姜兆榮 高明利▲ 于 靜 叢珊珊
1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕病科,遼寧沈陽 110032;2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué),遼寧沈陽 110032
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜及周圍結(jié)締組織異常增生、關(guān)節(jié)進(jìn)行性破壞為特征的慢性自身免疫性疾病[1]。傳統(tǒng)的治療藥物,如免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素、生物制劑等,雖能使部分患者的病情活動(dòng)得以控制,但長期應(yīng)用副作用較大[2]。間充質(zhì)干細(xì)胞因具有免疫調(diào)節(jié)作用[3],為RA治療帶來新的希望。本研究嘗試采用hUCBSCs穴位移植方法治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型(CIA),觀察對(duì)白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)的影響,探討 hUCBSCs穴位移植治療RA的作用機(jī)制。
1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
牛Ⅱ型膠原(C7809,5 mg,Sigma公司);弗氏完全佐劑(098K8729-CAS9007-81-2,10 mL,Sigma公司);流式細(xì)胞儀抗體PE-CD34。甲氨喋呤(MTX),上海醫(yī)藥集團(tuán)有限公司信通制藥廠,產(chǎn)品批號(hào)002091。
1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
近交系雌性Wistar大鼠120只,動(dòng)物年齡45~50 d,體重(180±20)g,由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
1.1.3 臍血
選擇遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(以下簡稱“我院”)婦產(chǎn)科排除了 HIV、HBV、HCV、CMV、EBV、梅毒等急、慢性感染,無血液系統(tǒng)疾患及其他系統(tǒng)疾病的非高危妊娠健康足月產(chǎn)婦,新生兒為經(jīng)陰道順產(chǎn)且生后皮膚紅潤,四肢活動(dòng)良好,無感染征象的臍血。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)通過,所有產(chǎn)婦及家屬知情同意,并簽署知情同意書。
1.2.1 臍血干細(xì)胞分離
將采集到的新鮮臍血用HES沉淀法分離臍血單個(gè)核細(xì)胞,制成MNC懸液,用臺(tái)盼藍(lán)拒染色試驗(yàn)測細(xì)胞存活率,若細(xì)胞存活率>95%,則進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。用MiniMACS磁性吸附性分離裝置,進(jìn)行CD34+細(xì)胞的分離與純化,用臺(tái)盼藍(lán)拒染色試驗(yàn)測細(xì)胞存活率,流式細(xì)胞儀測定CD34+細(xì)胞百分比[4]。將處理完畢的采集物低溫凍存以備回輸。
1.2.2 分組、造模與給藥
1.2.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 將近交系Wistar大鼠120只隨機(jī)分為六組:正常對(duì)照組(A 組)、模型組(B組)、hUCBSCs腕關(guān)節(jié)注射治療組(C組)、hUCBSCs尾靜脈注射治療組(D組)、hUCBSCs外關(guān)穴注射治療組(E組)、MTX灌胃治療組(F組),每組20只。
1.2.2.2 建立CIA動(dòng)物模型 實(shí)驗(yàn)?zāi)P筒捎绵嚢裁贩╗5]。除A組外,寒冷刺激10 d后,將10 mg牛Ⅱ型膠原(BⅡC)與5 mL完全氟氏佐劑研磨后,以每只100 μL于大鼠背部、踝部、尾根部皮內(nèi)注射免疫,免疫注射20 d后,于第21天按上述方法20 μL再次腹腔內(nèi)注射,作為激發(fā)注射免疫。A組在寒冷刺激10 d后,按上述方法及相同部位注射等量的注射用水。
1.2.2.3 hUCBSCs輸注途徑及劑量 CIA大鼠免疫接種后第31天(除A組及B組用蒸餾水),開始hUCBSCs移植治療。C、D、E組分別向腕關(guān)節(jié)腔、尾靜脈、外關(guān)穴注射0.5 mL 0.9%氯化鈉溶液和0.5 mL hUCBSCs懸液(含干細(xì)胞2×107/mL),F(xiàn)組MTX灌胃治療(MTX研成細(xì)末,加生理鹽水配成懸濁液灌胃0.0175 g/kg),每周1次。
1.2.2.4 指標(biāo)檢測 在hUCBSCs輸注4周后ELISA法測定CIA 大鼠外周血細(xì)胞因子 IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10的含量。
采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗(yàn)或方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
由于實(shí)驗(yàn)操作等原因,在實(shí)驗(yàn)過程中有3只死亡,其中B組死亡2只,F(xiàn)組死亡1只。B組大鼠血清細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α明顯高于A組,而IL-4、IL-10明顯低于A組(P < 0.05)。 見表1。
表1 A、B 兩組大鼠血清中各指標(biāo)比較(μg/L,±s)
表1 A、B 兩組大鼠血清中各指標(biāo)比較(μg/L,±s)
注:與 A 組比較,△P < 0.05;IL-1β:白介素-1β;TNF-α:腫瘤壞死因子-α;IL-4:白介素-4;IL-10:白介素-10
組別 只數(shù) IL-1βTNF-αIL-4 IL-10 A組B組20 18 0.362±0.027 0.658±0.034△1.864±0.132 2.953±0.186△7.862±0.531 5.876±0.512△50.342±6.100 42.415±3.014△
與B組比較,各個(gè)治療組IL-1β、TNF-α明顯降低,IL-4、IL-10明顯升高(P< 0.05)。 與 F組比較,C、D組 IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10無明顯變化(P > 0.05)。 與F 組比較,E組IL-1β、TNF-α 明顯降低,IL-4、IL-10明顯升高(P < 0.05)。見表2。
表2 B組與各治療組各項(xiàng)指標(biāo)的比較(μg/L,±s)
表2 B組與各治療組各項(xiàng)指標(biāo)的比較(μg/L,±s)
注:與 B 組比較,*P < 0.05;與 F組比較,#P < 0.05;IL-1β:白介素-1β;TNF-α:腫瘤壞死因子-α;IL-4:白介素-4;IL-10:白介素-10
組別 只數(shù) IL-1βTNF-αIL-4 IL-10 B組C組D組E組F組18 20 20 20 19 0.658±0.034 0.548±0.027*0.564±0.032*0.404±0.016*0.513±0.035*2.953±0.186 2.715±0.155*2.689±0.151*1.987±0.113*#2.704±0.149*5.876±0.512 6.763±0.512 6.773±0.526*7.584±0.548*#6.803±0.513*42.415±3.014 45.887±3.946*46.076±4.601*49.973±4.017*#46.143±3.478*
造血干細(xì)胞移植是通過異體或自體的造血干細(xì)胞植入受者體內(nèi),使受者獲得造血和免疫功能重建的方法[6]。大量實(shí)驗(yàn)及臨床資料已經(jīng)證明臍帶血是極有潛力的造血干細(xì)胞來源[7-9]。臍帶血干細(xì)胞具有多向分化能力、免疫調(diào)節(jié)性能以及組織修復(fù)能力和低風(fēng)險(xiǎn)特性,并且其療效肯定,不需要組織配型,移植后沒有排斥反應(yīng)。王秦等[10]在臨床上已經(jīng)成功地應(yīng)用異基因臍帶干細(xì)胞靜脈輸注的移植方法治療3例難治性RA,移植后能顯著改善病情,減少免疫抑制劑的用量。
穴位注射是在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下,通過針刺與藥物注射相結(jié)合的一種注射方法[11-12]。針刺腧穴達(dá)到疏通經(jīng)氣、調(diào)節(jié)臟腑氣血功能,同時(shí)又與藥物相結(jié)合發(fā)揮藥物治療作用,從而達(dá)到腧穴、針刺、藥物三者相結(jié)合的治療效果。藥物注入穴位后激發(fā)了腧穴的良性調(diào)整作用,具有吸收快和放大藥物治療作用的效應(yīng)。這樣就可以減少藥物的用量,提高療效。外關(guān)穴為手少陽三焦經(jīng)之絡(luò)穴,是八脈交會(huì)穴,通陽維脈[13]。外關(guān)穴注射異基因hUCBSCs治療RA,一方面具有針刺效應(yīng),調(diào)節(jié)陰陽,刺激神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò),調(diào)節(jié)紊亂的免疫功能,另一方面發(fā)揮異基因hUCBSCs的作用,調(diào)節(jié)RA患者機(jī)體免疫紊亂,阻止病情進(jìn)展。
本實(shí)驗(yàn)研究hUCBSCs穴位移植治療CIA大鼠,在實(shí)驗(yàn)中采用外關(guān)穴注射、腕關(guān)節(jié)腔注射及尾靜脈注射三種方法,結(jié)果顯示,三種治療方法對(duì)RA大鼠均有明顯的治療作用,外關(guān)穴位移植對(duì)RA大鼠細(xì)胞因子的影響更大,作用明顯優(yōu)于MTX。這可能與穴位的作用不可分離[14-15]。異基因臍血干細(xì)胞外關(guān)穴位移植治療的特點(diǎn)就是調(diào)整機(jī)體的免疫功能,表現(xiàn)在能恢復(fù)和促進(jìn)IL-4、IL-10含量使Th2升高,降低TNF-α、IL-1β的量使Th1降低,使失衡的Th1/Th2趨向平衡,可能是通過抑制炎癥細(xì)胞遷移、抑制內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)、抑制滑膜細(xì)胞過度分泌細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)[16-17],從而減輕了臨床癥狀,延緩了病理進(jìn)展,防止了關(guān)節(jié)畸變和功能破壞。
綜上所述,本項(xiàng)目是將傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的穴位療法與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的干細(xì)胞移植技術(shù)相結(jié)合,以期開辟一條新的移植途徑,可以使干細(xì)胞更為簡單、無創(chuàng)、準(zhǔn)確地運(yùn)送到目的地,探求對(duì)RA新的治療方法,并通過此進(jìn)一步分析RA的發(fā)病機(jī)制。
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