化學(xué)－酶催化法制備D－谷氨酸與γ－氨基丁酸

楊成麗，馬子玉，胡曉麗，李大力

（1.南京理工大學(xué)生物工程系，江蘇 南京210094；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物學(xué)系，江蘇 南京210014；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，江蘇 南京210014）

L－谷氨酸脫羧酶（L－Glutamic acid decarboxylase，GAD）是一種廣譜酶，可以催化L－谷氨酸（L－Glu）脫羧生成 γ－氨 基 丁 酸 （γ－Aminobutyric acid，GABA）[1］。GABA是有效的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在醫(yī)藥行業(yè)應(yīng)用廣泛，近年來在食品行業(yè)也越來越受關(guān)注[2，3］。GABA目前主要采用化學(xué)合成法、植物提取法和微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，化學(xué)合成法安全性較差，植物富集的GABA含量很低，微生物發(fā)酵法主要使用含有GAD的菌種來發(fā)酵生產(chǎn) GABA[3－5］。

D－谷氨酸（D－Glu）是許多藥物、生物活性物質(zhì)以及聚合體的重要前體和中間體，可與多種金屬形成配合物，在超分子化學(xué)中也得到了廣泛應(yīng)用[6］。目前，DGlu的制備方法主要有手性拆分法、生物轉(zhuǎn)化法兩種，手性拆分法是利用手性拆分劑分離DL－Glu來生產(chǎn)DGlu[7］，該法工藝復(fù)雜，工業(yè)化應(yīng)用難度較大。生物轉(zhuǎn)化法是利用菌體或酶來轉(zhuǎn)化生產(chǎn)D－Glu。

作者從保加利亞乳桿菌粗提得到GAD，采用酶催化法由DL－Glu制備得到了D－Glu和GABA。

1 實驗

1.1 菌種與培養(yǎng)基

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii sp.Bulgaricus）從市售伊利原味酸奶中分離得到。接種環(huán)挑取市售伊利原味酸奶，平板劃線培養(yǎng)，于37℃培養(yǎng)24h后，觀察菌落形態(tài)并進行顯微鏡鏡檢，確定目的菌落。

改良LB培養(yǎng)基：蛋白胨2g·L－1，酵母膏5g·L－1，L－Glu 25g·L－1，pH 值6.0。

1.2 試劑與儀器

所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

WXG－4型旋光儀，上海光學(xué)儀器廠。

1.3 L－谷氨酸的消旋

參照文獻(xiàn)[8］方法對L－Glu進行消旋。在1L圓底燒瓶中加入54.08g（0.32mmol）L－Glu、400mL乙酸和20mL蒸餾水，水浴加熱并攪拌，L－Glu全部溶解后，加入4mL水楊醛于90℃攪拌反應(yīng)7h，加入6g活性炭，煮沸5min，過濾，旋蒸濃縮后用1mol·L－1鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至3.2，過濾收集沉淀，用少量蒸餾水洗滌，干燥，即為DL－Glu。

1.4 L－谷氨酸脫羧酶粗提物的制備

將菌種接種于5mL改良LB培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)18h，離心收集菌體，用蒸餾水重懸，冰浴中超聲破碎菌體，加2BV冷凍丙酮，混勻后于－20℃放置10min，離心收集沉淀，即得GAD粗提物。

1.5 D－Glu與GABA的制備

將由5mL菌液制備得到的GAD粗提物、2mL 4 mmol·L－1的磷酸吡哆醛溶液、8mL 50mmol·L－1的DL－Glu（用pH 值4.4的 H3PO4－NaH2PO4緩沖溶液配制）混合均勻，于37℃反應(yīng)不同時間。

反應(yīng)液旋蒸濃縮后用1mol·L－1鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至3.2，靜置后抽濾，獲得D－Glu，測定旋光度，參照文獻(xiàn)[9］計算D－Glu的光學(xué)純度。濾液參照文獻(xiàn)[10］加入2BV乙醇后，調(diào)節(jié)pH值至7.3，待有沉淀析出后抽濾，獲得GABA，計算收率。

1.6 產(chǎn)物分析方法

采用薄層層析（TLC）分析反應(yīng)體系中產(chǎn)物的形成，取一定時間的反應(yīng)液在經(jīng)過活化的硅膠板（G254）點樣層析，展層劑為正丁醇∶乙酸∶水＝4∶1∶3（體積比）。采用旋光儀測定谷氨酸的旋光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 DL－Glu的制備

實驗得到 DL－Glu 38.86g，消旋率為94.92%，收率為71.9%。

2.2 D－Glu與GABA的制備

GAD能專一性催化L－Glu的脫羧反應(yīng)，卻不能催化D－Glu脫去羧基，因此，GAD可將DL－Glu中的LGlu轉(zhuǎn)化為GABA。通過薄層層析（TLC）對反應(yīng)進程進行監(jiān)測，結(jié)果如圖1所示。

圖1 反應(yīng)不同時間，DL－Glu底物反應(yīng)液的TLC分析結(jié)果Fig.1 The TLC results for DL－Glu substrate solution reacted for different times

由圖1可知，反應(yīng)50h時，反應(yīng)液點樣層析后得到兩個大小基本一致的點，表明酶催化反應(yīng)基本完成。D－Glu收率為81%，光學(xué)純度為93.2%。GABA收率為48.7%。產(chǎn)物D－Glu與GABA的TLC分析結(jié)果見圖2。

3 結(jié)論

圖2 產(chǎn)物TLC分析結(jié)果Fig.2 The TLC results for the product

采用化學(xué)－酶法制備了D－Glu和GABA。將LGlu通過化學(xué)消旋制備DL－Glu，再用GAD將DL－Glu中的L－Glu轉(zhuǎn)化為GABA。用等電點沉淀法獲取DGlu和GABA，所得D－Glu的光學(xué)純度為93.2%、收率為81%，GABA收率為48.7%。

[1]許建軍，江波，許時嬰.谷氨酸脫羧酶（GAD）的研究進展[J］.食品工業(yè)科技，2004，25（7）：132－133.

[2]黃桂東，毛健，姬中偉，等.一株產(chǎn)γ－氨基丁酸植物乳桿菌 MJ0301培養(yǎng)基的優(yōu)化[J／OL］.食品科學(xué)，http：／／www.cnki.net／kcms／detail／11.2206.TS.20130105.1534.017.html.

[3]林親錄，王婧，陳海軍.γ－氨基丁酸的研究進展[J］.現(xiàn)代食品科技，2008，24（5）：496－500.

[4]胡超，左斌，謝達(dá)平.酵母產(chǎn)γ－氨基丁酸發(fā)酵條件的研究[J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2011，11（5）：861－863.

[5]秦江輝，周禮紅，胡開成，等.高產(chǎn)γ－氨基丁酸的紅曲霉菌株選育[J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（3）：320－322.

[6]許建軍，江波，許時嬰.Lactococcus lactis谷氨酸脫羧酶的分離純化及部分酶學(xué)性質(zhì)[J］.無錫輕工大學(xué)學(xué)報（食品與生物技術(shù)），2004，23（3）：79－84.

[7]翟立海，蔣立建，祝陽，等.以L－谷氨酸為原料制備D－谷氨酸的新方法[J］.應(yīng)用化工，2006，35（4）：313－315.

[8]栗更新，許文松，王蓓，等.L－谷氨酸的消旋研究及DL－谷氨酸的制備[J］.化學(xué)世界，2006，47（7）：433－435.

[9]周新蘭，周錫梁.氨基酸的檢驗方法[J］.氨基酸雜志，1984，（2）：59－64.

[10]馬強.γ－氨基丁酸結(jié)晶工藝研究[D］.無錫：江南大學(xué)，2009.