利用光纖光譜技術(shù)檢測(cè)牛奶中黃曲霉素等致癌物質(zhì)

楊啟棟　周尹黔　王佳煒

【摘要】牛奶成分的監(jiān)測(cè)是牛奶生產(chǎn)過(guò)程中至關(guān)重要的步驟，然而目前市場(chǎng)上的檢測(cè)牛奶水分的儀器測(cè)量范圍在0%-80%，分辨率在0.1%-0.01%，難以滿足消費(fèi)者的要求。此系統(tǒng)利用吸收光譜和拉曼效應(yīng)的原理進(jìn)行光譜分析，可以精確測(cè)出牛奶中水分和其他一些有害成分（如黃曲霉素）的含量。我們將以上的方法做成一套完整的系統(tǒng)，當(dāng)檢測(cè)到牛奶中的某種物質(zhì)偏多后，系統(tǒng)自動(dòng)將其處理掉，從而省掉了人工檢測(cè)所浪費(fèi)的時(shí)間。所制成的檢測(cè)系統(tǒng)安全環(huán)保操作簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)效益高。

一、物理背景

2011年12月26日爆發(fā)了蒙牛純牛奶事件。據(jù)報(bào)道稱被檢測(cè)出黃曲霉毒素M1實(shí)測(cè)值為1.2μg/g，國(guó)家規(guī)定的最高值為0.5μg/kg，蒙牛該批次產(chǎn)品超標(biāo)140%。隨后全國(guó)陸陸續(xù)續(xù)的爆發(fā)其他黃曲霉素超標(biāo)的事件。繼黃曲霉素事件后人們又一次陷入恐慌。目前市場(chǎng)檢測(cè)黃曲霉素M1主要有薄層分析法（TLC），液相色譜法（HPLC），液相色譜法（HPLc），熒光光度法（IAc/sFB）等方法。但是由于薄層分析法（TLC）檢測(cè)限為5.0μg/kg，液相色譜法（HPLC）的檢測(cè)限為1.0μg/kg，熒光光度法（IAc/SFB）的檢測(cè)限也為1.0μg/kg。所以這三種方法不能很精確的測(cè)出牛奶中的黃曲霉素是否超標(biāo)。酶聯(lián)免疫法（ELISA）監(jiān)測(cè)飲用牛奶中黃曲霉素M1的檢測(cè)限為0.01μg/kg，基本符合檢測(cè)要求，而且檢測(cè)速度快捷，對(duì)人體危害性小。但酶聯(lián)免疫法（ELISA）的缺點(diǎn)同樣有較多缺點(diǎn)，酶聯(lián)免疫法（ELISA）重復(fù)性差，實(shí)際壽命短，需低溫保存，假陽(yáng)率概率較高，需要配置專門(mén)的酶標(biāo)儀，對(duì)某些含鹽量高，脂肪含量高的樣品需要進(jìn)行額外的適當(dāng)?shù)奶幚怼?/p>

在學(xué)習(xí)了光譜分析，我們想到可以利用吸收光譜和拉曼光譜的原理測(cè)量牛奶中的各種添加劑。在物質(zhì)檢測(cè)中拉曼光譜技術(shù)具有很好的優(yōu)越性：提供快速、簡(jiǎn)單、可重復(fù)、且更重要的是無(wú)損傷的定性定量分析，此外，由于水的拉曼散射很微弱，拉曼光譜是研究水溶液中的生物樣品和化學(xué)化合物的理想工具。

二、工作原理

在光的散射現(xiàn)象中有一特殊效應(yīng)，和x射線散射的康普頓效應(yīng)類似，光的頻率在散射后會(huì)發(fā)生變化，頻率的變化決定于散射物質(zhì)的特性，這就是拉曼效應(yīng)。當(dāng)激光照射到樣品時(shí)，除了會(huì)發(fā)生反射，透射，折射現(xiàn)象外，樣品物質(zhì)還會(huì)產(chǎn)生散射，在散射光中除了與入射光有相同頻率的瑞利光（其波數(shù)基本不變或變化小于10～5cm^-1）以外，在瑞利光的兩側(cè)，有一系列其他頻率的光，其強(qiáng)度通常只為瑞利光的10^-6～10^-9，這種散射光被稱為喇曼光（其波數(shù)變化大于1cm^-1的散射）。其中波長(zhǎng)比瑞利光長(zhǎng)的喇曼光叫斯托克斯線，而波長(zhǎng)比瑞利光短的喇曼光叫反斯托克斯線。在以波數(shù)為變量的拉曼光譜圖上如圖1，斯托克斯線和反斯托克斯線對(duì)稱地分布在瑞利散射線兩側(cè)。在一般的情況下，斯托克斯線總是比反斯托克斯線的強(qiáng)度大很多，這是因?yàn)樵诔貭顟B(tài)下，處于基態(tài)的分子占了絕大多數(shù)。利用上述原理可以測(cè)量牛奶中不易測(cè)量的成分。

根據(jù)有關(guān)測(cè)量黃曲霉素濃度的文獻(xiàn)的報(bào)道，發(fā)現(xiàn)其近紅外光譜有特殊性質(zhì)。將一份新鮮的純牛奶分成若干份，再根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中牛奶應(yīng)該滿足的蛋白含量確定加入黃曲霉素的劑量，使每一份牛奶中都含有不同濃度的黃曲霉素，然后使用美國(guó)ASD公司的Handheld Field spec光譜儀和光譜儀配套的1415V鹵素?zé)暨M(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到黃曲霉素的近紅外光譜反射特性圖。

樣本的可見(jiàn)/近紅外光譜原始反射譜。在900nm～1000nm之間，其余所有曲線基本疊加在一起。而在450hm～850nto之間曲線卻存在一定梯度。反射率隨濃度增加而增大，在光譜中最上端的那條譜線所表示的黃曲霉素的濃度為17.5%，而最下端的譜線所代表的黃曲霉素的濃度為2.5%。由于最下端的曲線對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)說(shuō)已經(jīng)產(chǎn)生了誤差，在那個(gè)濃度范圍我們不予考慮。通過(guò)我們反復(fù)對(duì)光譜進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)可以使用450nm一850nto之間的曲線變化作為判斷黃曲霉素濃度的依據(jù)，但是牛奶中還有一些其他的物質(zhì)會(huì)干擾黃曲霉素濃度的監(jiān)測(cè)，所以我們考慮使用900nm～1000nm之間的曲線變化作為判斷溶液中是否存在黃曲霉素的依據(jù)。根據(jù)以上對(duì)光譜的分析，我們嘗試選取兩個(gè)特征波長(zhǎng)的光：500nm處的光強(qiáng)和1000nm處的光強(qiáng)作為判斷牛奶中黃曲霉素含量的依據(jù)，搭建實(shí)驗(yàn)裝置，進(jìn)行嘗試性實(shí)驗(yàn)。

三、技術(shù)分析

（一）使用拉曼光譜儀測(cè)量水中黃曲霉素的濃度

在測(cè)量黃曲霉素的濃度時(shí)我們首先想到的是利用黃曲霉素的拉曼光譜來(lái)檢測(cè)，具體是利用激光激發(fā)黃曲霉素，使黃曲霉素在產(chǎn)生強(qiáng)烈清晰的拉曼信號(hào)，這個(gè)拉曼響應(yīng)來(lái)自于黃曲霉素分子的對(duì)稱骨架伸縮震動(dòng)且相對(duì)穩(wěn)定存在，可作為黃曲霉素的鑒定峰。利用這種方法可以精確測(cè)量出牛奶中黃曲霉素的含量。但是制作工藝比較復(fù)雜而且制作成本相當(dāng)高，現(xiàn)實(shí)情況無(wú)法為我們提供這樣的大型的昂貴的設(shè)備來(lái)做拉曼光譜檢測(cè)，不符合我們開(kāi)展制作黃曲霉素濃度檢測(cè)儀的初衷。最終我們放棄了使用這種原理來(lái)研制我們的系統(tǒng)。

（二）利用近紅外光譜測(cè)量牛奶中黃曲霉素的濃度

我們?cè)诓粩嗟馗倪M(jìn)自己的實(shí)驗(yàn)儀器，通過(guò)查找文獻(xiàn)我們發(fā)現(xiàn)了黃曲霉素在近紅外反射譜下的光學(xué)特性。將一份新鮮的純牛奶分成若干份，再根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中牛奶應(yīng)該滿足的蛋白含量確定加入黃曲霉素的劑量，使每一份牛奶中都含有不同濃度的黃曲霉素，然后使用美國(guó)ASD公司的Handheld Field Spec光譜儀和光譜儀配套的1415V鹵素?zé)暨M(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

樣本的可見(jiàn)/近紅外光譜原始反射譜。在900nm～1000nm之間，其余所有曲線基本疊加在一起。而在450nm～850nm之間曲線卻存在一定梯度。反射率隨濃度增加而增大，在光譜中最上端的那條譜線所表示的黃曲霉素的濃度為17.5%，而最下端的譜線所代表的黃曲霉素的濃度為2.5%。由于最下端的曲線對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)說(shuō)已經(jīng)產(chǎn)生了誤差，在那個(gè)濃度范圍我們不予考慮。通過(guò)我們反復(fù)對(duì)光譜進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)可以使用450nm一850nm之間的曲線變化作為判斷黃曲霉素濃度的依據(jù)，但是牛奶中還有一些其他的物質(zhì)會(huì)干擾黃曲霉素濃度的監(jiān)測(cè)，所以我們考慮使用900nm一1000nm之間的曲線變化作為判斷溶液中是否存在黃曲霉素的依據(jù)。根據(jù)以上對(duì)光譜的分析，我們嘗試選取兩個(gè)特征波長(zhǎng)的光：500nm處的光強(qiáng)和1000nm處的光強(qiáng)作為判斷牛奶中黃曲霉素含量的依據(jù)，搭建實(shí)驗(yàn)裝置，進(jìn)行嘗試性實(shí)驗(yàn)。

由于牛奶中含有豐富的鹽類和各種蛋白質(zhì)，而這些物質(zhì)對(duì)反射光譜會(huì)產(chǎn)生很大的影響，所以我們利用黃曲霉素近紅外光譜的特性，確定了取反射光中500nm和1000nm兩個(gè)波長(zhǎng)的光進(jìn)行研究。當(dāng)反射光波長(zhǎng)在500nm附近時(shí)反射光光強(qiáng)隨黃曲霉素的濃度增加而增加，這樣可以確定黃曲霉素的濃度，但做不到對(duì)其他物質(zhì)的排除。當(dāng)反射光波長(zhǎng)在1000nm附近時(shí)反射光光強(qiáng)隨黃曲霉素的濃度增加而變化不大，用于排除其他物質(zhì)的干擾。根據(jù)這一光譜特性我們使用寬譜光源照射不同濃度的黃曲霉素，取其中的反射光，將反射光導(dǎo)入光纖中，分成兩組，一組光通過(guò)500nm的濾光片，另一組通過(guò)1000nm的濾光片，然后再將兩束光分別通過(guò)工作波長(zhǎng)為500nm和1000nm的PIN管，將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，之后通過(guò)放大電路的處理，經(jīng)差值運(yùn)算電路，通過(guò)電壓的改變而得出500nm和1000nm兩波段波長(zhǎng)的之間的差值，再將信號(hào)輸入計(jì)算機(jī)中，進(jìn)行處理、顯示，從而看到黃曲霉素的標(biāo)準(zhǔn)濃度，將此時(shí)得到的濃度進(jìn)行記錄作為標(biāo)準(zhǔn)量進(jìn)行定標(biāo)，然后編制程序，將系統(tǒng)放入現(xiàn)場(chǎng)，通過(guò)確定電壓的方法確定黃曲霉素的濃度，通過(guò)查表法得出實(shí)際濃度。實(shí)驗(yàn)裝置示意圖如下圖2。

利用以上的方法不但測(cè)量方便，而且制作工藝也相當(dāng)簡(jiǎn)單，產(chǎn)品投產(chǎn)后生產(chǎn)成本也較為低廉，適合批量生產(chǎn)。

（三）使用紫外光譜測(cè)量牛奶中黃曲霉素的濃度

科技在不斷地創(chuàng)新中前進(jìn)，我們也緊跟時(shí)代步伐，對(duì)自己的產(chǎn)品再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，爭(zhēng)取拿出最好的科技成果。在查閱文獻(xiàn)時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)了黃曲霉素在紫外光源照射下產(chǎn)生的透射譜也很有研究?jī)r(jià)值。我們?cè)O(shè)想使用紫外燈照射含有不同濃度黃曲霉素的牛奶樣品。實(shí)驗(yàn)?zāi)壳罢谶M(jìn)行當(dāng)中，具體的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果還沒(méi)有得到。

（四）實(shí)驗(yàn)結(jié)論

（1）研究結(jié)果的必要性

通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，說(shuō)明了以上我們提出的利用近紅外光譜檢測(cè)黃曲霉素濃度的方法是可行的，同時(shí)也解決了目前市場(chǎng)上對(duì)黃曲霉素濃度檢測(cè)的時(shí)間較長(zhǎng)的問(wèn)題。這個(gè)項(xiàng)目的研究是值得的。

（2）研究中存在的問(wèn)題以及解決方法

在課題研究中我們發(fā)現(xiàn)主要的問(wèn)題是現(xiàn)有的設(shè)備無(wú)法滿足我們開(kāi)展大型實(shí)驗(yàn)的需求，以至于很多實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目我們都無(wú)法進(jìn)行，只能依靠其他的方案來(lái)代替現(xiàn)在的實(shí)驗(yàn)。我們也在克服這些問(wèn)題，有自己的解決方法。大型實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行就將大型試驗(yàn)分成幾個(gè)小塊，分塊進(jìn)行，或者是使用其他的可以替代這個(gè)大型設(shè)備的中小型設(shè)備做實(shí)驗(yàn)。