一個(gè)新的水稻幼苗黃葉突變體的遺傳分析及其基因的初步定位

葛紹興，馬曉靜，林冬枝，董彥君

(上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234)

0 引言

綠色植物的光合作用被稱為地球上最重要的化學(xué)反應(yīng)．據(jù)統(tǒng)計(jì)，水稻植株中90% ～95%的碳水物質(zhì)來自葉片光合作用的產(chǎn)物，植物光合作用對(duì)光能的利用是從光合色素對(duì)光能的捕獲開始的．一般來說，正常的水稻綠色葉片中葉綠素a和葉綠素b的比例約為3∶1［1］，而當(dāng)葉綠素含量比例失調(diào)時(shí)，水稻葉片就表現(xiàn)出不正常的葉色，從而影響其光合作用．

水稻葉色突變體研究日漸成為水稻功能基因組學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容之一．目前，除了天然自發(fā)突變外，還可以通過適當(dāng)?shù)暮溯椛湔T變［2－3］、化學(xué)誘變劑處理［4－5］、T － DNA 插入突變［6］、轉(zhuǎn)座子(Ac/Ds系統(tǒng))插入突變［7］以及逆轉(zhuǎn)座子(逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Tosl7)插入突變［8］等方法獲得水稻葉色突變體．水稻葉色突變體的主要特點(diǎn)是突變體苗期葉色表型發(fā)生變異，表現(xiàn)為白化、黃化、淺綠、綠白、白翠、黃綠、綠黃、和條紋等不同類型［9］，并可致使控制葉綠素生物合成和葉綠體發(fā)育的關(guān)鍵基因沉默或失活，直接或間接影響葉綠素的合成和降解，改變?nèi)~綠素含量［10－15］．大量研究結(jié)果顯示，水稻葉色突變體不僅可以應(yīng)用于作物育種、植物光合作用、遺傳轉(zhuǎn)化、基因調(diào)控等基礎(chǔ)研究中，而且其還是研究葉綠素生物合成途徑、葉綠體的結(jié)構(gòu)功能和遺傳發(fā)育調(diào)控機(jī)制的理想材料［16－17］．因此，發(fā)掘和鑒定新的控制植物葉色突變的基因，并開展新的突變基因的定位、克隆及其作用機(jī)理等方面的研究，不僅具有重要的理論意義，更具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值．

關(guān)于水稻葉色突變性狀的遺傳，國(guó)內(nèi)外的學(xué)者進(jìn)行了大量的相關(guān)研究，除了李賢勇等［18］報(bào)道的由1對(duì)顯性單基因控制的深綠色水稻突變體和錢前等［19］在秀水11/春江03F4株系中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞質(zhì)遺傳的白綠苗突變體之外，多數(shù)水稻葉色突變體都是受一對(duì)隱性核基因控制的．目前，除了第12號(hào)染色體，已經(jīng)報(bào)道了近80個(gè)水稻葉色突變基因［20－21］．本研究不僅對(duì)水稻幼苗黃葉突變體syl11的不同時(shí)期葉色表型、形態(tài)特征等進(jìn)行了觀察和分析，還對(duì)其突變基因進(jìn)行了遺傳分析，并利用SSR及InDel分子標(biāo)記對(duì)該突變基因進(jìn)行了初步定位，以期為該基因的分子克隆及其作用機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1．1 材 料

水稻幼苗黃葉突變體syl11是從日本晴經(jīng)60Coγ射線誘變處理的M2代群體后代中篩選獲得的．突變體syl11經(jīng)多次自交繁殖和選擇，其突變性狀和各種農(nóng)藝性狀均已穩(wěn)定．

1．2 方 法

1．2．1 突變體的表型觀察

為了進(jìn)一步確定突變體syl11幼苗葉色黃化的突變性狀，將突變體s yl11及其野生型日本晴的種子在32℃條件下催芽4 d后，播種在裝有水稻土的塑料盆內(nèi)，放置在32℃的光照培養(yǎng)箱(GXZ智能型，寧波，江南儀器廠)內(nèi)，每天光照12 h(光照強(qiáng)度為180μmol·m－2·s－1)進(jìn)行培養(yǎng)，觀察突變體syl11及其野生型日本晴苗期葉色變化，并對(duì)其進(jìn)行拍照．

1．2．2 葉片光合色素含量的測(cè)定

待幼苗黃葉突變體syl11與野生型日本晴長(zhǎng)至二、三、四葉期時(shí)，參照沈偉其［22］描述的水稻葉片葉綠素浸提法，分別提取syl11第二葉、第三葉以及四葉期的第3葉的光合色素，然后使用BECKMANCOULTER－DU720分光光度計(jì)分別測(cè)定470，645，663 nm 3個(gè)波長(zhǎng)下的吸光值，分別計(jì)算葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次．

1．2．3 遺傳分析以及定位群體的構(gòu)建

2010年夏，在上海以突變體syl11和培矮64S雜交配組獲得的F1代種子，同年冬季在海南省陵水縣浙江省農(nóng)科院南繁基地實(shí)驗(yàn)田加代種植，獲得F2代種子．取適量F2代種子在32℃條件下，催芽5 d之后，播種在帶有少量濕潤(rùn)水稻土的托盤內(nèi)，并用保鮮膜密封．然后將其放置于32℃光照培養(yǎng)箱(GXZ智能型，寧波江南儀器廠)內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，并保持光照強(qiáng)度為180μmol·m－2·s－1，每天光照12 h．待約一周之后，開始觀察幼苗葉色表型分離情況，并進(jìn)行遺傳分析．與此同時(shí)，將從突變體培矮64S/syl11F2群體中挑出的具有突變表型的幼苗，仍然放置在原光照培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)生長(zhǎng)，待長(zhǎng)至四葉期后，進(jìn)行DNA的提取及基因定位．

1．2．4 水稻DNA的提取

采用改良后的CTAB法［23］，提取親本以及F2代遺傳群體基因組DNA．

1．2．5 突變體syl11的基因定位

本研究首先選取82對(duì)GRAMENE網(wǎng)站(http://www．gramene．org/)上公布的以及本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)保存的SSR及InDel的分子標(biāo)記檢測(cè)突變體syl11和培矮64S的多態(tài)性，然后選取均勻分布在水稻12條染色體上的有多態(tài)性的引物，對(duì)22株突變表型F2遺傳群體進(jìn)行連鎖分析，初步確定突變基因在染色體上的位置．接著進(jìn)一步擴(kuò)大F2群體進(jìn)行遺傳定位，并在目標(biāo)區(qū)域內(nèi)根據(jù)NCBI網(wǎng)站(http://www．ncbi．nlm．nih．gov/)上公布的日本晴和9311的全基因組序列差異尋找InDel位點(diǎn)，然后在此基礎(chǔ)上使用Primer Premier 5．0軟件設(shè)計(jì)引物．引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成．25μL的PCR反應(yīng)體系包括:100 mmol/L Tris － HCl(pH 9．0)、100 mmol/L KCl、20 mmol/L MgSO4、80 mmol/L(NH4)2SO4、2．5 mmol/L dNTP、10μmol/L引物、5 U/mL Taq酶和20 ng模板DNA．在Eppendorf和東勝PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s(退火溫度隨不同引物變化)，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min．反應(yīng)產(chǎn)物用2．5% ～3．5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，經(jīng)溴化乙錠染色后在UVP凝膠成像儀上成像，而對(duì)于多態(tài)性不明顯的引物的PCR產(chǎn)物，用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，銀染之后用冷光源膠片觀察燈觀察，并拍照記錄．

1．2．6 連鎖分析

本研究將F2遺傳群體中與syl11突變體DNA帶型一致的單株記作A，與培矮64S帶型一致的單株記作B，而與F1帶型一致的單株記作H，缺失的單株記作－，應(yīng)用MAPMAKER/EXP3．0［24］作圖軟件，構(gòu)建目的基因區(qū)域的分子標(biāo)記連鎖遺傳圖譜．

2 結(jié)果與分析

2．1 突變體syl11的表型及光合色素含量分析

試驗(yàn)表明(圖1)，突變體syl11第二，三葉未展開之前均呈黃色，隨著生長(zhǎng)的展開，自其頂端開始轉(zhuǎn)綠，完全展開時(shí)，葉片呈正常綠色;至第四葉時(shí)完全轉(zhuǎn)綠，和野生型日本晴的表型一致．同時(shí)，與野生型日本晴相比較，突變體syl11第二葉葉綠素a、b和類胡蘿卜素含量分別下降了82．93%、75%和41．67%，第三葉分別下降了82．3%、67．65% 和 73．68%，并且葉綠素 a/b也明顯小于野生型日本晴;而轉(zhuǎn)綠后的四葉期幼苗第三葉的光合色素含量均接近日本晴．以上結(jié)果表明，突變體syl11的黃葉突變性狀只在幼葉三期之前表達(dá)，引起其光合色素含量下降引．

圖1 野生型日本晴(左)和突變體syl11(右)的幼苗葉色表型

表1 幼苗突變體syl11與野生型日本晴光合色素的含量分析

2．2 突變體syl11的遺傳分析

突變體syl11與秈稻培矮64S的正反交雜交后代中，所有的F1代幼苗單株個(gè)體均表現(xiàn)正常的綠色表型．與此同時(shí)，通過隨機(jī)調(diào)查突變體syl11與秈稻培矮64S雜交產(chǎn)生的F2遺傳群體中的754株幼苗，發(fā)現(xiàn)野生型正常植株為582株，突變型植株為172株，其分離比例符合3∶1(χ2=1．81＜ χ20．05=3．84)．表明該突變性狀是由一對(duì)隱性核基因控制的，命名為syl11．

2．3 突變體syl11的基因定位

利用篩選出的28對(duì)在syl11和培矮64S之間表現(xiàn)出多態(tài)性的引物，對(duì)F2遺傳群體隨機(jī)分離出的22株突變體表型單株進(jìn)行連鎖分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該突變基因syl11與水稻第11號(hào)染色體長(zhǎng)臂上的分子標(biāo)記ID20872和RM287(圖2)連鎖，從而確定syl11基因在水稻第11號(hào)染色體上．然后根據(jù)NCBI網(wǎng)站公布的粳稻日本晴的序列和秈稻9311的序列，設(shè)計(jì)27對(duì)SSR和InDel標(biāo)記引物，但經(jīng)檢測(cè)只有5對(duì)引物在兩親本間表現(xiàn)出明顯多態(tài)性(表2)．并利用這5對(duì)分子標(biāo)記對(duì)230株突變表型單株進(jìn)行DNA帶型分析，將syl11基因定位在水稻第11號(hào)染色體的MM1431和MM1193之間，其遺傳距離分別為3．1 cM和2．9 cM．然后進(jìn)一步把定位群體擴(kuò)大至958株，從而最終把目的基因syl11定位在長(zhǎng)臂上的RM26652和處于著絲粒附近的ID11974分子標(biāo)記之間，其遺傳距離分別為0．5 cM和0．7 cM(圖3)．

圖2 分子標(biāo)記RM287在親本其及部分具有突變表型F2代單株的DNA分離帶型

表2 本研究新發(fā)展的有多態(tài)的分子標(biāo)記

圖3 幼苗黃葉突變基因syl11在水稻第11號(hào)染色體上的遺傳位置

3 討論

葉色突變體是比較常見的一類水稻突變體，其表型豐富，有如葉片上只有白化、黃化(包括黃綠和淡綠)、紫葉和暗綠葉等1種顏色的單色突變，也有如葉片為條斑葉、斑馬葉、斑點(diǎn)葉等含有2種或2種以上顏色的雜色突變．這些豐富的突變體為揭示水稻葉色變化的分子機(jī)制提供了有用材料．

伴隨水稻全基因組測(cè)序的完成，到目前為止，在水稻第1～11號(hào)染色體上均有水稻葉色突變基因的報(bào)道，其中6個(gè)相關(guān)基因被克?。?0－21］．與本研究突變體syl11位于同一條的第11號(hào)染色體的水稻葉色突變體共有9 個(gè)，其中包括2 個(gè)為“斑馬葉”z1、z2［25］的雜色突變，5 個(gè)為白化突變體 sgra［26］、tsc－11［27］、gwgl［28］、v4［29］、v9［30］以及 2 個(gè)為黃葉突變體 xnt［31］、yl11［32］的單色突變．從表型來看，突變體 z1、z2 以及sgra、tsc－11、gwgl、v4、v9顯然不同于本研究中的突變體;突變體xnt和yl11其在整個(gè)生育期呈黃化，而本研究中的突變體syl11僅限在第二葉和第三葉呈現(xiàn)黃色表型．此外，突變體xnt、突變體yl11分別定位在第11號(hào)染色體的短臂的RM7283和ID9201之間［30］以及長(zhǎng)臂的MM2199和ID21039之間［31］，均與本研究的定位區(qū)間相差甚遠(yuǎn)．所以，無論從表型上還是從定位區(qū)間上分析，本研究中的突變體syl11都是一個(gè)新的突變體．另外，還發(fā)現(xiàn)突變體syl11第二、三黃葉的光合色素含量下降，四葉期后，其光合色素含量得到了恢復(fù)．由此推斷，syl11基因不僅與光合色素的合成相關(guān)，而且其表達(dá)與幼苗的葉齡有關(guān)，僅限在苗期早期表達(dá)．今后，將在此基礎(chǔ)上擴(kuò)大定位群體，發(fā)展更多新的分子標(biāo)記，進(jìn)一步對(duì)該基因進(jìn)行克隆和功能分析，將有助于加深對(duì)水稻早期葉綠素分子作用機(jī)理的了解．

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