.05). Compared with control group, the cell proliferation and the mRNA and protein expression of α-SMA and Col I in ethanol group and ethanol+pEGFP-N1 group were significantly increased (P<0.05), and the numbers of HSC-T6 cells were decreased in G1phase and increased in S phase (P<0.05), without significant differences between the two groups (P>0.05). Meanwhile, the cells in ethanol+pEGFP-Nrf2 group showed significantly decreased proliferation level, down-regulated mRNA and protein expression of α-SMA and Col I, higher numbers in G1phase and lower numbers in S phase compared with ethanol group and ethanol+pEGFP-N1 group (P<0.05).CONCLUSIONNrf2 overexpression could significantly down-regulate the expression of α-SMA and Col I and cause G1/S phase arrest in HSC-T6 cells cultured with ethanol, thus inhibiting the proliferation and activation of the cells.

Liver fibrosis; Hepatic stellate cells; Nuclear factor E2-related factor 2; Collagen type I; Alpha-smooth muscle actin

R365; R575.2

A

1000- 4718(2013)09- 1590- 07

2013- 04- 01

2013- 07- 18

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.30360037)

△通訊作者 Tel: 0791-86261633; E-mail: jixiangz@tom.com

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.009