菌核側(cè)耳黃酮的超聲法提取及體外抗氧化性能

謝宗波， 陳 赟， 樂長高

(1.東華理工大學(xué)化學(xué)生物與材料科學(xué)學(xué)院，江西南昌 330013;2.江蘇省地質(zhì)礦產(chǎn)局第六地質(zhì)大隊，江蘇連云港 222023)

菌核側(cè)耳(Pleurotus tuber-regium(Fr.)Sing)，又名核側(cè)耳、虎奶菇等，屬擔(dān)子菌綱傘菌目側(cè)耳科，系木腐生大型真菌(余志堅等，2010)。菌核側(cè)耳富含蛋白質(zhì)、氨基酸、膳食纖維、維生素、礦物質(zhì)等活性成分，具有治療痢疾、哮喘、冠心病、高血壓、腫瘤等功效，是一種極具開發(fā)前景的“藥食同源”菌(包水明等，2007;韓建東等，2011;張越等，2012;馮雪風(fēng)等，2007)。過去10年，有不少關(guān)于菌核側(cè)耳的研究報道，如包水明等(2007)，余志堅等(2005)，阮瑞國(2002)，林戎斌等(2001)對其栽培技術(shù)進行了研究;余志堅等(2010)，馮雪風(fēng)等(2007)，曾小龍等(2007)對其活性成分進行了分析;也有不少關(guān)于菌核側(cè)耳液體發(fā)酵的報道(李榮同等，2008;吳錦忠等，2005)。這些研究為菌核側(cè)耳的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

黃酮是一類廣泛存在于植物及微生物中的次生代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、抗病毒、降血脂、防衰老及抗癌等功效，并且已有大量關(guān)于黃酮的研究(劉峙嶸等，2005;李芳濤等，2009;黃瓊等，2012;鄭朝華等，2012;謝宗波等，2009;陳中勝等，2002)，但還未見菌核側(cè)耳黃酮的相關(guān)報道。筆者探索了超聲法提取菌核側(cè)耳黃酮的工藝條件，并對其純化方法和抗氧化性能進行了初步的研究，該研究進一步豐富了菌核側(cè)耳的研究內(nèi)容，為促進菌核側(cè)耳的開發(fā)及推廣應(yīng)用具有重要意義。

1 實驗材料

AB-8樹脂(南開大學(xué)化工廠)，蘆丁標準品(生化試劑，上海試劑一廠);可見分光光度計(VIS-723G型，上海精密科學(xué)儀器有限公司)，臺式超聲波清洗器(KQ-250DB型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);菌核側(cè)耳子實體和菌絲體由東華理工大學(xué)生物系食用菌研究中心提供，60℃干燥后粉碎備用;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 實驗方法

2.1 總黃酮的提取

稱取菌核側(cè)耳子實體(或菌絲體)粉末0.5 g于圓底燒瓶中，加入適量的80%乙醇溶液，安裝回流裝置，在一定溫度下超聲提取30 min，提取液冷卻至室溫后，抽濾，濾液用80%乙醇溶液定容至50 mL容量瓶中備用。

2.2 黃酮的測定

(1)蘆丁標準溶液的配置。稱取蘆丁標準品(已80℃真空干燥至恒重)15.0 mg，用80%乙醇配成0.30 mg/mL的標準溶液。

(2)最大吸收波長及回歸方程。根據(jù)謝宗波等(2009)確定黃酮的最佳測定波長，并建立回歸方程。

(3)黃酮的測定。取菌核側(cè)耳黃酮提取液2 mL，根據(jù)謝宗波等(2009)測吸光度，并根據(jù)回歸方程計算黃酮提取率。

2.3 樹脂吸附技術(shù)純化菌核側(cè)耳黃酮

許劍平等(2012)對AB-8大孔吸附樹脂進行預(yù)處理。稱取處理后的樹脂1.00 g于錐形瓶中，向其中加入黃酮提取液25 mL，25℃震蕩吸附2 h;過濾，用濾紙吸干水分后，將負載樹脂置于適量的95%的乙醇溶液中，30℃震蕩洗脫2 h，按實驗方法測定濾液中的黃酮含量，并根據(jù)下列公式計算樹脂的吸附量和解吸率。

吸附量(mg/g)=(吸附前黃酮總量－吸附后黃酮總量)/樹脂的質(zhì)量

解吸率(%)=洗脫液中黃酮總量/總吸附量×100

2.4 顏色實驗

利用純化后黃酮的顏色反應(yīng)實驗，鑒別菌核側(cè)耳黃酮。

(1)鹽酸-鎂粉反應(yīng)。向2 mL黃酮提取液中加適量鎂粉，再滴加濃鹽酸數(shù)滴，1～2 min內(nèi)觀察顏色變化。

(2)FeC13反應(yīng)。向2 mL黃酮提取液中滴加1%FeC13溶液數(shù)滴，混勻，觀察現(xiàn)象。

(3)AlCl3反應(yīng)。滴一滴黃酮提取液于濾紙上，干燥后噴l%AlCl3溶液，烘干后在紫外燈下觀察熒光。

(4)堿性試劑反應(yīng)。滴一滴黃酮提取液于濾紙上，干燥后噴4%NaOH溶液，烘干后觀察顏色變化。

(5)濃硫酸反應(yīng)。取2 mL黃酮提取液于試管中，加入濃硫酸數(shù)滴，混勻，滴在濾紙上，吹干后觀察現(xiàn)象。

2.5 抗氧化試驗

(1)測定原理。通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基(·OH)，能夠氧化水楊酸生成2，3-二羥基苯甲酸，該產(chǎn)物在510 nm處有特征吸收，通過測定水楊酸捕獲·OH所得到的產(chǎn)物的量，來確定菌核側(cè)耳黃酮對·OH的清除率。

(2)測試方法。在25 mL容量瓶中依次加入3 mL 2 mmol/L 的 FeSO4、3 mL l mmol/L 的 H2O2，混勻后加入6 mmol/L水楊酸3 mL，搖勻，于37℃水浴中處理15 min，蒸餾水定容，在510 nm處測吸光度A0(蒸餾水做參比)。在25 mL容量瓶中加入一定量經(jīng)純化的黃酮提取液，再依次加入3 mL 2 mmol/L 的 FeSO4、3 mL l mmol/L 的 H2O2，混勻后加入6 mmol/L水楊酸3 mL，搖勻，于37℃水浴中處理15 min，蒸餾水定容，在510 nm處測吸光度A(蒸餾水做參比)。按下式計算黃酮提取液對·OH的清除率:

清除率%=(A0-A)/A0×100

3 結(jié)果與討論

3.1 吸收光譜及回歸方程

由蘆丁標準溶液、菌核側(cè)耳黃酮提取液吸收光譜數(shù)據(jù)確定λmax=512 nm;由標準曲線數(shù)據(jù)得回歸方程為:c=98A+0.90，R=0.999 5。

3.2 菌核側(cè)耳總黃酮提取工藝的優(yōu)化

在比較了索氏提取、超聲波及微波的提取效果后，決定以乙醇水溶液為提取劑，選擇超聲技術(shù)進行菌核側(cè)耳子實體總黃酮的提取;并通過單因素實驗探索了乙醇濃度、時間、溫度、料液比等因素對提取效果的影響。

(1)時間對提取率的影響。以80%乙醇為提取劑，在料液比為1∶30的條件下，60℃超聲提取一定時間，所得結(jié)果如表1所示。由表1數(shù)據(jù)可知，提取30 min可取得最佳的提取效果，隨提取時間進一步延長，黃酮得率反而有所降低，可能是因為長時間的超聲處理破壞了部分黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。因此選擇30 min作為最佳提取時間。

表1 提取時間對黃酮提取率的影響Table 1 Effect of extracting time on the extraction rate of flavones

(2)乙醇濃度對提取率的影響。以50%～90%的乙醇水溶液做提取劑，料液比為1∶30，60℃條件下超聲提取30 min，所得結(jié)果見表2;由表2可知，乙醇濃度對黃酮提取率有較明顯的影響，以80%的乙醇水溶液做提取劑效果最好，因此選擇80%乙醇溶液用于后續(xù)研究。

接下來考察了溫度和料液比對黃酮提取效果的影響，實驗結(jié)果表明，70℃和料液比1∶30(g/mL)條件下黃酮得率最高。綜上所述，菌核側(cè)耳子實體總黃酮提取的最佳條件為:以80%乙醇水溶液為提取劑，料液比為1∶30，70℃條件下超聲提取30 min，黃酮得率為0.20%。而在此條件下，菌絲體的黃酮得率可達0.36%，可見菌核側(cè)耳菌絲體的黃酮含量高于子實體。

表2 乙醇濃度對提取率的影響Table 2 Effect of alcohol concentration on the extraction rate

3.3 大孔樹脂對黃酮的靜態(tài)吸附效果

AB-8大孔樹脂對菌核側(cè)耳黃酮的吸附量為5.2 mg/g，解吸率為 92%。

3.4 顏色反應(yīng)實驗

菌核側(cè)耳黃酮提取液的顏色反應(yīng)結(jié)果如表3所示，由顏色反應(yīng)結(jié)果可進一步證實菌核側(cè)耳子實體和菌絲體中黃酮類化合物的存在，但黃酮類型及結(jié)構(gòu)有待進一步研究確定。

表3 顏色反應(yīng)結(jié)果Table 3 The results of color reactions

3.5 體外抗氧化實驗

實驗結(jié)果表明，在添加黃酮0.04～0.2 mg/mL濃度范圍內(nèi)，隨黃酮加入量的增加，其清除·OH的能力不斷增強，當黃酮濃度為0.2 mg/mL時，有50%的自由基可被清除。可見，菌核側(cè)耳黃酮的體外抗氧化能力較強。

4 結(jié)論

⑴本研究首次報道了菌核側(cè)耳黃酮類化合物的提取工藝。

⑵實驗結(jié)果表明，菌核側(cè)耳菌絲體、子實體中都存在黃酮類化合物，菌絲體中黃酮含量高于子實體。

⑶菌核側(cè)耳黃酮對·OH有較強的清除能力。

包水明，李榮同，陳傳紅，等.2007.虎奶菇及其人工栽培技術(shù)［J］.食用菌，(2):59-61.

陳中勝，黃國林.2002.異黃酮的合成研究進展［J］.華東地質(zhì)學(xué)院學(xué)報，25(1):62-66.

馮雪風(fēng)，金衛(wèi)根.2007.菌核側(cè)耳東華虎奶-1號的蛋白質(zhì)與氨基酸成分分析［J］.食用菌，(5):58-59.

韓建東，宮志遠，曲玲，等.2011.菌核側(cè)耳菌絲生長對碳氮營養(yǎng)的需求［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，39(2):369-371.

黃瓊，田玉紅，蒲香.2012.定心藤總黃酮的提取及抗氧化活性的研究［J］.中成藥，34(11):2241-2243.

李芳清，孫榮.2009.柑桔皮中黃酮類物質(zhì)的提取與純化研究［J］.東華理工大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，32(3):249-252.

李榮同，包水明，陳傳紅，等.2008.菌核側(cè)耳液體培養(yǎng)條件優(yōu)化研究［J］.菌物研究，6(3):175-178.

林戎斌，陳濟琛，林新堅.2001.虎奶菇引種栽培試驗［J］.食用菌，(2):15.

劉峙嶸，俞自由，方裕勛，等.2005.微波萃取銀杏葉黃酮類化合物［J］.東華理工學(xué)院學(xué)報，28(2):151-154.

阮瑞國.2002.虎奶菇生物學(xué)特性及栽培技術(shù)研究［J］.河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，6(1):54-56.

吳錦忠，志強，林文雄.2005.不同液體發(fā)酵培養(yǎng)基對虎奶菇菌絲生長的影響［J］.中國食用菌，24(4):33-35.

謝宗波，彭道鋒，樂長高.2009.南瓜莖黃酮的微波提取及抗氧化性能研究［J］.中國食品添加劑，(6):88-91.

許劍平.2012.微波法提取薺菜黃酮［J］.食品研究與開發(fā)，(1):41-43.

余志堅，包水明，李榮同.2005.菌核側(cè)耳栽培技術(shù)［J］.江西園藝，(3):24-25.

余志堅，陳傳紅，趙晉宇.2010.3種比色法測定菌核側(cè)耳多糖含量的比較研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，(6):451-452.

曾小龍，胡高蒙.2007.虎奶菇的化學(xué)成分與藥理作用研究［J］.中國食用菌，26(5):3-7.

張越，郭成金.2012.菌核側(cè)耳原生質(zhì)體制備再生的研究［J］.天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，18(5):24-27.

鄭朝華，陳建秋.2012.西洋參總黃酮的提取及其對羥基自由基清除的作用［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，40(32):15903-15904.