端粒酶在細(xì)胞永生化中的應(yīng)用

陳小云，張 敏，王 磊，張啟龍，王 棟，蔣桃珍

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

細(xì)胞永生化(cell immortalization)指體外培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)過自發(fā)的或受外界因素的影響從增殖衰老危機(jī)中逃離，從而具有無限增殖能力的過程。自然界中自發(fā)永生化的幾率非常小，嚙齒類動(dòng)物為10－5～10－6，而人類細(xì)胞則小于 10－12［1］。細(xì)胞永生化與端粒(telomere)和端粒酶(telomerase)有密切聯(lián)系。端粒除保持染色體完整性外，還作為細(xì)胞生存期限的關(guān)鍵性調(diào)控因子存在，端粒功能障礙會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖衰竭或凋亡。

端粒酶的催化亞單位端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)在端粒酶的激活中起著關(guān)鍵作用。目前，應(yīng)用端粒酶來延長細(xì)胞的生命期是近年來的研究熱點(diǎn)之一。相對(duì)于病毒、原癌基因等永生化基因，TERT具有許多優(yōu)越性。端粒酶轉(zhuǎn)染建立的永生化細(xì)胞保持了正常細(xì)胞的生理特性，具有正常的生長速率，正常的核型，呈現(xiàn)生長錨著依賴性和接觸生長抑制性，因而是一種非常理想的細(xì)胞來源［1］。

1 端粒和端粒酶

端粒是位于真核細(xì)胞線性染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)，由簡單的DNA串連重復(fù)序列和一系列相關(guān)的蛋白質(zhì)組成，即DNA蛋白復(fù)合物。端粒DNA由若干個(gè)不含功能基因的簡單重復(fù)的非編碼序列構(gòu)成。端粒的兩條DNA鏈長度也不一樣，以人為例，其中具有一條單鏈富含GT，比它的互補(bǔ)鏈富CA單鏈多出50～400個(gè)核苷酸。

端粒酶是一種合成和延伸端粒的核糖核蛋白。正常細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)不到端粒酶活性，因此正常細(xì)胞分裂次數(shù)是有限的，不能無限增殖。但是惡性腫瘤細(xì)胞的增殖并不使端粒區(qū)縮短，因此具有無限增殖的能力，這是因?yàn)榧?xì)胞中端粒酶被激活［2］，它的作用在于補(bǔ)充細(xì)胞分裂中丟失的端粒，維系細(xì)胞穩(wěn)定。

端粒酶由三部分組成:端粒酶RNA(telomerase RNA，TR或TRC)模板、端粒酶相關(guān)蛋白(TPI)和TERT。TERT的表達(dá)水平高低決定端粒酶活性，被認(rèn)為是調(diào)節(jié)端粒酶活性的重要限速步驟之一。TERT在進(jìn)化上相對(duì)保守，幾乎所有物種均含有6個(gè)逆轉(zhuǎn)錄酶元件和1個(gè)端粒酶特異性元件。對(duì)人、雞、猴、大鼠、倉鼠、蟾蜍等6個(gè)不同物種TERT的基因序列比較可以發(fā)現(xiàn)，其功能元件是相對(duì)保守的(圖1)。在原代培養(yǎng)的細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)人端粒酶催化亞基(hTERT)基因能穩(wěn)定端粒的長度，使細(xì)胞易于永生化，因此hTERT的激活是細(xì)胞永生化的重要步驟。

圖1 不同物種的TERT基因比較

2 端粒酶在細(xì)胞永生化中的應(yīng)用

2．1 端粒酶的優(yōu)越性 到目前為止，采用傳統(tǒng)方法已經(jīng)構(gòu)建了許多種永生化細(xì)胞系，但是各種細(xì)胞永生化的方法都有著顯著的局限性。它們往往出現(xiàn)有別于正常細(xì)胞的特征，如細(xì)胞形態(tài)改變、核型改變、具有致瘤性;另外，有些細(xì)胞的生長失去接觸性抑制，成為轉(zhuǎn)化細(xì)胞。而TERT介導(dǎo)的永生化細(xì)胞是正常細(xì)胞，而非轉(zhuǎn)化細(xì)胞。研究表明，它們具有正常生長率、核型，呈現(xiàn)接觸抑制和錨著依賴性，不具有致癌性和軟瓊脂克隆形成能力等［4］。其次，TERT介導(dǎo)的永生化細(xì)胞已通過了M1期和M2期，同生殖干細(xì)胞一樣，是真正意義上的永生化。

hTERT－永生化細(xì)胞兼具原代細(xì)胞的原始特性，以及傳代細(xì)胞系的連續(xù)培養(yǎng)能力。在獲得兩種類型細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，避免了它們的缺陷。表1中，對(duì)常見的四種細(xì)胞類型的特性進(jìn)行了簡要比較。

表1 四種細(xì)胞類型的特征比較

2．2 端粒酶在人類細(xì)胞永生化中的應(yīng)用 1998年，Bodnar等［5］首先將外源性hTERT導(dǎo)入人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和包皮成纖維細(xì)胞獲得成功。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，此類細(xì)胞可持續(xù)增殖，至少達(dá)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞PDs的2～3倍。Wieser等的研究結(jié)果表明，外源表達(dá)hTERT即足以使腎近端小管上皮細(xì)胞永生化，永生化細(xì)胞的各項(xiàng)表型與原代細(xì)胞一致，經(jīng)過連續(xù)90次群體倍增后，轉(zhuǎn)化細(xì)胞依然保持良好的遺傳穩(wěn)定性［6］。美國Clontech與Geron公司合作推出第一種商品化的永生化正常細(xì)胞系hTERTRPE1，其較正常細(xì)胞增殖快，平均每周達(dá)5－6 PDs，其傳代多于150代，其中有3個(gè)克隆多于300代［7］。

全球最大的生物材料資源中心美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)也致力于人類細(xì)胞的hTERT永生化細(xì)胞系的構(gòu)建。目前已構(gòu)建了10余種hTERT永生化細(xì)胞系，并實(shí)現(xiàn)了商品化。同時(shí)，ATCC還發(fā)布了hTERT永生化細(xì)胞系的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，包括TRAP試驗(yàn)檢測(cè)hTERT活性、核型分析、免疫化學(xué)和細(xì)胞特定標(biāo)志的流式細(xì)胞術(shù)等，以保證細(xì)胞質(zhì)量始終處于良好的可控狀態(tài)。

國內(nèi)研究者也在hTERT永生化人類細(xì)胞系方面進(jìn)行了一些研究。如呂麗萍［8］將編碼hTERT的基因轉(zhuǎn)入成人肝細(xì)胞，篩選出了經(jīng) hTERT修飾后的成人肝細(xì)胞，細(xì)胞株可連續(xù)傳代培養(yǎng)。與原代成人肝細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)化細(xì)胞對(duì)HBV的易感性未見明顯改變。

2．3 端粒酶在哺乳動(dòng)物細(xì)胞永生化中的應(yīng)用 來源于靶宿主組織的原代動(dòng)物細(xì)胞，是病毒增殖的最理想工具。盡管極少的原代細(xì)胞可自發(fā)永生化，但是其基因型不穩(wěn)定，甚至與原代細(xì)胞表型存在較大差異。例如有研究者采用SV40病毒，使豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)永生化，但永生化細(xì)胞不支持豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的復(fù)制［9］。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞均不能表達(dá)PRRSV進(jìn)入細(xì)胞的受體 pCD163［10］。這一研究也進(jìn)一步證實(shí)了病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞，可能會(huì)導(dǎo)致原代細(xì)胞表型的改變。

因此，研究者們轉(zhuǎn)而采用表達(dá)hTERT轉(zhuǎn)化的方法，使原代細(xì)胞永生化。如針對(duì)采用病毒永生化PAM 出現(xiàn)的問題，Sagonga等［11］將 hTERT cDNA 轉(zhuǎn)染PAM細(xì)胞，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞能組成型表達(dá)hTERT蛋白，使細(xì)胞永生化。該P(yáng)AM永生化細(xì)胞未影響細(xì)胞表面CD163受體的表達(dá)水平。因此，這一新型細(xì)胞系有利于PRRSV病毒的分離和增殖，并可作為病毒致病性和免疫功能研究的有效工具。

除了PAM外，其它豬的原代細(xì)胞，也有成功采用hTERT獲得永生化的報(bào)道。例如Sabine等采用hTERT基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，獲得了永生化的豬輸卵管上皮細(xì)胞系TERT－OPEC，該細(xì)胞具有端粒酶活性，并與上皮細(xì)胞標(biāo)志物角蛋白具有免疫反應(yīng)［12］。

潘小平等［13］將含hTERT真核表達(dá)的載體轉(zhuǎn)染到原代豬肝細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，獲得耐藥性的豬肝細(xì)胞克隆并傳代3代。原代細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)上清中分泌白蛋白和尿素氮在前3天無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0．05)。此后，有研究者［14］將編碼 pCI－neo－h(huán)TERT真核表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入原代培養(yǎng)的豬小腸上皮細(xì)胞，得到抗G418陽性細(xì)胞群，并傳至80代。

Pamela等［15］發(fā)現(xiàn)對(duì)于驢、普通斑馬和細(xì)紋斑馬等3種馬屬動(dòng)物，僅表達(dá)外源hTERT尚不足以使其原代成纖維細(xì)胞永生化。但是，若同時(shí)表達(dá)hTERT和hTERC，則可檢測(cè)到端粒酶活性以及端粒的延長，并能使3種動(dòng)物的原代成纖維細(xì)胞細(xì)胞永生化。

現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，將hTERT轉(zhuǎn)入牛的體細(xì)胞和胚胎細(xì)胞，能延長其端粒長度，并增強(qiáng)端粒酶活性。對(duì)于牛源原代細(xì)胞，有報(bào)道稱僅轉(zhuǎn)化hTERT，就能使牛毛細(xì)管內(nèi)皮(BCE)細(xì)胞通過衰老期，獲得永生化。令人費(fèi)解的是，盡管轉(zhuǎn)化細(xì)胞可檢測(cè)出很高的端粒酶活性，但這些穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，端粒的長度卻隨著細(xì)胞傳代而逐漸縮短［16］。后來，Wiebke等將hTERC和hTERT表達(dá)質(zhì)粒，分別注射至牛囊胚細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)外源表達(dá)hTERC能增加牛囊胚細(xì)胞的端粒酶活性和端粒長度;而且共表達(dá)hTERT和hTERC組，與單獨(dú)表達(dá)hTERC組相比，端粒的長度沒有增加［17］。以上結(jié)果表明，TERC是牛囊胚細(xì)胞端粒酶活性的限速因素之一。

對(duì)于山羊的原代細(xì)胞，國內(nèi)也有一些成功的報(bào)道。例如楊艷將hTERT基因?qū)肷窖蚵殉查g質(zhì)原代細(xì)胞，建立了永生化山羊卵巢間質(zhì)細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染細(xì)胞系無致瘤性轉(zhuǎn)化，同時(shí)保持了正常細(xì)胞的生物學(xué)特性［18］。隨后，趙曉娥等［19］用將 hTERT 基因轉(zhuǎn)染到山羊胎兒成纖維細(xì)胞中，結(jié)果外源性hTERT基因可以延長胎兒成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)的壽命，降低細(xì)胞凋亡率。

此外，在永生化鼠類細(xì)胞方面，目前已有大量成功的報(bào)道。最近，對(duì)于鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞［20］和造骨細(xì)胞［21］等原代細(xì)胞的永生化又取得了成功。

2．4 端粒酶在禽類動(dòng)物細(xì)胞永生化中的應(yīng)用hTERT在永生化禽類原代細(xì)胞方面，很少有成功的報(bào)道。最早的報(bào)道是Georgios等(2005)將hTERT轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，在轉(zhuǎn)染的CEF中檢測(cè)到hTERT表達(dá)，卻沒有檢測(cè)到端粒酶活性或穩(wěn)定的端粒長度，并且轉(zhuǎn)染的CEF與正常CEF經(jīng)歷同樣世代后開始衰老凋亡［22］。

隨后，有研究者對(duì)這一問題進(jìn)行了更深入的研究，他們構(gòu)建了多種chTR的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞。結(jié)果可以檢測(cè)到chTR的表達(dá)，并伴隨著內(nèi)源chTERT的表達(dá)。但是在這些轉(zhuǎn)染的CEF細(xì)胞中端粒酶活性未持續(xù)存在［23］。這一結(jié)果提示，CEF細(xì)胞中可能缺少某些端粒保護(hù)蛋白的支持。

國內(nèi)也有一些相關(guān)的研究報(bào)道。如孫瑩等檢測(cè)了雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)和馬立克氏淋巴瘤細(xì)胞系(MDCC－MSB1)的端粒酶活性，發(fā)現(xiàn)chTERT是端粒酶活性的主要限速步驟之一，也可能是導(dǎo)致馬立克氏病淋巴瘤的重要因素［24］。還有研究人員構(gòu)建了hTERT基因真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染CEF，轉(zhuǎn)染后可觀察到綠色熒光［25］。但是，這一研究在近三年來均未見后續(xù)報(bào)道，因此，不能確定是否會(huì)如上文中Georgios等報(bào)道的那樣，在轉(zhuǎn)染的CEF中檢測(cè)到hTERT表達(dá)，卻沒有檢測(cè)到端粒酶活性或穩(wěn)定的端粒長度。

雖然目前還未見采用hTERT成功永生化CEF的報(bào)道，但是，在雞的羽髓干細(xì)胞卻有成功的先例。徐玉林將hTERT轉(zhuǎn)染羽髓干細(xì)胞獲得穩(wěn)定傳代的細(xì)胞，檢測(cè)到端粒酶的活性。永生化細(xì)胞具有較強(qiáng)的生命活力，并仍然保留正常的生物學(xué)特性［26］。

3 端粒酶在傳代細(xì)胞系中的應(yīng)用

Crea等于2006年首次報(bào)道了hTERT對(duì)永生化細(xì)胞體外培養(yǎng)特性的影響，過量表達(dá)hTERT的永生化中國倉鼠卵巢細(xì)胞系CHO K1在批次培養(yǎng)中的細(xì)胞凋亡明顯減少、活細(xì)胞密度顯著提高、培養(yǎng)時(shí)間明顯延長［27］。這一研究結(jié)果為組成型過量表達(dá)hTERT能有效地改善永生化細(xì)胞的生長特性、提高細(xì)胞培養(yǎng)效率提供了肯定的依據(jù)。

劉紅等研究發(fā)現(xiàn)，hTERT組成型過量表達(dá)可降低Vero細(xì)胞的貼附生長依賴性和對(duì)血清的依賴程度，是有應(yīng)用潛力的改良哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)性狀的技術(shù)途徑［28］。

hTERT－永生化技術(shù)，還可用于細(xì)胞系基因功能研究。例如，有研究者將野生型和間隙連接蛋白基因43(Cx43)缺失型鼠的造骨細(xì)胞系，采用hTERT－永生化后進(jìn)行研究，明確了Cx43在早期分化和礦化階段的作用［29］。

4 問題與展望

從目前的研究結(jié)果來看，細(xì)胞永生化過程中端粒的維持并非全部依賴于端粒酶的激活，約有30%的永生化人細(xì)胞系并不表達(dá)端粒酶。在一段時(shí)期內(nèi)，研究者們一直試圖解釋這部分細(xì)胞在不表達(dá)端粒酶活性的情況下，如何保持甚至是延長端粒的長度，并提出了多種假說。2012年science雜志上發(fā)表了一篇論文，對(duì)此進(jìn)行了解釋，指出10－15%的人類癌細(xì)胞并不表達(dá)端粒酶的活性，而是利用端粒替代延長(ALT)機(jī)制，該機(jī)制不同于通常采用的通過端粒酶延長端粒的機(jī)制［30］。

盡管雞的端粒酶活性重建取得了一定進(jìn)展，但是目前尚未見到利用chTR和chTERT建立雞的永生化細(xì)胞的報(bào)道，有些問題仍有待進(jìn)一步探索和研究。相信隨著研究的不斷深入，鳥類的端粒生物學(xué)將被完整地闡明，將為人類最終闡明衰老和癌癥等疾病的發(fā)生機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

另外，并非所有類型的細(xì)胞都能通過這種方法建立永生化細(xì)胞系，甚至對(duì)于同一種細(xì)胞，不同的研究得到不同的結(jié)果。細(xì)胞永生化雖是目前細(xì)胞生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，但有許多問題尚未解決，如細(xì)胞的衰老機(jī)制、一些細(xì)胞循環(huán)的分子機(jī)理以及對(duì)不同的細(xì)胞采用何種永生方法等方面還有待研究。這些問題的闡明，有利于了解細(xì)胞增殖與衰老的分子機(jī)制，為治療腫瘤、控制腫瘤細(xì)胞增殖以及器官移植奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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