異基因臍血干細(xì)胞穴位移植對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠細(xì)胞因子白介素-1β、腫瘤壞死因子-α、白介素-4、白介素-10影響的實(shí)驗(yàn)研究

姜兆榮 高明利▲ 于 靜 叢珊珊

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕病科，遼寧沈陽(yáng) 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧沈陽(yáng) 110032

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關(guān)節(jié)滑膜及周圍結(jié)締組織異常增生、關(guān)節(jié)進(jìn)行性破壞為特征的慢性自身免疫性疾病[1]。傳統(tǒng)的治療藥物，如免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素、生物制劑等，雖能使部分患者的病情活動(dòng)得以控制，但長(zhǎng)期應(yīng)用副作用較大[2]。間充質(zhì)干細(xì)胞因具有免疫調(diào)節(jié)作用[3]，為RA治療帶來(lái)新的希望。本研究嘗試采用hUCBSCs穴位移植方法治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型（CIA），觀察對(duì)白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-4（IL-4）、白介素-10（IL-10）的影響，探討 hUCBSCs穴位移植治療RA的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

牛Ⅱ型膠原（C7809，5 mg，Sigma公司）；弗氏完全佐劑（098K8729-CAS9007-81-2，10 mL，Sigma公司）；流式細(xì)胞儀抗體PE-CD34。甲氨喋呤（MTX），上海醫(yī)藥集團(tuán)有限公司信通制藥廠，產(chǎn)品批號(hào)002091。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

近交系雌性Wistar大鼠120只，動(dòng)物年齡45～50 d，體重（180±20）g，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.3 臍血

選擇遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）婦產(chǎn)科排除了 HIV、HBV、HCV、CMV、EBV、梅毒等急、慢性感染，無(wú)血液系統(tǒng)疾患及其他系統(tǒng)疾病的非高危妊娠健康足月產(chǎn)婦，新生兒為經(jīng)陰道順產(chǎn)且生后皮膚紅潤(rùn)，四肢活動(dòng)良好，無(wú)感染征象的臍血。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)通過(guò)，所有產(chǎn)婦及家屬知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 臍血干細(xì)胞分離

將采集到的新鮮臍血用HES沉淀法分離臍血單個(gè)核細(xì)胞，制成MNC懸液，用臺(tái)盼藍(lán)拒染色試驗(yàn)測(cè)細(xì)胞存活率，若細(xì)胞存活率＞95%，則進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。用MiniMACS磁性吸附性分離裝置，進(jìn)行CD34+細(xì)胞的分離與純化，用臺(tái)盼藍(lán)拒染色試驗(yàn)測(cè)細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞儀測(cè)定CD34+細(xì)胞百分比[4]。將處理完畢的采集物低溫凍存以備回輸。

1.2.2 分組、造模與給藥

1.2.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 將近交系Wistar大鼠120只隨機(jī)分為六組：正常對(duì)照組（A 組）、模型組（B組）、hUCBSCs腕關(guān)節(jié)注射治療組（C組）、hUCBSCs尾靜脈注射治療組（D組）、hUCBSCs外關(guān)穴注射治療組（E組）、MTX灌胃治療組（F組），每組20只。

1.2.2.2 建立CIA動(dòng)物模型 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒捎绵嚢裁贩╗5]。除A組外，寒冷刺激10 d后，將10 mg牛Ⅱ型膠原（BⅡC）與5 mL完全氟氏佐劑研磨后，以每只100 μL于大鼠背部、踝部、尾根部皮內(nèi)注射免疫，免疫注射20 d后，于第21天按上述方法20 μL再次腹腔內(nèi)注射，作為激發(fā)注射免疫。A組在寒冷刺激10 d后，按上述方法及相同部位注射等量的注射用水。

1.2.2.3 hUCBSCs輸注途徑及劑量 CIA大鼠免疫接種后第31天（除A組及B組用蒸餾水），開始hUCBSCs移植治療。C、D、E組分別向腕關(guān)節(jié)腔、尾靜脈、外關(guān)穴注射0.5 mL 0.9%氯化鈉溶液和0.5 mL hUCBSCs懸液（含干細(xì)胞2×107/mL），F(xiàn)組MTX灌胃治療（MTX研成細(xì)末，加生理鹽水配成懸濁液灌胃0.0175 g/kg），每周1次。

1.2.2.4 指標(biāo)檢測(cè) 在hUCBSCs輸注4周后ELISA法測(cè)定CIA 大鼠外周血細(xì)胞因子 IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)或方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A、B兩組大鼠血清中各指標(biāo)比較

由于實(shí)驗(yàn)操作等原因，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有3只死亡，其中B組死亡2只，F(xiàn)組死亡1只。B組大鼠血清細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α明顯高于A組，而IL-4、IL-10明顯低于A組（P ＜ 0.05）。 見表1。

表1 A、B 兩組大鼠血清中各指標(biāo)比較（μg/L，±s）

表1 A、B 兩組大鼠血清中各指標(biāo)比較（μg/L，±s）

注：與 A 組比較，△P ＜ 0.05；IL-1β：白介素-1β；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-4：白介素-4；IL-10：白介素-10

組別 只數(shù) IL-1βTNF-αIL-4 IL-10 A組B組20 18 0.362±0.027 0.658±0.034△1.864±0.132 2.953±0.186△7.862±0.531 5.876±0.512△50.342±6.100 42.415±3.014△

2.2 B組與各治療組各項(xiàng)指標(biāo)的比較

與B組比較，各個(gè)治療組IL-1β、TNF-α明顯降低，IL-4、IL-10明顯升高（P＜ 0.05）。 與 F組比較，C、D組 IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10無(wú)明顯變化（P ＞ 0.05）。 與F 組比較，E組IL-1β、TNF-α 明顯降低，IL-4、IL-10明顯升高（P ＜ 0.05）。見表2。

表2 B組與各治療組各項(xiàng)指標(biāo)的比較（μg/L，±s）

表2 B組與各治療組各項(xiàng)指標(biāo)的比較（μg/L，±s）

注：與 B 組比較，*P ＜ 0.05；與 F組比較，#P ＜ 0.05；IL-1β：白介素-1β；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-4：白介素-4；IL-10：白介素-10

組別 只數(shù) IL-1βTNF-αIL-4 IL-10 B組C組D組E組F組18 20 20 20 19 0.658±0.034 0.548±0.027*0.564±0.032*0.404±0.016*0.513±0.035*2.953±0.186 2.715±0.155*2.689±0.151*1.987±0.113*#2.704±0.149*5.876±0.512 6.763±0.512 6.773±0.526*7.584±0.548*#6.803±0.513*42.415±3.014 45.887±3.946*46.076±4.601*49.973±4.017*#46.143±3.478*

3 討論

造血干細(xì)胞移植是通過(guò)異體或自體的造血干細(xì)胞植入受者體內(nèi)，使受者獲得造血和免疫功能重建的方法[6]。大量實(shí)驗(yàn)及臨床資料已經(jīng)證明臍帶血是極有潛力的造血干細(xì)胞來(lái)源[7-9]。臍帶血干細(xì)胞具有多向分化能力、免疫調(diào)節(jié)性能以及組織修復(fù)能力和低風(fēng)險(xiǎn)特性，并且其療效肯定，不需要組織配型，移植后沒(méi)有排斥反應(yīng)。王秦等[10]在臨床上已經(jīng)成功地應(yīng)用異基因臍帶干細(xì)胞靜脈輸注的移植方法治療3例難治性RA，移植后能顯著改善病情，減少免疫抑制劑的用量。

穴位注射是在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，通過(guò)針刺與藥物注射相結(jié)合的一種注射方法[11-12]。針刺腧穴達(dá)到疏通經(jīng)氣、調(diào)節(jié)臟腑氣血功能，同時(shí)又與藥物相結(jié)合發(fā)揮藥物治療作用，從而達(dá)到腧穴、針刺、藥物三者相結(jié)合的治療效果。藥物注入穴位后激發(fā)了腧穴的良性調(diào)整作用，具有吸收快和放大藥物治療作用的效應(yīng)。這樣就可以減少藥物的用量，提高療效。外關(guān)穴為手少陽(yáng)三焦經(jīng)之絡(luò)穴，是八脈交會(huì)穴，通陽(yáng)維脈[13]。外關(guān)穴注射異基因hUCBSCs治療RA，一方面具有針刺效應(yīng)，調(diào)節(jié)陰陽(yáng)，刺激神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)紊亂的免疫功能，另一方面發(fā)揮異基因hUCBSCs的作用，調(diào)節(jié)RA患者機(jī)體免疫紊亂，阻止病情進(jìn)展。

本實(shí)驗(yàn)研究hUCBSCs穴位移植治療CIA大鼠，在實(shí)驗(yàn)中采用外關(guān)穴注射、腕關(guān)節(jié)腔注射及尾靜脈注射三種方法，結(jié)果顯示，三種治療方法對(duì)RA大鼠均有明顯的治療作用，外關(guān)穴位移植對(duì)RA大鼠細(xì)胞因子的影響更大，作用明顯優(yōu)于MTX。這可能與穴位的作用不可分離[14-15]。異基因臍血干細(xì)胞外關(guān)穴位移植治療的特點(diǎn)就是調(diào)整機(jī)體的免疫功能，表現(xiàn)在能恢復(fù)和促進(jìn)IL-4、IL-10含量使Th2升高，降低TNF-α、IL-1β的量使Th1降低，使失衡的Th1/Th2趨向平衡，可能是通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞遷移、抑制內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)、抑制滑膜細(xì)胞過(guò)度分泌細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)[16-17]，從而減輕了臨床癥狀，延緩了病理進(jìn)展，防止了關(guān)節(jié)畸變和功能破壞。

綜上所述，本項(xiàng)目是將傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的穴位療法與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的干細(xì)胞移植技術(shù)相結(jié)合，以期開辟一條新的移植途徑，可以使干細(xì)胞更為簡(jiǎn)單、無(wú)創(chuàng)、準(zhǔn)確地運(yùn)送到目的地，探求對(duì)RA新的治療方法，并通過(guò)此進(jìn)一步分析RA的發(fā)病機(jī)制。

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