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    3種中藥注射液突變選擇窗的測(cè)定

    2013-09-26 07:27:04王國(guó)俊
    重慶醫(yī)學(xué) 2013年6期
    關(guān)鍵詞:平皿喜炎金黃色

    李 虹,葉 云,王國(guó)俊△

    (1.四川省樂(lè)山市人民醫(yī)院藥劑科 614000;2.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科,四川瀘州 646000)

    近年來(lái),細(xì)菌耐藥相關(guān)研究備受關(guān)注,1999年有研究小組提出防突變濃度(mutant prevention concentration,MPC)和突變選擇窗(mutant selection window,MSW)理論[1],MPC是指防止第一步耐藥突變株被選擇性富集擴(kuò)增所需的最低抗菌藥物濃度。最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)與 MPC之間的濃度范圍定義為MSW。MSW相關(guān)理論認(rèn)為:只有藥物濃度在野生型藥物敏感菌的 MIC和 MPC之間即在 MSW內(nèi)時(shí),耐藥突變菌株才被選擇性擴(kuò)增。當(dāng)藥物濃度低于MIC時(shí),由于它可使整個(gè)病原菌群增強(qiáng),沒(méi)有選擇壓力而不會(huì)導(dǎo)致耐藥突變菌株被選擇。當(dāng)藥物濃度高于 MPC時(shí),由于細(xì)菌必須同時(shí)產(chǎn)生兩種或兩種以上耐藥突變才能生長(zhǎng),因此也不會(huì)有耐藥突變菌株被選擇出來(lái)。這一理論為解決抗菌藥物的耐藥問(wèn)題提供了新思路。關(guān)于 MPC和 MSW的研究,目前主要集中在氟諾酮(fluoorquinolone,F(xiàn)Q)類等西藥抗菌藥物對(duì)肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌、大腸埃希菌、沙門(mén)菌、結(jié)核分支桿菌、非結(jié)核分支桿菌等的體外實(shí)驗(yàn)研究[2-4]。雖然大量文獻(xiàn)報(bào)道中藥具有抑菌作用[5-7],但相關(guān)研究主要集中在對(duì)中藥及其制劑的 MIC的測(cè)定[8],對(duì)其 MPC、MSW的研究目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

    本文擬體外測(cè)定3種中藥注射液的MIC、MPC、MSW,探討中藥注射液抑制金黃色葡萄球菌耐藥突變菌株選擇能力,為中藥在抗感染性疾病方面的臨床應(yīng)用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 金黃色葡萄球菌ATCC29213,中國(guó)藥品生物制品檢定所。

    1.1.2 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(杭州天和微生物試劑有限公司,批號(hào):100804);MH瓊脂(杭州天和微生物試劑有限公司,批號(hào):100804)。

    1.1.3 藥物 大蒜素注射液 (徐州萊恩藥業(yè)有限公司,2mL:30mg,批號(hào):1008261);雙黃連粉針(哈藥集團(tuán)中藥二廠,600 mg/支,批號(hào):1003015);喜炎平(江西青峰藥業(yè)有限公司,2 mL:50mg,批號(hào):20101115)。

    1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 CO2培養(yǎng)箱(HH.CP-01,上海一恒科技有限公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 菌液制備 從新鮮過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌平板上挑取多個(gè)菌落接種于含10mL營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管中,并標(biāo)記為管A,置于孵育箱中24h。24h后,拿出管A并采用活菌計(jì)數(shù)法對(duì)管A中金黃色葡萄球菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。將管A搖勻后,取20μL,經(jīng)5次10倍稀釋后,取最后一個(gè)稀釋度的菌液20μL均勻的涂布在血平皿上,同法做4個(gè)平行對(duì)照。并標(biāo)記為1、2、3、4。將4個(gè)血平皿放入37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,長(zhǎng)出菌落后,計(jì)數(shù),并根據(jù)最后的平均結(jié)果推算出原菌液的含菌數(shù)。此時(shí)管A中金黃色葡萄球菌的數(shù)目約為2×1012CFU/mL。將已知菌落數(shù)的管A經(jīng)一系列稀釋后,將菌液稀釋于試管中調(diào)整為6×105CFU/mL,并標(biāo)記為管B,將管A、B置于4℃中冷藏保存。

    1.2.2 MIC的測(cè)定 采用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂2倍稀釋法,分別測(cè)定雙黃連粉針、喜炎平注射劑、大蒜素注射劑3種中藥注射液對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC,每一濃度設(shè)6個(gè)平行對(duì)照。陰性對(duì)照組為未加藥物的培養(yǎng)基。陽(yáng)性對(duì)照組按參考文獻(xiàn)進(jìn)行配制(測(cè)定MIC的陽(yáng)性對(duì)照組的藥物濃度為0.13μg/mL的左氧氟沙星)[9]。倍比遞增藥物濃度,配制含雙黃連粉針、喜炎平注射液、大蒜素注射液的幾個(gè)濃度梯度的MH瓊脂平板。取20μL管B中細(xì)菌均勻涂抹在各含藥平皿上,使MH瓊脂上接種菌量為1.2×104CFU,用L形棒均勻涂布,并繞壁2圈。每個(gè)濃度6個(gè)平皿,根據(jù)CLSI 2005年標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀結(jié)果。37℃培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果,以平板上無(wú)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度定為MIC。

    1.2.3 MPC的測(cè)定 采用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂2倍稀釋法分別測(cè)定雙黃連粉針、喜炎平注射劑、大蒜素注射劑3種中藥注射液對(duì)金黃色葡萄球菌的MPC,每一濃度設(shè)6個(gè)平行對(duì)照。陰性對(duì)照組為未加藥物的培養(yǎng)基。陽(yáng)性對(duì)照組按參考文獻(xiàn)進(jìn)行配制(測(cè)定MPC的陽(yáng)性對(duì)照組的藥物濃度為1.3μg/mL左氧氟沙星)[9]。以MIC為基準(zhǔn),倍比遞增藥物濃度,制備幾個(gè)濃度梯度的含不同藥物濃度的MH瓊脂平皿。取20μL管A菌液均勻涂抹在各含藥平皿上,并繞壁2圈,每個(gè)藥物濃度用6個(gè)平皿,使每個(gè)藥物濃度平皿的細(xì)菌總接種量為1.2×1010CFU。并置于培養(yǎng)箱中37℃孵育,24、48、72h后觀察各平皿中金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)情況,孵育72h后仍無(wú)細(xì)菌菌落生長(zhǎng)的最低藥物濃度為暫定MPC(MPCpr),再以 MPC(MPCpr)為基準(zhǔn)線性增減20%,重復(fù)MPCpr的測(cè)定步驟,每濃度作6個(gè)平皿,以平皿中不出現(xiàn)菌落生長(zhǎng)的最低藥物濃度即為MPC。對(duì)接近MPC藥物濃度篩選出來(lái)菌株接種無(wú)藥物的瓊脂平板上,傳代2次后再接種于原篩選藥物濃度的平板上,以確保其是耐藥突變株。

    1.2.3 MSW和SI的計(jì)算 藥物MIC和MPC之間的范圍即為MSW。藥物的MPC與MIC的比值(MPC/MIC)即為藥物選擇指數(shù)SI。

    2 結(jié) 果

    2.1 MIC的測(cè)定 結(jié)果表明:雙黃連粉針的MIC為1.905 mg/mL,喜炎平注射劑的 MIC>1.000mg/mL,大蒜素注射劑的MIC為5.960×10-3mg/mL。見(jiàn)表1。

    表1 3種中藥注射液對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC(n=6)

    2.2 MPC的測(cè)定 結(jié)果表明:雙黃連粉針MPC為14.737 mg/mL;喜炎平注射劑的 MPC>15.385mg/mL;大蒜素注射劑MPC為3.850×10-2mg/mL。見(jiàn)表2。

    表2 3種中藥注射液對(duì)金黃色葡萄球菌的MPC(n=6)

    續(xù)表2 3種中藥注射液對(duì)金黃色葡萄球菌的MPC(n=6)

    2.3 3種中藥注射液的MSW及SI 結(jié)果表明:雙黃連粉針和大蒜素注射劑的SI值相差不是特別大,并且兩種中藥制劑的SI都小于左氧氟沙星,從小到大依次為:大蒜素注射液小于雙黃連粉針小于左氧氟沙星。見(jiàn)表3。

    表3 3種中藥注射液的MSW及SI

    3 討 論

    隨著加入的喜炎平注射液越多,瓊脂板變得越來(lái)越柔軟,在接種細(xì)菌時(shí)很容易使其破裂,所以未制作含更大濃度的喜炎平注射液的瓊脂平板進(jìn)行MIC和MPC值的測(cè)定。本研究表明,大蒜素注射液、喜炎平注射液、雙黃連粉針對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC29213均有不同作用的抑制作用,其抑菌能力為大蒜素注射液大于雙黃連粉針大于喜炎平注射液。李朝霞等[10]測(cè)定了6種不同抗菌藥物左氧氟沙星、阿奇霉素、利福平、萬(wàn)古霉素、妥布霉素、氯霉素對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC29213的MIC、MPC和 MSW。它們的 MIC分別為0.125、1.0、0.002、0.5、3.0、0.5μg/mL;MPC分別為1.4、51.2、>1 024、4.8、16、16 μg/mL。這6種抗菌藥物對(duì)金黃色葡萄球菌的MSW差異很大,以利福平的MSW最寬(SI>512 000),氯霉素的 MSW最窄(SI=5.3)。比較而言,以上3種中藥制劑對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC29213的MIC值均明顯高于西藥抗菌藥物,表明其抗菌作用弱于西藥抗菌藥物,但雙黃連粉針及大蒜素注射液對(duì)金黃色葡萄球菌的選擇指數(shù)均較低,且明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組的左氧氟沙星,說(shuō)明上述中藥制劑限制耐藥突變菌株選擇的能力較強(qiáng),提示某些中藥在對(duì)抗細(xì)菌耐藥方面可能發(fā)揮其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。而大蒜素注射液的MIC及MPC值遠(yuǎn)小于雙黃連的MIC及MPC值,提示大蒜素注射液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌能力比較強(qiáng)。大蒜素較強(qiáng)的抑菌作用可能是因?yàn)槠渚哂歇?dú)特的藥理活性——容易透過(guò)磷脂膜和紅細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),從而與一些截留化合物相互作用,實(shí)現(xiàn)其藥理價(jià)值[11]。

    [1]Dong Y,Zhao X,Domagala J,et al.Effect of fluoroquilonone con-centration on selection of resistant mutants of Mycobacterium bovis BCG and staphylococcus aureus[J].Antimicro Agents Chemother,1999,43(7):1756-1760.

    [2]Blondeau JM,Zhao X,Hnasen J,et al.Mutnat Prevention concentrat-ion of fluoorquinolones or clinical isolates of strptococcus pneumo-niae[J].Antimierob Agents Chemother,2001,45(2):433-438.

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    [4]Li X,Marinao N,Rhaal JJ,et al.Quinolone-resistnat haemophilus influenzae:detemrination of mutant seleetion window for ciprofloxacin,garenoxacin,levofloxacin,andmoxifloxacin[J].Antimieorb Agents Chemother,2004,48(11):4460-4462.

    [5]李建志,劉繼紅,楊麗珍,等.11種中草藥抗菌作用實(shí)驗(yàn)研究[J].中醫(yī)藥信息,2009,3(26):82-83.

    [6]王靜,張淑文.中藥逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥的研究進(jìn)展[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2007,1(6):153-155.

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    [8]王育紅,李風(fēng)學(xué),張志清,等.24種中藥水煎劑與免煎顆粒劑對(duì)臨床菌株的體外抑菌作用[J].江蘇中醫(yī)藥,2006,4(27):52-54.

    [9]庚俐莉,江玲,王承敏,等.單藥及聯(lián)合用藥對(duì)金黃色葡萄球菌突變選擇窗的影響[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2007,11(30):864-865.

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