ELISA試劑盒用于檢測豬尿中賽庚啶殘留的考察

張 鑫，吳劍平，顧 欣，李丹妮，嚴(yán) 鳳

(上海市獸藥飼料檢測所，上海 201103)

賽庚啶(Cyproheptadine，CYP)是一種人用藥，在臨床上用于治療過敏反應(yīng)導(dǎo)致的皮炎等疾病，由于該藥具有可抑制下丘腦的飽覺中樞而刺激食欲的作用［1－2］，可以促進(jìn)動物生長。2010 年，上海市獸藥飼料檢測所首次發(fā)現(xiàn)CYP被一些不法畜牧養(yǎng)殖企業(yè)作為新型養(yǎng)殖促進(jìn)劑非法使用，而CYP在畜產(chǎn)品中的殘留對消費(fèi)者的健康極有危害。2010年底，中國農(nóng)業(yè)部第1519號公告《禁止在飼料和動物飲水中使用的物質(zhì)》明確禁止使用該類藥物作為家畜的生產(chǎn)促進(jìn)劑，2012年，上海市和江蘇省率先開展了地產(chǎn)生豬出欄前CYP監(jiān)測。

動物口服CYP后40%以上由尿液排泄，主要為原形藥物及葡萄糖醛酸結(jié)合的季銨鹽型CYP，不同動物的尿液中代謝物成分含量有所不同?？赏ㄟ^檢測豬尿中的CYP殘留以監(jiān)控其在養(yǎng)殖業(yè)的非法使用。當(dāng)前用作CYP殘留檢測的儀器方法為HPLC 或 LC/MS/MS 法［3－5］，檢測對象為接受 CPY治療的人或動物的血、尿或奶，最低檢測限為0．1μg/L。但其前處理步驟復(fù)雜，成本較高，不適于日常監(jiān)測及大規(guī)模篩查。

ELISA試劑盒可經(jīng)濟(jì)、快速地檢測尿中的藥物殘留，但目前市場上可采購的CYP檢測ELISA試劑盒均未標(biāo)明適合檢測豬尿樣品。進(jìn)口試劑盒(代號分別為A、B、C)在國外用于檢測人或馬用藥后的CYP含量情況，國產(chǎn)試劑盒(D)是由進(jìn)口抗體在國內(nèi)分裝生產(chǎn)，未明確說明適用于豬尿檢測，因此，四種試劑盒用于豬尿的檢測限與標(biāo)示可能不符。試驗通過考察四種試劑盒的反應(yīng)原理、可操作性、靈敏度、檢測限、回收率等，了解國內(nèi)市場上CYP試劑盒的質(zhì)量現(xiàn)狀，探討使用ELISA試劑盒監(jiān)測豬尿中CYP殘留的可行性，給出參考的檢測限。由于國內(nèi)豬尿中CYP殘留檢測工作剛剛起步，檢測標(biāo)準(zhǔn)尚未出臺，因此，本試驗為CYP監(jiān)測工作提供一定的試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 主要儀器及試劑 高速離心機(jī)，型號Sigma 1－14;酶標(biāo)儀，型號BioTek ELX808。CYP試劑盒A、B、C、D，市售購得。CYP標(biāo)準(zhǔn)品，純度98%，購自美國sigma公司。

1．1．2 試料 豬尿20份，采自上海市青浦區(qū)三家豬場。

1．2 試驗方法

1．2．1 試樣的制備 空白樣品 20份豬尿陰性樣品經(jīng)LC/MS/MS法確證為CYP陰性樣品。

空白添加樣品 取陰性豬尿樣品，添加CYP標(biāo)準(zhǔn)品儲備液制成濃度為 0．1、0．5、1．0 和 5．0 μg/L的陽性樣品各6份。

將空白及空白添加的豬尿液8000 r/min離心5 min，并根據(jù)各試劑盒對樣品的要求進(jìn)行稀釋或直接測試。

1．2．2 試劑盒反應(yīng)原理 吸附在孔內(nèi)的抗原和標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中賽庚啶與特異性抗體競爭結(jié)合，與標(biāo)品或樣品中賽庚啶相結(jié)合的抗體被洗滌去除后，孔內(nèi)抗原結(jié)合的抗體與酶標(biāo)記的第二抗體相結(jié)合，酶底物在酶作用下顯色，在450 nm下吸光度的高低與樣品中賽庚啶的含量成反比。

1．2．3 試劑盒操作步驟 四種試劑盒的反應(yīng)原理基本一致，操作步驟及反應(yīng)時間有細(xì)微差異，僅把有區(qū)別的步驟列表如下。試劑盒的反應(yīng)時間通常在75～100 min之間。

表1 四種試劑盒的操作步驟及反應(yīng)時間差異比較

1．2．4 靈敏度、檢測限、準(zhǔn)確度 試劑盒的靈敏度由50%抑制濃度(IC50)體現(xiàn)。測定5次標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出每條標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50。測定20份陰性尿液樣品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出CYP的測定值，計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。檢測限為平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差，計算出豬尿中CYP的檢測限。準(zhǔn)確度以回收率表示。取CYP空白添加豬尿樣本，每個濃度做6次平行檢測，計算豬尿中CYP的平均回收率。

1．2．5 與不同分析方法的比較 參照文獻(xiàn)［4］提供的HPLC/MS/MS法對空白及陽性添加豬尿進(jìn)行檢測，與試劑盒檢測結(jié)果做比較。

2 結(jié)果

2．1 50%抑制濃度(IC50) 四種試劑盒IC50的差異較大，范圍為0．119 ～0．965 μg/L，結(jié)果見表2:

表2 四種試劑盒的IC50 μg/L

2．2 檢測限 20份空白豬尿中CYP的測定均值及試劑盒的檢測限見表3，試劑盒C與標(biāo)示不符。

表3 豬尿中CYP檢測限與定量限 μg/L

2．3 準(zhǔn)確度 豬尿中CYP的四個添加濃度(0．1、0．5、1．0 和 5．0 μg/L)的檢測準(zhǔn)確度見表 4。

表4 CYP陽性質(zhì)控豬尿樣品檢測準(zhǔn)確度 (n=6)

2．4 與儀器方法的比較 LC/MS/MS法檢測CYP濃度為0．1、0．5 和1．0 μg/L 的陽性添加豬尿樣品的結(jié)果與試劑盒測試值的比較見表5。

表5 陽性添加豬尿樣品中CYP的測試值

3 討論

3．1 由于是ELISA半定量試劑盒，定量通常不夠準(zhǔn)確，在CYP添加濃度較低時，其回收率更多反映的是試劑盒本身的抗干擾能力及靈敏度。試劑盒A、B的靈敏度較高，IC50＜0．5μg/L，抗體特異性較好。數(shù)據(jù)顯示，試劑盒A、B、D的檢測限均低于0．5μg/L，可考慮該法的檢測限定為0．5μg/L，同時為排除假陽性，含量在檢測限以上的樣品應(yīng)由LC/MS/MS定性及定量。

試劑盒A、D在檢測CYP添加濃度≥0．5μg/L的樣品時有較穩(wěn)定的回收率。試劑盒B檢測限＜0．5μg/L，但回收率偏高。試劑盒C檢測限及回收率均不能達(dá)到要求，不適于豬尿中賽庚啶的檢測。3．2 研究數(shù)據(jù)顯示，在日常監(jiān)測中使用的大部分市售的ELISA試劑盒可以滿足CYP篩查需要，但仍有以下問題需要注意:

選用試劑盒之前應(yīng)對其性能參數(shù)進(jìn)行全面的考察。例如，實驗得到的檢測限與商品標(biāo)示的檢測限可能并不相符。進(jìn)口試劑盒在國外用于馬、狗、人等用藥后尿液及血液的檢測，其檢測限很可能不適合CYP非法添加飼喂監(jiān)測的需要，需注意甄別。

通過考察了解試劑盒的特點(diǎn)，在批量檢測樣品時為結(jié)果判斷提供依據(jù)。例如，試劑盒A的IC50和檢測限都很低，回收率穩(wěn)定，在較低濃度范圍內(nèi)有較好的線性，試劑盒B檢測限較低，回收率卻偏高，這對定量不利，卻對定性有幫助，試劑盒D的IC50和檢測限都較高，但在較高濃度范圍內(nèi)有較好的線性，因此不同試劑盒之間可以互補(bǔ)，在實際監(jiān)測工作中應(yīng)至少配備兩個品牌以上的試劑盒交替使用。

由于不同物種尿液中CYP及其代謝物的含量不同，本文使用標(biāo)準(zhǔn)品添加實驗對試劑盒進(jìn)行評價有一定局限性，動物實驗得出的結(jié)論可能不同。由于ELISA方法的局限性，仍存在基質(zhì)干擾或假陽性的可能，所以對CYP含量大于0．5μg/L的樣品需進(jìn)行LC/MS/MS法確證實驗。

［1］ Maria Konstandi，Anastasia Dellia － Sfikaki，Denis Varonos．Effect of cyproheptadine hydrochloride on ingestive behaviors［J］．Pharmacological Research，1996，33:1．

［2］ Masahiro Iwaki，Taro Ogiso，Yoshiaki Fujii．Pharmacokinetics of cyproheptadine and itsmetabolites in rats［J］．Bioi．Pharm．Bull．1993，16:12．

［3］ Gustavo Duarte Mendes，AndréArruda，Lu Shi Chen．Quantification of cyproheptadine in human plasma by high－performance liquid chromatography coupled to electrospray tandem mass spectrometry in a bioequivalence study［J］．Biomed．Chromatogr．2012，26:129 －136．

［4］ Cristina A．Fente，Patricia Regal，Beatriz I，et al．Developmentand validation of an LC－MS/MS confirmatory method for residue analysis of cyproheptadine in urine of food－producing animals［J］．J．Agric．Food Chem．2009，57:2595 －2598．

［5］ John E．Koundourellis，Kenneth O．Ebete，Eleftheria T，et al．Liq．isocratic high performance liquid chromatographic method for thequantitation of cyproheptadine in humanmilk and plasma using solvent and solid phase extraction techniques［J］．Chrom．＆ Rel．Technol．1999，22(4):603 －614．