大孔吸附樹脂分離純化Pneumocandin B0的研究

謝新宇，孔 鵬，冷 鳳，張 煒

（微生物藥物國家工程研究中心 河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司，河北 石家莊050015）

卡泊芬凈（Caspofungin）是一種廣譜抗真菌藥物，由美國Merck公司開發(fā)，2001年上市[1］?？ú捶覂舻淖饔脵C(jī)制是非競(jìng)爭(zhēng)性地抑制真菌細(xì)胞壁的β－（1，3）－D－葡聚糖的合成，從而破壞細(xì)胞壁的完整性，最終導(dǎo)致真菌細(xì)胞溶解、死亡[2］。該藥物對(duì)于臨床常見的念珠菌屬和曲霉菌屬均有良好的抗菌效果，同時(shí)由于其特殊的作用機(jī)制，該類藥物還具有較高的安全性[3］。

天然產(chǎn)物Pneumocandin B0（PB0）經(jīng)側(cè)鏈修飾后得到的環(huán)狀六肽母核是合成卡泊芬凈的主要原料，PB0分子式為C50H80N8O17，分子量1065.21，結(jié)構(gòu)式見圖1[4］。目前關(guān)于PB0分離純化的報(bào)道較少，提取工藝較為復(fù)雜。作者采用大孔樹脂吸附法提取分離發(fā)酵液中的PB0，效果較好。

圖1 Pneumocandin B0結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structural formula of Pneumocandin B0

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

PB0發(fā)酵液，華北制藥新藥研發(fā)中心；PB0標(biāo)準(zhǔn)品，自制。

大孔吸附樹脂 XAD－4、XAD－1600，羅門哈斯公司；LX－18、LX－20，西安藍(lán)曉科技有限公司；HZ801、HZ818、HZ820、HZ841，上海華震科技有限公司；乙腈（色譜純），美國Merck公司；乙醇（工業(yè)級(jí)），滄州興隆化工有限公司；去離子水，自制；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

高效液相色譜儀，Shimadzu公司；攪拌器，上海司樂儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樹脂的預(yù)處理與再生

預(yù)處理方法：樹脂用乙醇充分浸泡24h以上，期間間歇攪拌（除去樹脂表面制孔劑、色素、雜質(zhì)等），之后用大量去離子水洗至洗滌液加水不再產(chǎn)生白色渾濁為止；再用4BV 1mol·L－1NaOH 溶液攪拌浸泡4h（除去酸性物質(zhì)），用去離子水洗至中性；再用4BV 1mol·L－1HCl溶液攪拌浸泡4h（除去堿性物質(zhì)），用去離子水洗至中性。

再生方法與預(yù)處理方法基本相同。

1.2.2 發(fā)酵液預(yù)處理

PB0發(fā)酵液經(jīng)真空抽濾后用去離子水洗滌，得到菌絲體；菌絲體用2BV乙醇攪拌浸泡3h，真空抽濾，得到PB0浸提液；浸提液加去離子水調(diào)至乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%，HPLC檢測(cè)其純度為13.3%。

1.2.3 樹脂靜態(tài)吸附量與解吸收率的測(cè)定

稱取8種預(yù)處理完畢的大孔吸附樹脂各2g（為濾干后濕重，下同），置于250mL錐形瓶中，分別加入PB0浸提液150mL，常溫低速攪拌3h，過濾，檢測(cè)濾液中PB0的質(zhì)量濃度；取過濾后樹脂加入150mL乙醇，在相同條件下進(jìn)行解吸，檢測(cè)解吸液中PB0的質(zhì)量濃度。根據(jù)式（1）、（2）計(jì)算樹脂對(duì)PB0的靜態(tài)吸附量和解吸收率：

式中：Q為樹脂靜態(tài)吸附量，μg·g－1；ρ0為原液質(zhì)量濃度，μg·mL－1；ρ1為吸附殘液質(zhì)量濃度，μg·mL－1；V1為加樣體積，mL；m 為樹脂質(zhì)量，g；D 為解吸收率，%；ρ2為解吸液質(zhì)量濃度，μg·mL－1；V2為解吸液體積，mL。

1.2.4 樹脂靜態(tài)洗脫實(shí)驗(yàn)

稱取預(yù)處理好的5份HZ818樹脂各2g，置于250mL錐形瓶中，加入過量PB0浸提液吸附至飽和，過濾。取濾干樹脂分別加入150mL 30%、40%、50%、60%、70%乙醇，常溫低速攪拌3h，過濾，檢測(cè)洗脫液中PB0的質(zhì)量濃度，根據(jù)式（2）計(jì)算不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)HZ818樹脂的解吸收率。

1.2.5 樹脂動(dòng)態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)

取預(yù)處理好的3份HZ818樹脂各200mL，濕法裝入3根玻璃柱（Φ∶H＝1∶7）。取同一批號(hào)的PB0浸提液上樣，上樣流速為200mL·h－1（即1BV·h－1），HPLC檢測(cè)流出液濃度，當(dāng)柱出口PB0濃度接近上樣液濃度10%時(shí)停止上樣，取600mL40%乙醇按相同流速洗柱。3根樹脂柱分別用75%、85%、95%乙醇解吸，解吸流速控制為100mL·h－1（即0.5BV·h－1），解吸液每50mL（即0.25BV）收集為一瓶，HPLC監(jiān)測(cè)解吸液PB0含量。合并收集PB0濃度大于100μg·mL－1的解吸液，用HPLC峰面積歸一化法測(cè)定純度。

1.3 色譜條件

色譜柱：Hypersil C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈－水 （50∶50，體積比）；流速1.0mL·min－1；柱溫40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)210nm；進(jìn)樣量10μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 樹脂的選擇

8種大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附量和解吸收率見表1 。

表1 8種大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附量和解吸收率Tab.1 Static adsorption amount and desorption yield of eight kinds of macroporous adsorptive resins

由表1 可以看出，HZ818樹脂對(duì)PB0的靜態(tài)吸附量和解吸收率最高，分別達(dá)10 436μg·g－1和95.3%，表明其可以很好地分離PB0。故選取HZ818樹脂作為吸附樹脂進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 洗脫條件的選擇

洗脫劑是影響大孔吸附樹脂吸附分離的重要因素，不同洗脫劑對(duì)于大孔吸附樹脂有不同的溶脹度，洗脫液中各溶質(zhì)的組成也有所不同。以不同體積分?jǐn)?shù)乙醇進(jìn)行HZ818樹脂的洗脫，解吸收率見圖2。

圖2 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇的解吸收率曲線Fig.2 Yield of static desorption with different volume fractions of ethanol

由圖2可以看出，70%乙醇對(duì)PB0有較好的洗脫效果，故可選用70%以上乙醇作為解吸劑；50%乙醇洗脫會(huì)造成PB0較多的損失，影響解吸收率；40%乙醇的PB0解吸收率僅有2.3%且洗脫液呈淺黃色，HPLC檢測(cè)其中含有較多雜質(zhì)，是比較理想的雜質(zhì)洗脫劑。故樹脂吸附飽和后先用40%乙醇洗脫部分色素和極性較大的雜質(zhì)，再用較高體積分?jǐn)?shù)乙醇解吸。進(jìn)行動(dòng)態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)，不同體積分?jǐn)?shù)乙醇的解吸效果比較見表2 。

2.3 解吸條件的確定

表2 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇解吸效果比較Tab.2 The comparison of desorption efficiencies of ethanol with different volume fractions

由表2 可以看出，75%乙醇解吸不完全，拖尾較嚴(yán)重，不適合作為解吸劑；85%、95%乙醇解吸基本不拖尾，而95%乙醇解吸收率比85%乙醇雖略有提高，但其解吸液色譜純度較85%乙醇解吸液明顯下降，溶液色度也較深，這說明當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過高時(shí)，大量的雜質(zhì)一同被解吸下來。綜合考慮，宜選取85%乙醇作為解吸劑。

3 結(jié)論

研究了用大孔吸附樹脂從發(fā)酵液中提取Pneumocandin B0的工藝條件。從8種大孔吸附樹脂中篩選出的大孔吸附樹脂HZ818可以很好地分離PB0，靜態(tài)吸附量達(dá)10 436μg·g－1。用 HZ818樹脂柱吸附飽和后，先用40%乙醇洗滌、再用85%乙醇解吸，解吸收率達(dá)到91.6%，PB0濃度富集20倍以上，色譜純度由13.3%提高至78.6%，為后續(xù)的精制工藝奠定了基礎(chǔ)。該吸附－洗滌－解吸工藝簡(jiǎn)單易行、成本低、環(huán)保，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

[1]李岷，沈永年，呂桂霞，等.棘白菌素類抗真菌藥[J］.中國真菌學(xué)雜志，2009，4（4）：249－256.

[2]Denning D W.Echinocandin antifungal drugs[J］.Lancet，2003，362（9390）：1142－1151.

[3]Deresinski S C，Stevens D A.Caspofungin[J］.Clin Infect Dis，2003，36（11）：1445－1457.

[4]滕云，陳正杰，鄭玲輝，等.棘白菌素類抗真菌藥物的結(jié)構(gòu)與微生物合成[J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2010，41（10）：776－782.