微波制備γ－干擾素處理的小鼠H22肝癌細(xì)胞瘤苗的抗瘤作用

楊曉峰，楊新宏，朱艷菊，丁曉旭，楊 寧，連相堯（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德 067000）

由于腫瘤的抗原性較弱，表達(dá)的主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex class I，MHC-I）較少或缺失，因此腫瘤細(xì)胞可以逃避機(jī)體的免疫攻擊。γ－干擾素（IFN-γ）是由T細(xì)胞分泌的一種多功能調(diào)節(jié)因子，可通過誘導(dǎo)MHC-I類抗原的表達(dá)、增加肽轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的穩(wěn)定性、誘導(dǎo)某些細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)（如ICAM-1、LFA-1）增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的抗原遞呈能力［1－2］。微波作為抗原修復(fù)的方法已廣泛應(yīng)用于免疫組織化學(xué)染色的抗原暴露，是最敏感的抗原修復(fù)方法，它可使病理切片的抗原充分暴露，提高免疫組化染色的敏感性［3］。全細(xì)胞瘤苗可表達(dá)多種腫瘤抗原［4］，因此用IFN－γ處理H22腫瘤細(xì)胞，再用微波制備全細(xì)胞瘤苗，既消除了它的致瘤性，又增強(qiáng)了其抗原性，且操作簡(jiǎn)單。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡健康BALB／C小鼠，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，小鼠體質(zhì)量14～16g，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.1.2 腫瘤細(xì)胞 H22瘤株由白求恩醫(yī)科大學(xué)提供，液氮凍存。使用時(shí)37℃水浴融解后，RPMI-1640培養(yǎng)液洗3遍，接種于含10%胎牛血清（FBS）的1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集細(xì)胞接種于BALB／C小鼠腹腔傳代。

1.2 微波制備IFN-γ處理的 H22肝癌細(xì)胞瘤苗（MITTVH22）的制備 收集BALB／C小鼠腹腔積液H22腫瘤細(xì)胞，1640培養(yǎng)液洗2遍，用H22腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，加入IFN-γ（200U／mL）37℃5%CO2培養(yǎng)48h。收集H22腫瘤細(xì)胞，用生理鹽水洗2遍，制成2.5×106／mL的H22細(xì)胞懸液，微波照射20s（750w、2 450MHz），臺(tái)盼藍(lán)染色后光鏡下觀察證實(shí)H22腫瘤細(xì)胞被全部滅活，制成MITTV-H22，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與動(dòng)物模型的制備 60只小鼠檢疫10d后隨機(jī)分成 A、B、C、D、E、F 6組，每組各10只。實(shí)驗(yàn)組（A、C、E）小鼠右后肢外側(cè)皮下接種 MITTV-H22（2.5×106／mL）0.2 mL進(jìn)行免疫，每周免疫1次，共3次。對(duì)照組（B、D、F）小鼠用生理鹽水代替MITTV-H22進(jìn)行免疫。實(shí)驗(yàn)組（A、C）與對(duì)照組（B、D）均于末次免疫后第7天，接種 H22腫瘤細(xì)胞（1×106個(gè)）于右腋皮下。A、B兩組用于觀察小鼠生存情況，觀察120d。C、D兩組于H22腫瘤細(xì)胞接種后的第7天取瘤塊測(cè)量體積。瘤塊體積的計(jì)算公式為：V＝0.4×a×b2（a為長(zhǎng)軸，b為短軸）［5］。E、F兩組于末次免疫后第10天，做脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（MTT）。無菌取小鼠脾臟，用淋巴細(xì)胞分離液按常規(guī)分離脾淋巴細(xì)胞，用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)成濃度為1×107／mL的脾細(xì)胞懸液，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1×105個(gè)淋巴細(xì)胞，于刺激細(xì)胞H22孔加入多聚甲醛處理的H22腫瘤細(xì)胞1×104個(gè)，37℃5%CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)8h。8h后每孔加入20μL（5mg／mL）MTT溶液再孵育4h。2 000r／min室溫離心10min，棄上清液，加入二甲基亞砜（DMSO）150μL，震蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀上測(cè)OD值（測(cè)定波長(zhǎng)570nm）。

刺激指數(shù)（SI）＝（自發(fā)轉(zhuǎn)化孔OD值－刺激細(xì)胞H22孔OD值）／自發(fā)轉(zhuǎn)化孔OD值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 15.0軟件對(duì)腫瘤體積進(jìn)行重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，其他資料均用2個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠生存期 對(duì)照組小鼠平均生存期為（31.87±5.87）d，實(shí)驗(yàn)組小鼠120d時(shí)的生存率為80%，生存期明顯延長(zhǎng)，明顯長(zhǎng)于對(duì)照組（t＝25.55，P＜0.01）。見表1。

2.2 腫瘤生長(zhǎng)情況 實(shí)驗(yàn)組小鼠于接種H22腫瘤細(xì)胞的第7天接種部位沒有發(fā)現(xiàn)肉眼可見的包塊，解剖觀察腫瘤接種部位亦未發(fā)現(xiàn)瘤塊；120d后經(jīng)解剖也沒有發(fā)現(xiàn)腫瘤組織。對(duì)照組于接種H22腫瘤細(xì)胞后的5～6d接種部位出現(xiàn)直徑小于0.5 cm的包塊，成瘤率為100%；接種后7d，腫瘤的平均體積為（4.8±1.0）mm3。

2.3 脾淋巴細(xì)胞SI MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠的SI顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝3.526，P＜0.01）。見表1。

表1 小鼠生存期、腫瘤體積和淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)比較（x±s）

3 討 論

多數(shù)腫瘤主要組織相容性復(fù)合體I（MHC-I）類分子表達(dá)明顯減少或缺失，使CTL不能識(shí)別腫瘤細(xì)胞的抗原，腫瘤細(xì)胞從而得以逃避宿主的免疫攻擊。MHC-I類抗原表達(dá)減少或消失與腫瘤細(xì)胞去分化有關(guān)，使T細(xì)胞識(shí)別腫瘤抗原受阻，不能起到有效的殺腫瘤效應(yīng)［6］。IFN是調(diào)節(jié)MHC-I類分子高表達(dá)的重要生物因子［7－9］。Ⅰ型和Ⅱ型IFN均可引起 MHC-I類抗原表達(dá)增高，而IFN－γ的作用更強(qiáng)，IFN-γ由T細(xì)胞產(chǎn)生，能直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖、增加表面MHC抗原和腫瘤壞死因子的表達(dá)、抗腫瘤血管生成等［10］。

腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫攻擊的另一原因是腫瘤細(xì)胞表面“抗原覆蓋”或被封閉?！翱乖采w”是指腫瘤細(xì)胞表面抗原可能被某些物質(zhì)所覆蓋，如腫瘤細(xì)胞可表達(dá)高水平的唾液黏多糖或表達(dá)腫瘤激活的凝聚系統(tǒng)，這兩種成分均可覆蓋腫瘤抗原。腫瘤抗原可經(jīng)糖基化等方式隱藏，這一過程稱為抗原遮蔽。微波作為抗原修復(fù)的方法已廣泛應(yīng)用于免疫組織化學(xué)染色的抗原暴露，是最敏感的抗原修復(fù)方法［11－13］。微波可使病理切片的抗原更充分地暴露，提高免疫組化染色的敏感性。

本研究使用的小鼠肝癌細(xì)胞株H22的MHC－Ⅰ表達(dá)缺失，且腫瘤抗原性弱。IFN-γ和微波共同處理H22腫瘤細(xì)胞制備瘤苗MITTV-H22，既消滅了致瘤性又增加了表面 MHC－Ⅰ類抗原的表達(dá)，提高其抗原遞呈能力和抗原性。初步研究發(fā)現(xiàn)：（1）實(shí)驗(yàn)組小鼠的SI明顯高于對(duì)照組；（2）實(shí)驗(yàn)組小鼠于H22腫瘤細(xì)胞攻擊7d時(shí)沒有發(fā)現(xiàn)肉眼可見的腫瘤組織，120 d后經(jīng)解剖也沒有發(fā)現(xiàn)腫瘤組織，對(duì)照組于H22腫瘤細(xì)胞攻擊后第5天即發(fā)現(xiàn)肉眼可見的瘤塊。說明MITTV-H22的抗原性有了很大的提高，能有效地激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，對(duì)H22細(xì)胞型腫瘤具有很強(qiáng)的預(yù)防作用。

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