Nrf2-ARE通路在缺氧/吡那地爾后處理減輕大鼠心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷中的作用*

喻守佳, 王海英, 喻 田, 劉興奎

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，貴州 遵義 563003)

Nrf2-ARE通路在缺氧/吡那地爾后處理減輕大鼠心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷中的作用*

喻守佳, 王海英△, 喻 田, 劉興奎

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，貴州 遵義 563003)

目的探討核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)-抗氧化反應(yīng)元件(ARE)通路在缺氧后處理和吡那地爾后處理減輕大鼠心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷中的作用。方法建立成年大鼠心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型，分離、培養(yǎng)心肌細(xì)胞，隨機(jī)分為6組(n=8)：正常組(N組)、模型組(M組)、缺氧后處理組(IPO組)和不同濃度吡那地爾后處理組(P25組、P50組和P100組)。分離后的心肌細(xì)胞培養(yǎng)20 h后，除N組繼續(xù)培養(yǎng)外，其余各組均缺氧45 min，復(fù)氧60 min。IPO組缺氧45 min后復(fù)氧、缺氧循環(huán)3次，每次各5 min，在繼續(xù)復(fù)氧60 min；P25組、P50組和P100組缺氧45 min后分別以25、50和100 μmol/L吡那地爾處理5 min，復(fù)氧60 min。采用real-time PCR及Western blotting技術(shù)檢測復(fù)氧末心肌細(xì)胞中Nrf2、血紅素加氧酶1(HO-1)、NAD(P)H:醌氧化還原酶1(NQO1)和超氧化物歧化酶1(SOD1) mRNA及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與N組比較，其它各組與Nrf2、NQO1、SOD1及HO-1的mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)均降低(P<0.05)；與M組比較，其它各組mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)均顯著增高(P<0.05)；其中IPO組和P50組mRNA轉(zhuǎn)錄量顯著高于P25組和P100組(P<0.05)；P25組SOD1 mRNA顯著高于P100組(P<0.05)。IPO組和P50組Nrf2、SOD1和NQO1蛋白質(zhì)表達(dá)顯著高于P25和P100組(P<0.05)；P50組HO-1蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著高于IPO組、P25組和P100組(P<0.05)；P25組HO-1和NQO1蛋白質(zhì)表達(dá)顯著高于P100組(P<0.05)。結(jié)論缺氧后處理和吡那地爾后處理可能通過激活Nrf2-ARE通路減輕大鼠心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷。

核因子E2相關(guān)因子2； 吡那地爾； 缺氧復(fù)氧損傷； 心肌細(xì)胞； 后處理

核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)-抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)通路可通過誘導(dǎo)心肌細(xì)胞表達(dá)一系列抗氧化蛋白及Ⅱ相解毒酶，發(fā)揮心肌保護(hù)效應(yīng)[1]。研究證實(shí)，缺氧后處理和吡那地爾(pinacidil，P)后處理心肌保護(hù)作用明確[2-3]，但具體機(jī)制仍不十分清楚，Nrf2-ARE通路是否參與了缺氧后處理和吡那地爾后處理的心肌保護(hù)作用機(jī)制尚有待探討。本研究擬評價(jià)Nrf2-ARE通路在缺氧后處理和吡那地爾后處理減輕大鼠心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的作用。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物選擇和分組 健康雄性清潔級SD大鼠，體重250～300 g，4～5月齡(由第三軍醫(yī)大學(xué)試驗(yàn)動物中心提供，動物證書號為SCXK(渝)2007-0005。將分離培養(yǎng)過夜后的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為6組(n=8)：正常組(N組)、模型組(M組)、缺氧后處理組(IPO組)和不同濃度的吡那地爾后處理組(P25組、P50組和P100組)。

1.2主要試劑 吡那地爾、M199培養(yǎng)基、層黏連蛋白(laminin)、HEPES、肌酸(creatine)、?；撬?taurine)、牛血清白蛋白、EGTA、粗制Ⅱ型膠原酶等以上試劑均購自Sigma。BCA蛋白濃度測定試劑盒由江蘇碧云天生物技術(shù)研究所提供。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和real-time PCR試劑盒均購自大連TaKaRa生物工程公司。所用引物由大連TaKaRa生物工程公司根據(jù)設(shè)計(jì)合成，見表1。

1.3主要儀器 2400PCR擴(kuò)增儀(PE)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad),Odyssey紅外熒光成像系統(tǒng)(基因有限公司)和Mini Trans-Bloe電泳儀(Bio-Rad)。

2方法

2.1分離培養(yǎng)成年大鼠心肌細(xì)胞 腹腔注射異戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)和肝素(250 U·kg-1)后迅速沿劍突下打開胸腔，于主動脈根部剪下心臟，放入37 ℃ 750 μmol/L Ca2+液中。迅速將主動脈固定于Langendorff灌注管口，分別灌注氧合的750 μmol/L Ca2+液2 min、100 μmol/L無Ca2+EGTA液4 min、0.1% Ⅱ型膠原酶液15～20 min后剪開心肌，加入含有1% BSA的循環(huán)Ⅱ型膠原酶液，在氧合情況下振蕩消化5 min，37 ℃水浴中自然沉降，收集沉淀。向沉淀中加入新鮮的酶洗脫液洗滌3次，加入細(xì)胞培養(yǎng)基M199洗滌2次。將細(xì)胞數(shù)以104/cm2的密度平鋪于層黏連蛋白于6孔板中，加入M199培養(yǎng)3 h后，去除未貼壁細(xì)胞，重新加入新鮮M199培養(yǎng)過夜。

表1 引物序列

2.2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型的建立 各組心肌細(xì)胞均培養(yǎng)20 h，除N組繼續(xù)培養(yǎng)外，其余各組均缺氧45 min，復(fù)氧60 min。IPO組缺氧45 min后復(fù)氧、缺氧循環(huán)3次，每次各5 min，再繼續(xù)復(fù)氧60 min；P25組、P50組和P100組缺氧45 min后分別以25、50和100 μmol/L吡那地爾處理5 min，復(fù)氧60 min。

2.3透射電鏡下觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 各組貼壁的心肌細(xì)胞經(jīng)0.1%胰酶消化，2%戊二醛固定，修整包埋后制作超薄切片，通過透射電鏡觀察每組心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。

2.4Real-time PCR檢測心肌細(xì)胞Nrf2、血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1，HO-1)、NAD(P)H:醌氧化還原酶1[NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1，NQO1]和超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1，SOD1)mRNA表達(dá) 培養(yǎng)后的心肌細(xì)胞經(jīng)Trizol一步法提取總RNA，通過紫外分光光度計(jì)檢測總RNA的含量及純度后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為下一步PCR模版，PCR擴(kuò)增所用的寡核苷酸引物序列(表1)均由大連寶生物工程公司合成。按照real-time PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作，4倍梯度稀釋模板cDNA制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，確認(rèn)各個(gè)基因的擴(kuò)增效率，確定cDNA上樣濃度。根據(jù)反應(yīng)條件在每個(gè)循環(huán)延伸末端收集熒光信號，繪制擴(kuò)增曲線。40個(gè)循環(huán)后設(shè)置反應(yīng)步驟，對55 ℃到95 ℃升溫過程，每個(gè)0.5 ℃采集熒光信號，繪制融解曲線，采用2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量，以檢測心肌細(xì)胞中Nrf2、HO-1、NQO1和SOD1 mRNA表達(dá)水平。

2.5Westem blotting法檢測Nrf2、HO-1、NQO1和SOD1蛋白的表達(dá) 于培養(yǎng)后向各組心肌細(xì)胞中加入RIPA裂解液3～5 s， 4 ℃、14 000×g冷凍離心5 min。上清液經(jīng)碧云天公司的BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒定量后分裝成40 μg/10 μL，-20 ℃凍存。按照Bio-Rad公司的SDS-PAGE電泳使用說明行蛋白質(zhì)電泳，電泳結(jié)束后按照Nrf2、NQO1、SOD1及HO-1的分子量切取凝膠，并進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和封膜。每個(gè)目標(biāo)蛋白分別封閉I抗，PBS洗膜后再封閉熒光II抗，Odyssey紅外熒光成像系統(tǒng)掃描PVDF膜，記錄各組蛋白條帶相應(yīng)的熒光強(qiáng)度值。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1缺氧/吡那地爾后處理對細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)N組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)形態(tài)基本正常；M組破壞程度最嚴(yán)重，電鏡下心肌細(xì)胞線粒體腫脹、空泡，嵴斷裂成絮狀，部分線粒體已溶解破裂，核膜溶解消失，細(xì)胞核溶解形狀不規(guī)則；而P25組和P100組破壞程度較M組輕，電鏡下可見部分線粒體腫脹，嵴模糊或斷裂成絮狀，核膜基本較完整，細(xì)胞核皺縮；IPO組和P50組超微結(jié)構(gòu)線粒體輕度腫脹，嵴平行或少數(shù)斷裂，核膜較完整，細(xì)胞核輕度皺縮，完整性明顯優(yōu)于M組、P25組和P100組，見圖1。

Figure 1. Changes of the myocardial cell ultrastructure observed under transmission electron microscope (×20 000).

圖1透射電鏡觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

2缺氧/吡那地爾后處理對細(xì)胞Nrf2、NQO1、SOD1及HO-1mRNA表達(dá)的影響

與N組比較，其它各組與Nrf2、NQO1、SOD1及HO-1 mRNA表達(dá)均明顯降低(P<0.05)；與M組比較，其它各組mRNA表達(dá)均顯著增高(P<0.05)；IPO組和P50組mRNA轉(zhuǎn)錄量顯著高于P25和P100組(P<0.05)；P25組SOD1 mRNA顯著高于P100組(P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠心肌細(xì)胞Nrf2、SOD1、HO-1及NQO1 mRNA表達(dá)量的變化

▼P<0.05vsgroup N；■P<0.05vsgroup M；★P<0.05vsgroup IPO；●P<0.05vsgroup P25；▲P<0.05vsgroup P50.

3缺氧/吡那地爾后處理對細(xì)胞Nrf2、NQO1、SOD1及HO-1蛋白表達(dá)的影響

與N組比較，其它各組與Nrf2、NQO1、SOD1及HO-1蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)；與M組比較，其它各組蛋白表達(dá)均顯著增高(P<0.05)；P50組HO-1蛋白表達(dá)量顯著高于IPO組、P25組和P100組(P<0.05)；P25組HO-1和NQO1蛋白表達(dá)顯著高于P100組(P<0.05)，見圖2、表3。

Figure 2. Expression of Nrf2,SOD1,HO-1 and NQO1 proteins in myocardial cells in each group detected by Western blotting.

圖2各組心肌細(xì)胞Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1及GAPDH蛋白表達(dá)的免疫印跡圖

表3 各組大鼠心肌細(xì)胞Nrf2、SOD1、HO-1及NQO1蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化

▼P<0.05vsgroup N；■P<0.05vsgroup M；★P<0.05vsgroup IPO；●P<0.05vsgroup P25；▲P<0.05vsgroup P50.

討 論

本研究表明，缺氧后處理和不同濃度吡那地爾后處理均能減輕心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的破壞程度，從而起到保護(hù)缺氧心肌細(xì)胞的作用。結(jié)合既往的研究及本研究的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究選擇25、50和100 μmol/L吡那地爾。Nrf2及其下游NQO1、SOD1和HO-1表達(dá)上調(diào)是Nrf2-ARE通路被激活的標(biāo)志[4]，本研究檢測到缺氧后處理和吡那地爾后處理均導(dǎo)致了這些基因表達(dá)上調(diào)。證實(shí)缺氧后處理和吡那地爾后處理可能通過激活Nrf2-ARE通路減輕心肌缺氧復(fù)氧損傷。

本研究觀察到50 μmol/L吡那地爾處理組Nrf2、NQO1、HO-1和SOD1表達(dá)水平高于25 μmol/L組和100 μmol/L組，且最大限度地降低了細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的損傷，說明50 μmol/L吡那地爾處理組抗心肌氧化應(yīng)激強(qiáng)于25 μmol/L和100 μmol/L組，最大限度地保護(hù)了心肌細(xì)胞。其機(jī)制可能是50 μmol/L吡那地爾后處理激活Nrf2-ARE通路及其Ⅱ相解毒酶下游基因表達(dá)上調(diào)的作用最強(qiáng)。

研究發(fā)現(xiàn)，藥物預(yù)處理能激活Nrf2-ARE通路，其Ⅱ相解毒酶下游基因表達(dá)上調(diào)，從而起到抗氧化應(yīng)激作用，發(fā)揮心肌保護(hù)效應(yīng)，且線粒體ATP敏感性鉀通道(mitochondrial ATP sensitive potassium channel，mitoKATPC)開放可能參與激活了Nrf2-ARE通路[5]。因此，本研究推測缺氧后處理及吡那地爾后處理，心肌細(xì)胞mitoKATPC開放，誘使Nrf2-ARE通路活化，以對抗缺氧再灌注期所致的氧化損傷。減少鈣超載，保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)形態(tài)，發(fā)揮心肌保護(hù)效應(yīng)。

綜上所述，缺氧后處理和吡那地爾后處理可通過激活Nrf2-ARE通路減輕心肌缺氧復(fù)氧損傷，吡那地爾后處理可替代缺氧后處理產(chǎn)生心肌保護(hù)作用。

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RoleofNrf2-AREsignalingpathwayinprotectiveeffectofhypoxiaorpinacidilpostconditioningagainsthypoxia-reoxygenationinjuryinadultratcardiomyocytes

YU Shou-jia, WANG Hai-ying, YU Tian, LIU Xing-kui

(DepartmentofAnesthesiology,AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,China.E-mail:wanghaiting-8901@163.com)

AIM: To investigate whether nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2)-antioxidant response element (ARE) signaling pathway is involved in the protective effect of hypoxia or pinacidil postconditioning against hypoxia-reoxygenation injury in adult rat cardiomyocytes.METHODSCardiomyocytes were isolated from the left ventricle of male adult Sprague-Dawley rats (250～300 g) by Langendorff perfusion and collagenase II digestion. The cells were randomly divided into six groups (n=8 in each group). The cells in N group were cultured for 22 h without any treatment. The cells in the other five groups were cultured for 20 h and then underwent 45 min of hypoxia followed by 60 min of reoxygenation (M group), three 5-min cycles of reoxygenation/hypoxia plus 60 min of reoxygenation (IPO group), or treatment with pinacidil (25, 50 and 100 μmol/L) for 5 min plus 60 min of reoxygenation (P25, P50and P100groups, respectively). The expression of Nrf2, NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 (NQO1), heme oxygenase 1 (HO-1) and superoxide dismutase 1 (SOD1) at mRNA and protein levels was detected by real-time PCR and Western blotting, respectively.RESULTSThe mRNA and protein levels of Nrf2, HO-1, NQO1 and SOD1 in M, IPO, P25, P50and P100groups were significantly decreased compared with N group (P<0.05), and those in IPO, P25, P50and P100groups were obviously higher than those in M group (P<0.05). The mRNA levels of Nrf2, HO-1, NQO1 and SOD1 in IPO and P50groups were obviously higher than those in P25and P100groups (P<0.05). The mRNA expression of SOD1 in P25group was obviously higher than that in P100group (P<0.05). The protein levels of Nrf2, NQO1 and SOD1 in IPO and P50groups were obviously higher than those in P25and P100groups (P<0.05). The protein expression of HO-1 in P50group was obviously higher than that in IPO, P25and P100groups (P<0.05). The protein levels of HO-1 and NQO1 in P25group were obviously higher than those in P100group (P<0.05).CONCLUSIONHypoxia or pinacidil postconditioning may attenuate hypoxia-reoxygenation injury in adult rat cardiomyocytes via activation of Nrf2-ARE signaling pathway.

Nuclear factor E2-related factor 2; Pinacidil; Hypoxia-reoxygenation injury; Cardiomyocytes; Postconditioning

R363

A

1000- 4718(2013)09- 1696- 05

2013- 03- 02

2013- 07- 17

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30960366)

△通訊作者Tel：0852-8609838；E-mail:wanghaiting-8901@163.com

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.028