綠盲蝽胚胎發(fā)育的顯微及切片觀察

田彩紅， 何 璠， 封洪強(qiáng)， 李國平， 邱 峰

（河南省農(nóng)作物病蟲害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部華北南部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，鄭州 450002）

Bt棉的大面積種植有效控制了棉鈴蟲［Helicoverpa armigera（Hübner）］的發(fā)生為害［1］，棉田廣譜性化學(xué)農(nóng)藥的使用量隨之大幅度減少，而盲蝽種群發(fā)生數(shù)量劇增、為害加重，成為當(dāng)前我國Bt棉上的首要害蟲，并波及其他多種寄主植物。綠盲蝽［Apolygus lucorum （Meyer－Dür）］以滯育卵在棗、葡萄、桃、蘋果、櫻桃等寄主上越冬，滯育行為有效保證了綠盲蝽抵御冬季的不良環(huán)境。越冬代若蟲孵化后刺吸為害果樹的生長點(diǎn)和嫩葉，造成嫩芽畸形等癥狀，為害十分嚴(yán)重。因此，果樹上越冬代綠盲蝽的初孵期就成為其防治的關(guān)鍵時(shí)期。研究綠盲蝽的胚胎發(fā)育及卵滯育發(fā)生的胚胎發(fā)育規(guī)律對(duì)于綠盲蝽的預(yù)測預(yù)報(bào)以及可持續(xù)防控具有重要實(shí)踐意義。目前，對(duì)盲蝽的研究多集中在生物學(xué)特性、寄主適合度、發(fā)生規(guī)律、防控技術(shù)等方面［2－4］，而由于綠盲蝽將卵產(chǎn)于寄主植物的組織中，不便觀察和研究，綠盲蝽的胚胎發(fā)育及滯育卵的胚胎發(fā)育規(guī)律尚不明確。

本文通過對(duì)綠盲蝽不同階段胚胎發(fā)育的顯微照相和石蠟切片制作，觀察了滯育卵和非滯育卵胚胎發(fā)育動(dòng)態(tài)，明確了其滯育卵發(fā)育的階段胚胎發(fā)育特征，并測定了滯育卵和非滯育卵在其發(fā)育進(jìn)程中的卵重變化，以期為早春綠盲蝽滯育卵孵化動(dòng)態(tài)的預(yù)測預(yù)報(bào)提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

綠盲蝽的自然種群采自河南新鄉(xiāng)原陽縣河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地（35°00′N，113°42′E）的 Bt棉田，以綠盲蝽人工飼料在（26±0.5）℃、80%RH 和L∥D＝16h∥8h的試驗(yàn)條件下繼代飼養(yǎng)，建立非滯育種群。滯育卵采用光周期誘導(dǎo)的方式獲得，即從1齡若蟲開始飼養(yǎng)在L∥D＝8h∥16h的光周期下，成蟲所產(chǎn)的卵為滯育卵［5］。在產(chǎn)卵期將鋪有4層濕濾紙的培養(yǎng)皿放入養(yǎng)蟲盒內(nèi)讓其產(chǎn)卵到濾紙上［6］并在（26±0.5）℃孵育。在卵孵育的第0（產(chǎn)卵當(dāng)天）、1、2、3、4、5、6d，用滅菌蒸餾水浸潤濾紙，用彎頭鑷子輕輕將卵剝出放入多聚甲醛固定液中固定，并做好標(biāo)記，供石蠟切片使用。

1.2 不同發(fā)育時(shí)期胚胎的形態(tài)觀察

在載玻片上滴一滴PBS緩沖液，將經(jīng)多聚甲醛固定后的卵展著其上，利用 Motic（moticampro）昆蟲解剖顯微鏡初步觀察并拍照，選擇具有典型特征的非滯育卵和滯育卵［7］，制作石蠟切片。

切片的制作方法由透射電鏡切片的制作方法改良而來［8］，具體為：將固定好的綠盲蝽卵經(jīng)70%、85%、95%、100%、100%乙醇，每級(jí)1h，梯度脫水；將脫水后的材料放入溶化的石蠟（56～58℃）溶液中，置于65℃烘箱中2h，取出換一次石蠟，再置于67℃烘箱中2h，之后取出用石蠟常規(guī)包埋。使用KD－2258－VI型石蠟切片機(jī)（浙江省金華科迪儀器有限公司）切片，切片厚度為5μm。之后貼片。貼片之前將新的蓋片和載玻片放入95%乙醇內(nèi)浸泡10min，蒸餾水沖洗干凈后再放入95%乙醇中浸泡，然后用干凈白布擦拭，手指不要接觸玻面，為增加載玻片的黏附力，在載玻片上涂上一層甘油蛋白后用毛筆輕柔貼片。然后按以下步驟浸潤：二甲苯浸潤2次，每次10min。之后脫蠟：甲苯乙醇混合液（1∶1）浸潤15min，100%乙醇浸潤2次，每次5min，95%乙醇浸潤5min，85%乙醇浸潤5min，70%乙醇浸潤5min，1%番紅37℃恒溫箱中浸潤70min，70%乙醇浸潤2次，每次1min，85%乙醇浸潤2次，每次1min，95%乙醇浸潤2次，每次1min，0.5%固綠浸潤10s，100%乙醇浸潤2次，每次1min，甲苯乙醇混合液（1∶1）浸潤1min，二甲苯浸潤2次，每次1min，中性紅染色5min，乙醇鹽酸分化（70%乙醇＋30%鹽酸），并用中性紅重染色；BA3000i顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）觀察照相，最后用中性樹膠封片。

1.3 卵重的測定

取剛產(chǎn)下的卵100粒，用分析天平準(zhǔn)確稱其重量，稱完后，放進(jìn)溫度為（26±0.5）℃，相對(duì)濕度約80%的恒溫箱中使其繼續(xù)發(fā)育，以后在每天相同時(shí)間點(diǎn)，在每片產(chǎn)卵的濾紙上噴布500μL的蒸餾水，稱重一次，直至孵化為止［9］，各處理重復(fù)3次。數(shù)據(jù)分析利用SPSS13.0進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠盲蝽非滯育卵的胚胎發(fā)育

產(chǎn)卵后第0天：滯育卵表面淺綠色，細(xì)胞均勻排列（圖1a），初產(chǎn)的綠盲蝽非滯育卵為乳白色，細(xì)胞周質(zhì)及細(xì)胞均勻排列（圖1b）。

產(chǎn)卵后第1天：卵經(jīng)過24h的發(fā)育后，在盲蝽滯育卵內(nèi)，細(xì)胞大小不一，沒有胚帶出現(xiàn)（圖1c）。非滯育卵的縱切面，細(xì)胞呈現(xiàn)圓點(diǎn)狀分散于卵中央部分的卵黃內(nèi)，排列整齊，形成一層單細(xì)胞的囊胚層，里面胚帶依稀可見（圖1d）。

產(chǎn)卵后第2天：滯育卵的卵殼對(duì)光的通透性明顯地低于非滯育卵殼的通透性，通過透射光，即使增大顯微鏡的光強(qiáng)，依然看不到滯育卵殼內(nèi)的內(nèi)容物。非滯育卵細(xì)胞層加厚，形成胚帶。但是滯育卵體內(nèi)細(xì)胞呈點(diǎn)狀不規(guī)則分布，并有巨細(xì)胞出現(xiàn)，也可能為冰晶。細(xì)胞在形成單細(xì)胞的囊胚層后，隨著細(xì)胞層的加厚，并沒有形成胚帶（圖1e，圖1f）。

產(chǎn)卵后第3天：胚胎頭部正置于卵的前端，長條形的胚胎已經(jīng)形成（圖2a），腹部細(xì)長，明顯分節(jié)，附肢已形成但尚未分節(jié)（圖2b）。

產(chǎn)卵后第4天：原頭變短，分節(jié)明顯。腹部分節(jié)明顯，中部膨大，端部略窄（圖2c），紅色眼點(diǎn)形成，頭部向外突起（圖2d）。

產(chǎn)卵后第5天：腹部各節(jié)的腹板劃分明顯。卵的整體外形變成彎香蕉型，卵殼發(fā)黑，紅色復(fù)眼清晰可見（圖2e和圖2f）。

圖1 綠盲蝽滯育卵和非滯育卵的胚胎發(fā)育（產(chǎn)卵后0～2d）Fig.1 Diapause and non－diapause egg embryonic development of Apolygus lucorum（0～2days after oviposition）

產(chǎn)卵后第6天：卵的整體變長，卵的顏色變成翠綠色，卵殼和胚體分離，卵的頸部變長拉伸，卵殼破裂（圖2g），若蟲孵出卵蓋延伸變長成漏斗狀（圖2h）。

2.2 滯育卵的發(fā)育停滯期

為進(jìn)一步明確滯育卵的胚胎發(fā)育階段，切片觀察發(fā)現(xiàn)：在產(chǎn)卵后48h滯育卵卵殼較厚，周質(zhì)明確可見，細(xì)胞呈現(xiàn)不規(guī)則狀排列，卵蓋呈馬鞍狀（圖3）。而非滯育卵切片可看到卵表皮層脫離胚盤，合核開始分裂并形成很多子核，胚帶清晰可見，胚胎發(fā)育正在進(jìn)行，進(jìn)入了胚胎伸長階段。

2.3 綠盲蝽發(fā)育過程中滯育卵和非滯育卵卵重的變化

綠盲蝽卵初產(chǎn)出時(shí)較輕，滯育卵每百粒重（2.6±0.66）mg，而非滯育卵每百粒重為（2.33±0.40）mg，兩者重量相似，但是隨著發(fā)育歷期的延長，非滯育卵的重量和滯育卵的重量呈現(xiàn)不同的變化趨勢（圖4）。綠盲蝽非滯育卵從產(chǎn)出到孵出若蟲的過程中，卵重不斷在增加，至孵化時(shí)卵重增加了5倍多，但滯育卵重量基本保持不變（圖4）。

圖2 綠盲蝽非滯育卵的發(fā)育（產(chǎn)卵后3～6d）Fig.2 Non－diapause egg embryonic development of Apolygus lucorum（3～6days after oviposition）

3 討論

越冬是綠盲蝽生活史中重要的組成部分，綠盲蝽以卵滯育的方式越冬，越冬期為每年9月中下旬至翌年4月上旬［10］。本研究通過切片觀察和卵重測量，明確了綠盲蝽滯育卵停滯發(fā)育的時(shí)期。滯育卵在26℃下經(jīng)過24h的胚胎發(fā)育，在形成單細(xì)胞的囊胚層后沒有形成胚帶，而且卵重不再增加，因此，可以確定綠盲蝽卵的滯育是發(fā)生在囊胚后期，即在26℃條件下產(chǎn)卵后第1天。據(jù)此推斷滯育卵越冬后的發(fā)育歷期應(yīng)與非滯育卵歷期相似或略短。因此在測報(bào)實(shí)踐中，可以利用非滯育卵的有效積溫和發(fā)育起點(diǎn)預(yù)測越冬卵的孵化時(shí)間。然而，室內(nèi)低溫解除滯育的試驗(yàn)卻發(fā)現(xiàn)滯育解除后卵的發(fā)育歷期明顯長于非滯育卵［11－15］。這種滯育后發(fā)育歷期的延長可能是由于低溫條件未完全解除滯育所致，也有可能是綠盲蝽滯育卵越冬后存在一個(gè)與非滯育卵不同的胚胎發(fā)育階段。因此，有必要對(duì)綠盲蝽的滯育后發(fā)育進(jìn)行系統(tǒng)研究，以提高該害蟲始發(fā)期預(yù)測的準(zhǔn)確度。

昆蟲的胚胎發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過程，自精子經(jīng)卵孔進(jìn)入卵內(nèi)，形成合核，經(jīng)歷卵裂、胚盤、胚帶、胚層及胚膜的形成，至胚胎的分節(jié)、附肢的生成、體壁形成及背合等過程。目前關(guān)于昆蟲胚胎發(fā)育的研究報(bào)道，大多數(shù)是對(duì)于膜翅目、鱗翅目，直翅目和脈翅目昆蟲胚胎發(fā)育的研究［16－20］，而對(duì)半翅目昆蟲胚胎發(fā)育研究較少。不少學(xué)者根據(jù)胚胎發(fā)育歷期，人為地分為幾個(gè)階段，陳偉等詳細(xì)描述了直翅目越北腹露蝗的胚胎發(fā)育過程，并將其分為10個(gè)階段［21］。早在1966年，劉秀瓊等對(duì)荔枝蝽象的胚胎發(fā)育進(jìn)行了研究，通過石蠟切片法，把胚胎發(fā)育分為囊胚層形成，胚體伸長等13個(gè)階段［9］。在本研究中，我們根據(jù)綠盲蝽卵在26℃下的發(fā)育歷期，逐日描述了綠盲蝽的胚胎發(fā)育過程，為進(jìn)一步研究綠盲蝽卵的滯育后發(fā)育奠定了基礎(chǔ)。

滯育卵由于停止發(fā)育卵重保持恒重，而非滯育卵則由于發(fā)育過程中需要吸收水分卵重穩(wěn)步上升。這與Constant等［22］觀察到的一種盲蝽（Macrolophus caliginosus Wagner）的胚胎發(fā)育過程中鮮重不斷增加的結(jié)果［22］一致。這是由于盲蝽的卵深埋在植物組織內(nèi)，胚胎在發(fā)育過程中不斷從植物組織內(nèi)吸收水分，M.caliginosus卵的干重在孵化過程中沒有變化，但鮮重卻增加了一倍［22］。而在本研究中，綠盲蝽非滯育卵卵重增加了5倍多，因而，環(huán)境濕度成為綠盲蝽卵正常孵化的主要限制因子之一。而滯育卵由于其卵殼較非滯育卵卵殼厚，可能形成了像荔枝蝽象卵一樣的較強(qiáng)的卵內(nèi)環(huán)境保護(hù)機(jī)制［9］，從外界吸收的水分較少，有利于滯育卵度過不良環(huán)境。因此，春季降水比冬季降水對(duì)綠盲種群的影響更大，在測報(bào)實(shí)踐中應(yīng)重點(diǎn)尋找春季降水與發(fā)生期發(fā)生量之間的關(guān)系。

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