山東省蘋果輪紋病菌對三種三唑類殺菌劑的敏感性檢測

范 昆， 李曉軍， 張 勇， 王 濤， 李 軍， 曲健祿

（山東省果樹研究所，泰安 271000）

蘋果輪紋?。╝pple ring rot）是近年來蘋果生產(chǎn)上危害最為嚴(yán)重的一種病害，不僅可以危害枝干，造成樹勢衰弱、枝干枯死，還能造成大量爛果，發(fā)病嚴(yán)重時田間病果率可高達(dá)70%～80%，且貯藏期可持續(xù)發(fā)?。?－2］。近年來山東省蘋果種植區(qū)輪紋病發(fā)病率呈上升趨勢，給果農(nóng)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

蘋果輪紋病的病原菌為Botryosphaeriadothidea（Moug.ex Fr.）Ces.et de Not.，施用化學(xué)殺菌劑是目前防治蘋果輪紋病的有效措施之一，常用藥劑有多菌靈、甲基硫菌靈等內(nèi)吸性藥劑和代森錳鋅、福美雙等保護(hù)劑。由于生產(chǎn)上使用農(nóng)藥品種較為單一，蘋果輪紋病菌已經(jīng)產(chǎn)生了抗藥性［3－4］。馬志強(qiáng)，楊煒華等［5－6］檢測了蘋果輪紋病菌對多菌靈、甲基硫菌靈的抗藥性，均發(fā)現(xiàn)中低水平抗性菌株。三唑類殺菌劑自1973年被引入后廣泛用于各種病害的防治［7］，其中戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑均已在蘋果樹病害防治中取得良好效果［8］，丙環(huán)唑正在田間推廣應(yīng)用于防治蘋果輪紋病。本研究采用生長速率法，測定了山東省主要蘋果產(chǎn)區(qū)14株蘋果輪紋病菌對3種三唑類殺菌劑的敏感性差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株的采集和分離

2007年8－10月，分別于棲霞、蓬萊、沂源、泰安、陽信等地相距一定距離的果園內(nèi)，隨機(jī)采集輪紋病果，裝入干凈的小塑料袋中（每個袋子只裝一個標(biāo)本），帶回實(shí)驗(yàn)室分離純化獲得14個蘋果輪紋病菌株（Botryosphaeriadothidea）。

1.1.2 供試藥劑

95.8%苯醚甲環(huán)唑（difenoconazole）原藥，青島瀚生生物科技股份公司；96.4%丙環(huán)唑（propiconazole）原藥，青島瀚生生物科技股份公司；98%戊唑醇（tebuconazole）原粉，江蘇常隆化工有限公司。

1.2 方法

1.2.1 含藥培養(yǎng)基的配制

先將戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑原藥溶于丙酮中，配成10 000 mg／L的母液，置4℃冰箱中備用，測定時，根據(jù)培養(yǎng)基的用量，用移液槍吸取一定量的藥劑母液加入溶化并冷卻至50℃左右的培養(yǎng)基中，充分搖勻，配成含戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑系列濃度的含藥培養(yǎng)基。每處理重復(fù)4次，以不加藥劑為對照。

1.2.2 蘋果輪紋病菌對供試藥劑的敏感性測定

在PDA平板上培養(yǎng)（26℃，黑暗）4 d的參試菌株菌落邊緣打出直徑7 mm的菌餅，分別移到含有戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑6個梯度濃度（戊唑醇：1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.032μg／m L；苯醚甲環(huán) 唑：0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 6μg／m L；丙環(huán)唑：0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025μg／m L）的PDA平板上，置26℃暗培養(yǎng)4 d，測定菌落徑向線性生長量，確定藥劑對菌落生長的抑制率。每處理（每菌株每濃度水平）重復(fù)4次。

抑制生長率（%）＝［（對照菌落直徑 －處理菌落直徑）／（對照菌落直徑 －菌餅直徑）］×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均由Microsoft Excel 2003、DPS數(shù)據(jù)處理工作平臺進(jìn)行統(tǒng)計分析。

通過菌絲生長抑制概率值和藥劑濃度對數(shù)值之間的線性回歸分析，求出各藥劑對各供試蘋果輪紋病菌菌株的有效抑制中濃度（EC50值）［9－10］，用 DPS對供試菌株EC50值的離差平方和進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地理來源菌株對3種藥劑的敏感性

蘋果輪紋病菌對3種藥劑的敏感性測定結(jié)果（表1）表明，苯醚甲環(huán)唑?qū)?4個菌株的EC50值在0.011 1～0.125 1μg／mL之間，平均值為（0.059 9±0.010 7）μg／mL，最高值約為最低值的11.27倍；丙環(huán)唑?qū)?4個菌株的EC50值在0.040 8～0.295 5μg／mL之間，平均值為（0.144 3±0.021 4）μg／mL，最高值約為最低值的7.24倍；戊唑醇對14個菌株的EC50值在0.086 8～0.578 3μg／mL之間，平均值為（0.217 2±0.037 7）μg／mL，其中菌株QX02的EC50值最大，TA01的EC50值最小，為最敏感菌株，前者的EC50值是后者的6.66倍。

表1 三種藥劑對蘋果輪紋病菌菌株的EC50值比較1）Table 1 The EC50 values of three fungicides against Botryosphaeria dothidea

續(xù)表1 Table 1（Continued）

采用Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)3種藥劑對14個菌株EC50值的差異顯著性。苯醚甲環(huán)唑?qū)Ω骶甑腅C50值除菌株P(guān)L01與QX01之間無顯著差異外，其他菌株之間均存在極顯著差異；丙環(huán)唑?qū)Ω骶甑腅C50值除菌株TA03與YY02之間無顯著差異外，其他菌株之間均呈極顯著差異；而戊唑醇對所有菌株的EC50值均存在極顯著差異。

2.2 蘋果輪紋病菌對3種藥劑敏感性水平的系統(tǒng)聚類分析

2.2.1 供試菌株對苯醚甲環(huán)唑的敏感性水平

苯醚甲環(huán)唑?qū)┰嚲闑C50值的離差平方和系統(tǒng)聚類分析結(jié)果表明，14個菌株的EC50值由高到低可分為3個聚類組，第1組有5個菌株（YY03、PL02、QX03、TA02、PL03），第2組包括4個菌株（YY02、QX01、PL01、YX02），第3組包括5個菌株（YY01、TA03、QX02、YX01、TA01）。所有聚類組都包括不同的菌株系列，YY、QX系列內(nèi)的3個菌株在3個聚類組中均有出現(xiàn)，PL、TA系列內(nèi)的3個菌株出現(xiàn)在2個聚類組中，含兩個菌株的YX系列分別出現(xiàn)在2個聚類組中（圖1）。說明蘋果輪紋病菌對苯醚甲環(huán)唑離體敏感性的差異和菌株的行政區(qū)域來源沒有明顯相關(guān)性，但同一地區(qū)不同菌株間的敏感性差異較大。

圖1 苯醚甲環(huán)唑?qū)μO果輪紋病菌EC50值的系統(tǒng)聚類分析Fig.1 Cluster analysis of the EC50 values of difenoconazole against B.dothidea

2.2.2 供試菌株對丙環(huán)唑的敏感性水平

統(tǒng)計分析結(jié)果表明，丙環(huán)唑?qū)?4個菌株的EC50值由高到低可分為3個聚類組，第1組僅1個菌株（QX03），第2組包括6個菌株（PL03、QX02、PL02、QX01、YY01、PL01），第3組包括7個菌株（YY03、YX02、TA03、YY02、TA02、TA01、YX01）。其中QX03自成一組，EC50值最大，敏感性水平最低，其他聚類組均包括不同的菌株系列，表明各供試蘋果輪紋病菌對丙環(huán)唑的離體敏感性差異不明顯。

圖2 丙環(huán)唑?qū)μO果輪紋病菌EC50值的系統(tǒng)聚類分析Fig.2 Cluster analysis of the EC50 values of propiconazole against B.dothidea

2.2.3 供試菌株對戊唑醇的敏感性水平

戊唑醇對蘋果輪紋病菌EC50值的離差平方和系統(tǒng)聚類分析結(jié)果表明，14個菌株的EC50值由高到低分為3個聚類組，第1組3個菌株（QX02、YX02、YY02），第2組包括5個菌株（TA03、YY03、QX01、YY01、PL02），第3組包括6個菌株（TA02、YX01、PL03、QX03、PL01、TA01）。3個聚類組均包括不同的菌株系列，QX系列內(nèi)的3個菌株在3個聚類組中均有出現(xiàn)，YY、PL、TA系列內(nèi)的3個菌株出現(xiàn)在2個聚類組中，含兩個菌株的YX系列分別出現(xiàn)在2個聚類組中（圖3）。說明蘋果輪紋病菌對戊唑醇離體敏感性的差異和菌株的行政區(qū)域來源沒有明顯相關(guān)性，但同一地區(qū)不同菌株間的敏感性差異較大。

圖3 戊唑醇對蘋果輪紋病菌EC50值的系統(tǒng)聚類分析Fig.3 Cluster analysis of the EC50 values of tebuconazole against B.dothidea

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果顯示，各供試蘋果輪紋病菌菌株對各藥劑的敏感性均存在不同程度的差異。苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑和戊唑醇對山東省主要蘋果種植區(qū)的14個菌株的EC50值分別在0.011 1～0.125 1μg／mL［平均值（0.059 9±0.010 7）μg／m L］、0.040 8～0.295 5μg／m L［平均值（0.144 3±0.021 4）μg／m L］、0.086 8～0.578 3μg／mL［平均值（0.217 2±0.037 7）μg／m L］之間。菌株YY03對苯醚甲環(huán)唑的敏感性較低，EC50是TA 01菌株EC50的11.27倍；菌株QX03對丙環(huán)唑的敏感性較低，EC50是YX01菌株EC50的7.24倍；菌株QX02對戊唑醇的敏感性較低，EC50是TA01菌株EC50的6.66倍。通過Duncan氏新復(fù)極差法和系統(tǒng)聚類分析結(jié)果表明，供試菌株之間對三唑類殺菌劑的敏感性差異較大。究其原因，其一可能與自然界病原菌本身的生理差異有關(guān)；其二，在蘋果樹生長期，三唑類藥劑還被廣泛應(yīng)用于防治蘋果斑點(diǎn)落葉病、蘋果褐斑病等葉部病害，而各地使用的三唑類殺菌劑的種類和頻率不盡相同，從而導(dǎo)致蘋果輪紋病菌對這3種藥劑的敏感性不同。

利用化學(xué)農(nóng)藥防治植物病害是植物病害綜合防治措施之一，目前山東省各蘋果主產(chǎn)區(qū)防治蘋果輪紋病主要以多菌靈為代表的苯并咪唑類殺菌劑為主，但因其高抗藥風(fēng)險性，病原菌極易產(chǎn)生抗性而使其防效降低［5］。國外對苯并咪唑類殺菌劑引起植物病原菌產(chǎn)生抗藥性的報道很多［4，11－13］，在我國河北保定關(guān)于蘋果輪紋病菌對多菌靈的抗藥性也有相關(guān)報道［5］。三唑類殺菌劑是新一代高效、廣譜、內(nèi)吸、低毒殺菌劑，對谷物、果樹、蔬菜及重要的經(jīng)濟(jì)作物由子囊菌、擔(dān)子菌和半知菌引起的重要病害具有極好的治療和鏟除作用［14］。周增強(qiáng)［15］、蘇平［8］等報道，戊唑醇對蘋果輪紋病防治效果好且使用安全，本研究證明，三唑類殺菌劑對蘋果輪紋病菌的抑制效果較好，表明該類藥劑在蘋果輪紋病防治中具有較大應(yīng)用潛力。

本研究測定了蘋果輪紋病菌在離體條件下對3種三唑類殺菌劑的敏感性水平，發(fā)現(xiàn)大部分菌株處在較高敏感水平，僅菌株TA01對苯醚甲環(huán)唑的敏感性較低，說明蘋果輪紋病菌對三唑類殺菌劑存在一定的抗性風(fēng)險，鑒于此，蘋果輪紋病菌對3種藥劑的抗性風(fēng)險評價正在研究中。建議在推廣中繼續(xù)加強(qiáng)該菌的敏感性監(jiān)測，通過合理使用藥劑，防止或延緩病菌對三唑類殺菌劑產(chǎn)生抗性。

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