凝聚胺法與微柱凝聚法檢測不規(guī)則抗體的對(duì)比分析

龍華泉，陳世豪，張偉堅(jiān)（南方醫(yī)科大學(xué)附屬廣東省江門市新會(huì)區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 529100）

臨床患者輸血前進(jìn)行交叉配血，紅細(xì)胞ABO血型系統(tǒng)相合是最重要的，但由于患者多次輸血或其他原因產(chǎn)生的ABO血型系統(tǒng)以外的不規(guī)則抗體，如漏檢也會(huì)導(dǎo)致受血患者嚴(yán)重的輸血反應(yīng)［1］。為此作者進(jìn)行凝聚胺法與微柱凝聚法兩種方法在不規(guī)則抗體檢測方面的比較，為臨床提供合適的篩檢方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2010～2011年本院各科室6 720例預(yù)約輸血患者，其中男4 568例，女2 152例，年齡7d至88歲，平均年齡44歲。

1.2 儀器與試劑 TD－2Y醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)多功能離心機(jī)；微柱凝膠卡由中山市生科試劑儀器有限公司提供，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ號(hào)篩選細(xì)胞、抗人球蛋白試劑和譜細(xì)胞均由上海血液生物醫(yī)藥有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本處理 抽取3mL靜脈血，均用乙二胺四乙酸二鉀（EDTA－K2）抗凝，檢測前進(jìn)行離心，排除纖維蛋白干擾。

1.3.2 凝聚胺法 向已準(zhǔn)備好（患者血漿＋5%篩選細(xì)胞）試管各加0.5%篩選細(xì)胞低離子介質(zhì)懸液（LIM）0.7mL，混合均勻后，再各加凝聚胺溶液2滴，并混合均勻；用專用離心機(jī)3 400r／min離心10s，然后把上清液倒掉，不要瀝干，讓管底殘留約0.1mL液體；輕輕搖動(dòng)試管，目測紅細(xì)胞有無凝集，如無凝集，則必須重作；最后加入假凝集清除液2滴，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)試管混合并同時(shí)觀察結(jié)果。如果凝集散開，表示是由凝聚胺引起的非特異性聚集，抗體篩檢結(jié)果為陰性；如凝集不散開，則為紅細(xì)胞抗原抗體結(jié)合的特異性反應(yīng)，抗體篩檢結(jié)果為陽性，應(yīng)進(jìn)一步作抗體鑒定。

1.3.3 微柱凝聚法 撕開微柱凝膠卡的封膜，于反應(yīng)腔中依標(biāo)記分別加入相應(yīng)的LIM 100μL，各管再加入待檢血漿25 μL；將檢測卡37℃孵育15min取出，置離心機(jī)1 800r／min離心2min后取出，根據(jù)紅細(xì)胞沉降于管腔的部位判斷結(jié)果。

1.3.4 確證試驗(yàn) 兩種方法篩查不規(guī)則抗體陽性再用特異性譜細(xì)胞在抗人球蛋白介質(zhì)中進(jìn)行確證。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0的χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié) 果

2.1 兩種方法檢測結(jié)果 對(duì)6 720例預(yù)約輸血的患者標(biāo)本用凝聚胺法和微柱凝聚法篩查不規(guī)則抗體陽性率及既往情況見表1。

2.2 不規(guī)則抗體特異性鑒定 利用抗人球蛋白法對(duì)28例不規(guī)則抗體的特異性進(jìn)行鑒定，其中自身抗體7例（高效價(jià)冷凝素5例，溫抗體2例），均為白血病患者；1例腫瘤化療患者推測為藥物抗體；其余20例為血型同種特異性抗體，抗－D 5例，抗－E 7例，抗－C 2例，抗－Ec 2例、抗－JK 1例、抗－Mur 2例以及ABO亞型中抗－A 1例。具體分布見表2。

表1 6 720份標(biāo)本兩種方法結(jié)果（n＝6 720）

表2 不規(guī)則抗體特異性分布情況（n＝28）

3 討 論

臨床輸血安全保障日益受到重視，隨著試劑及技術(shù)的改進(jìn)，過去因血型鑒定靈敏度方面的誤差所引起的嚴(yán)重輸血反應(yīng)已鮮有報(bào)道。然而，人類紅細(xì)胞有29個(gè)血型系統(tǒng)，不規(guī)則抗體是血清中抗－A、抗－B以外的其他血型抗體，其引起的遲發(fā)型輸血反應(yīng)輕者引起寒戰(zhàn)、發(fā)熱，影響治療效果，嚴(yán)重者危及患者生命，對(duì)孕婦而言，不規(guī)則抗體如常見的Rh系統(tǒng)中IgG的抗－D、抗－E／e和抗－C等會(huì)引起新生兒溶血?。?］，影響新生兒臟器的發(fā)育，并使其智力發(fā)育受到傷害，嚴(yán)重者則會(huì)危及新生兒的生命安全，所以為臨床提供合適的篩查試劑非常重要。早期的鹽水法因只能篩查出IgM抗體早已淘汰，目前應(yīng)用于臨床的方法主要是凝聚胺法、微柱凝聚法、抗人球蛋白法等。凝聚胺（polymatching）法首先利用低離子介質(zhì)降低溶液的離子強(qiáng)度，減少紅細(xì)胞周圍的陽離子云，促進(jìn)血清（漿）中的抗體與紅細(xì)胞相應(yīng)抗原結(jié)合，再加入帶亞電荷的高價(jià)陽離子多聚物－凝聚胺溶液，中和紅細(xì)胞表面的負(fù)電荷，縮短細(xì)胞間距，形成可逆的非特異性聚集，并使IgG型抗體直接凝集紅細(xì)胞。加入中和液后，僅由凝聚胺引起的非特異性聚集，會(huì)因電荷中和而分散，而由抗體介導(dǎo)的特異性凝集則不會(huì)分散。凝聚胺是一種抗肝素藥物，所以對(duì)于含肝素的血液標(biāo)本要稍稍多加一些凝聚胺來中和肝素。有研究報(bào)道，凝聚胺法對(duì)Kell系統(tǒng)的抗體檢出不理想，所以陰性結(jié)果要轉(zhuǎn)入抗人球蛋白試驗(yàn)，以免漏檢。K的抗原頻率約為7%，由于K抗原具有較強(qiáng)的免疫原性，所以歐美國家都將Kell作為輸血前血型檢測的必檢項(xiàng)目。中國人群中，Kell血型一直被認(rèn)為多態(tài)性較單一，基本都為K，且K的頻率約為0.07%，因此輸血前不進(jìn)行K抗原的定型。微柱凝膠技術(shù)作為一項(xiàng)免疫學(xué)檢測技術(shù)，它是凝膠過濾技術(shù)和抗原抗體反應(yīng)的結(jié)合，已在歐美等發(fā)達(dá)國家作為常規(guī)性檢測技術(shù)應(yīng)用于臨床，由于凝膠顆粒具有分子篩作用，抗原抗體反應(yīng)后的紅細(xì)胞通過離心經(jīng)過微柱，無IgG結(jié)合的紅細(xì)胞穿過凝膠到達(dá)底部，而紅細(xì)胞上若有IgG抗體結(jié)合則會(huì)被凝膠中的抗IgG拉住，紅細(xì)胞被阻止在凝膠柱上層或中間。本文兩種檢測方法比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），對(duì)于凝聚胺法漏檢的2例的不規(guī)則抗體特異性鑒定為抗－E和抗－Jka，微柱凝膠檢測結(jié)果為陽性，經(jīng)試驗(yàn)分析其抗體效價(jià)分別為8和4?？梢姡⒅z法靈敏度更高，效價(jià)較低的抗體也可檢測到，這與張晨光等［3］研究比對(duì)兩種方法檢測不規(guī)則抗體效價(jià)的差距相一致。凝聚胺因效價(jià)因素漏檢國內(nèi)也曾有文獻(xiàn)報(bào)道［4－6］，另外，凝聚胺法也受人為操作因素影響，如加試劑量、離心機(jī)控制、振蕩觀察等等都會(huì)帶來人為的誤差而漏檢。相對(duì)而言，微柱凝膠法的反應(yīng)卡操作易掌握、結(jié)果穩(wěn)定、受人為因素的影響小，已成為輸血檢查的推薦方法。

本試驗(yàn)檢出不規(guī)則抗體的患者中，有輸血史22例，妊娠史6例，男性患者13例，而女性患者15例，未見明顯性別傾向，與有文獻(xiàn)報(bào)道女性高于男性不同，這可能與研究的總樣本類型分布有關(guān)。而總體篩查不規(guī)則抗體陽性率為0.42%，與國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道（0.37%）較一致，但與本省何子毅等［7］報(bào)道不規(guī)則抗體陽性率（0.09%）有較大差距。不規(guī)則抗體大多為Rh血型系統(tǒng)，Rh抗原強(qiáng)弱順序?yàn)镈＞E＞c＞C＞e，本次篩查出抗－D 3例，抗－E 5例，抗－C 2例，抗－Ec 2例，提示Rh陽性患者輸血也有機(jī)會(huì)引起溶血反應(yīng)。根據(jù)我國漢族人群Rh抗原分布特點(diǎn)，E抗原陽性比D抗原陽性低，產(chǎn)生E抗體的概率高于D抗體，本次篩查出抗－E占最大比例，故Rh血型系統(tǒng)D抗原陽性E抗原陰性輸血者不容忽視［8］。

綜上所述，不規(guī)則抗體的篩選對(duì)于臨床輸血安全非常重要，通過比較凝聚胺和微柱凝聚法兩種方法都基本能一致地對(duì)輸血前有效把關(guān)，對(duì)于軟硬件條件較好的大醫(yī)院，選用微柱凝聚法是最好的選擇，而對(duì)于基層醫(yī)院或者急診需要，凝聚胺法以其簡便快速準(zhǔn)確、成本低等方面的優(yōu)點(diǎn)也可推廣使用。

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