獸用吡喹酮－聚乳酸－羥基乙酸緩釋植入棒含量測定及釋放度考察

馬麗霞，劉 陽，王傳棟，王 勤

(山東省醫(yī)療器械研究所，山東省醫(yī)用高分子材料重點實驗室，濟南 250100)

吡喹酮(Praziquantel)是 Seubert等人［1］于1977年研制成功的廣譜抗蠕蟲藥，對血吸蟲、包蟲、絳蟲等均有殺滅作用。該藥因其療效高、副作用小、安全度高等優(yōu)點［2］，一直是世界上治療多種寄生蟲病的首選藥物。中國獸藥典已收載片劑為臨床治療用藥劑型［3］，但這種劑型由于肝首過效應(yīng)，生物利用度較低。另外，由于治療周期較長，定期給獸類服用，不易操作，且難以落實，尤其是在農(nóng)牧區(qū)。有研究者曾研究了吡喹酮硅膠棒［4］，經(jīng)手術(shù)植入皮下或經(jīng)穿刺導(dǎo)入皮下，解決了片劑的上述缺陷，但硅膠為非降解材料，最終將留存于獸類體內(nèi)，影響畜產(chǎn)品的食用。為了解決藥物殘留問題，保證畜產(chǎn)品的食用安全，研究小組以可生物降解的聚乳酸－羥基乙酸(PLGA)為藥物載體［5］，設(shè)計和研制了一種獸用吡喹酮緩釋植入棒。該植入棒在體內(nèi)可降解吸收，降解產(chǎn)物可參與人體的新陳代謝，最終形成二氧化碳和水被排出體外，體內(nèi)無殘留。目前，吡喹酮－PLGA植入棒含量測定方法及以PLGA為載體的吡喹酮緩釋藥棒的釋放情況未見報道，為了有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，依據(jù)吡喹酮和PLGA的特性，建立了含量測定的HPLC法，并對釋放度進行了考察，為安全用藥提供參考依據(jù)。

1 儀器與試劑

1．1 儀器 Waters高效液相色譜儀:Waters2489檢測器，Waters515泵，Empower Pro工作站，美國waters公司;UV－2501紫外－可見分光光度計:日本Shimadzu公司;電子天平:德國Sartorius公司;超純水機:成都唐氏康寧科技有限公司。

1．2 試劑 PLGA:自制，MW=2．0×104;吡喹酮緩釋植入棒:自制，規(guī)格:15 mg/支，樣品批號為20120911，20120912，20120913;吡喹酮原料藥:浙江海正藥業(yè)，批號為080515;吡喹酮對照品:批號為100046－200504，中國食品藥品檢定研究院;甲醇:色譜純，天津賽弗瑞;三氯甲烷:色譜純，美國JT．Baker公司;超純水:自制。

2 方法與結(jié)果

2．1 溶液配制

2．1．1 對照品溶液 精密稱取吡喹酮對照品適量，以甲醇為溶劑，配制濃度為1000μg/mL的標準貯備液，取標準貯備液適量，稀釋成10、50、100、150、200和500μg/mL等系列濃度的標準溶液，濾過，備用。

2．1．2 供試品溶液 取植入棒1支，切碎，精密稱重，置100 mL量瓶，加三氯甲烷1 mL使完全溶解，甲醇定容，搖勻。經(jīng) 4000 r/min 離心 20 min［6］，取上清液濾過，備用。

2．1．3 輔料溶液 取 PLGA輔料 1支，制備方法同供試品溶液。

2．2 波長選擇 取500μg/mL標準溶液在200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描。結(jié)果如圖1所示。可見吡喹酮在263 nm和272 nm波長處各有一個最大吸收，263 nm較272 nm波長處吸收值大，為減小測試誤差，選擇263 nm為HPLC檢測波長。

圖1 吡喹酮紫外吸收曲線

2．3 色譜條件 色譜柱為Grace C18柱(250 mm×4．6 mm，5 μm);流動相為甲醇 － 水(100 ∶40，V/V);檢測波長263 nm;流速1．0 mL/min;進樣量20 μL。

2．4 專屬性試驗 分別取甲醇溶劑、輔料溶液、150μg/mL標準溶液與供試品溶液，照2．3項下的色譜條件進樣分析，結(jié)果如圖2所示?？梢娺拎獙φ掌泛凸┰嚻吩? min附近出峰，而輔料對吡喹酮的測定無干擾。

圖2 吡喹酮溶液及輔料溶液高效液相色譜圖

2．5 線性關(guān)系考察 分別取2．1．1項下5個系列濃度的標準溶液，照2．3項下的色譜條件進樣測定，以峰面積A與濃度C進行線性回歸，得回歸方程 A=1535．3C+3023．8，r=0．9999(n=5)。結(jié)果表明吡喹酮在10～200μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2．6 精密度試驗 取100、150、200μg/mL標準溶液，照2．3項下的色譜條件，分別連續(xù)測定5次，三種標準溶液峰面積的 RSD值分別為 0．12%、0．16%和0．14%(如表1所示)，表明進樣精密度良好。

表1 精密度試驗結(jié)果

2．7 穩(wěn)定性試驗 取批號為20120911供試品溶液，分別于0、2、4、6、8h 取樣，照 2．3 項下的色譜條件，測定8 h內(nèi)供試品溶液峰面積的RSD值為0．39%(如表2所示)，表明供試品溶液室溫下放置8 h穩(wěn)定性良好。

表2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2．8 定量限試驗 取10μg/mL標準溶液不斷稀釋，取稀釋液，照2．3項下的色譜條件進樣測試，按信噪比S/N=10計算定量限，結(jié)果測得定量限為0．1 μg/mL。

2．9 重復(fù)性試驗 取批號為20120911樣品6支，按2．1．2法制備供試品溶液。照2．3項下的色譜條件進樣測定，外標法計算含量，測得平均含量為98．89%，RSD值為0．44%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2．10 回收率試驗 精密稱取植入棒標示量的80%、100%和120%的原料藥各三份，置100mL量瓶，分別加入1支植入棒所需的輔料，加入1mL三氯甲烷使其完全溶解，甲醇定容。溶液分別經(jīng)4000 r/min離心20min，取上清液濾過，取20μL，注入色譜儀，照2．3項下的色譜條件測定，按外標法計算，結(jié)果如表3所示。平均回收率為99．48%，RSD值為0．53%(n=9)。表明該方法回收率較好，準確度高。

表3 回收率試驗結(jié)果

2．11 含量測定 取批號為20120911，20120912，20120913供試品溶液，照2．3項下的色譜條件測定，按外標法計算。測得批號為 20120911、20120912和 20120913的含量分別為 98．96%、98．67%和 98．81%。

2．12 釋放度考察 取批號為20120911的植入棒6支，分別置入30 mL超純水中［7］，37℃ ±1℃恒溫下于80 r/min的搖床中振搖，24 h更換一次釋放液。取釋放液，濾過，照2．3項下的色譜條件測定，按外標法計算。釋放曲線如圖3所示，可見吡喹酮植入棒使藥物緩慢釋放出來，釋藥期可達21 d，每日釋放量大于300μg，釋放后期出現(xiàn)藥物突釋現(xiàn)象。累積釋放度曲線(圖4)顯示，21 d時累積釋放度達96%。

3 討論

3．1 吡喹酮為疏水藥物，不溶于水，可溶于有機溶劑，而PLGA不溶于甲醇。在吡喹酮－PLGA緩釋植入棒含量測定中選擇用少量三氯甲烷先將植入棒完全溶解，再加甲醇將PLGA沉淀的方法處理樣品。利用甲醇與三氯甲烷互溶性，使吡喹酮提取較完全，回收率高，且測試方法簡單、快捷，輔料無干擾，含量測定準確度高。

圖3 吡喹酮植入棒釋放曲線

圖4 吡喹酮植入棒累積釋放度曲線

3．2 對植入棒釋放度考察，結(jié)果顯示，吡喹酮－PLGA緩釋植入棒可使吡喹酮緩慢釋放，釋藥期達3周，每日釋放量高于300μg，21 d時的累積釋放度為96%，起到了緩釋的效果。以累積釋放度對時間線性回歸得Ritger－Peppas模型擬合方程［8］為:ln y=1．2423ln t+4．0487，r=0．9848(其中 y=Mt/M∞，Mt為t時間的累積釋放量，M∞為∞時間的累積釋放量，Mt/M∞為t時間的累積釋放度)，釋放參數(shù) n=1．2423，n ＞0．89，由此可推測藥物釋放為骨架溶蝕作用機制，即藥物隨著載體的降解被逐漸釋放出來。

從釋放曲線中還可以看出，2周內(nèi)各植入棒之間的測量誤差較小，2周后誤差增大，這應(yīng)為植入棒載體PLGA降解與藥物釋放共同作用所致。2周內(nèi)，PLGA降解較緩慢，藥物隨著PLGA的降解緩慢釋放出來，藥物的釋放，致使植入棒上出現(xiàn)孔洞，并逐漸增多，孔洞的出現(xiàn)，增加了PLGA與水的接觸面積，加速了PLGA的降解。當(dāng)PLGA降解變成碎塊時，出現(xiàn)藥物突釋現(xiàn)象。載體降解與藥物釋放共同作用致使各植入棒PLGA降解變成碎塊的時間不完全一致，因此，出現(xiàn)2周后誤差增大現(xiàn)象。

釋放后期藥物突釋現(xiàn)象可能由載體降解速率與藥物釋放速度不一致所致，還需進一步調(diào)整載體降解與藥物釋放之間的關(guān)系，解決后期突釋問題，完善制劑的制備。

［1］ 馬 驛，劉 毅，曹小明．吡喹酮治療血吸蟲病的研究［J］．湖南畜牧獸醫(yī)，2001，(1):4 －5．

［2］ 樂文菊，尤紀青，梅靜艷．吡喹酮預(yù)防動物日本血吸蟲病的作用［J］．中國藥理學(xué)報，1985，6(3):186 －188．

［3］ 中國獸藥委員會．中華人民共和國獸藥典2010年版［S］．

［4］ 焦 偉，柴君杰，吳樹春，等．皮下埋植吡喹酮緩釋劑控制家犬細粒棘球絳蟲感染的實驗研究［J］．中國人獸共患病雜志，1999，9(3):51 －53．

［5］ Gomes A J，F(xiàn)austino A S，Machado A E H，et al．Characterization of PLGA microparticles as a drug carrier for 3－ethoxyearbonyl－2H － berzofuro［3，2－f］－1－benzopyran－2－one ultrastruetral study of cellular uptake and intracellular distribution［J］．Drug Deliv，2006，13(2):447 －454．

［6］ 沈曉盛，于慧娟，蔡友瓊，等．高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中殘留的吡喹酮［J］．色譜，2007，25(6):861 －863．

［7］ 蘭 天，卜祥媛，吳慧琴，等．mPEG－PLA的合成及吡喹酮聚合物膠束的制備［J］．中南藥學(xué)，2011，9(12):881 －885．

［8］ Ritger P L，Peppas N A．A simple equation for description of solute release．Ⅰ．Fickian and non－Fickian release from nonswellable devices in the form of slabs，spheres，cylinders or discs［J］．JControlled Release，1987，5(1):23 －36．