細(xì)菌對噬菌體的抵抗機(jī)制研究進(jìn)展＊

陳燦煌，趙 霞 綜述，譚銀玲 審校

（第三軍醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)教研室，重慶 400038）

噬菌體是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒，專性細(xì)胞內(nèi)寄生，具有嚴(yán)格的宿主特異性。噬菌體可以感染宿主菌并將其裂解；而宿主菌為了對抗噬菌體的感染，也發(fā)展出相應(yīng)的防御機(jī)制，即噬菌體抵抗（bacteriophage resistance）。噬菌體是迄今地球上數(shù)量最多的微生物，其數(shù)目是細(xì)菌的10倍［1］，也可能是最多樣化的微生物。噬菌體通過捕獲細(xì)菌而維持著自然界中微生態(tài)的平衡，因此噬菌體和噬菌體的對抗機(jī)制其實在調(diào)節(jié)微生物種群中起著重要作用。

近來，細(xì)菌對抗菌藥物耐藥性的廣泛傳播引起全世界關(guān)注，人們開始重新考慮利用噬菌體來治療細(xì)菌感染，即噬菌體治療。而噬菌體治療最顯著的一個缺點是不能治療抗噬菌體的細(xì)菌性感染疾病，并且可能會導(dǎo)致耐受噬菌體的菌株出現(xiàn)。不管是自然條件還是人為條件，細(xì)菌對噬菌體的抗性問題都很難解決，因此迫切需要弄清細(xì)菌對噬菌體的抵抗機(jī)制，為今后噬菌體治療的靶點研究及耐受噬菌體細(xì)菌性感染的治療提供可靠的依據(jù)。本文就此對細(xì)菌的抗噬菌體機(jī)制以及噬菌體的反防御策略進(jìn)行綜述。

1 吸附抑制

噬菌體感染的第一步是識別位于細(xì)菌表面的特異性受體。噬菌體面對的不僅是宿主菌數(shù)量龐大類型繁多的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁成分，還有細(xì)菌通過突變產(chǎn)生的各種抗吸附機(jī)制，如噬菌體受體的突變、細(xì)胞外基質(zhì)分泌的調(diào)節(jié)和競爭性抑制物的合成等。

細(xì)菌可以通過改變細(xì)胞表面受體的結(jié)構(gòu)或構(gòu)象來限制噬菌體的吸附。如金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的一種細(xì)胞壁錨定毒性因子——IgG結(jié)合蛋白A，可以掩蓋細(xì)菌表面的噬菌體受體，從而減少噬菌體的吸附數(shù)量；大腸埃希菌的外膜蛋白A（outer membrane protein A，OmpA）是T-偶數(shù)樣噬菌體的受體，能被一種F質(zhì)粒編碼的外膜蛋白TraT包裹和修飾，使噬菌體無法識別。還有一些細(xì)菌通過相變（phase variation）改變細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)，如博德特菌（Bordetella spp.）［2］。百日咳桿菌黏附素自主轉(zhuǎn)運體（pertactin autotransporter，Prn）為博德特菌噬菌體受體，只能在博德特Bvg＋相菌中表達(dá)，不能在Bvg-相菌中表達(dá)，因此博得特菌噬菌體BPP-1感染Bvg＋相菌的效率比感染Bvg-相菌高出百萬倍。盡管Bvg-相博德特菌中不存在噬菌體受體Prn，但BPP-1噬菌體仍然能較小程度地感染Bvg-相博德特菌，提示噬菌體產(chǎn)生了一種不結(jié)合主要受體也能感染細(xì)菌的變體。博得特菌噬菌體噬菌體基因mtd編碼主要趨向性決定蛋白質(zhì)，具有宿主識別的作用；而一些博得特菌噬菌體利用差異性反轉(zhuǎn)錄因子（diversity-generating retroelements，DGRs）介導(dǎo)的模板依賴逆轉(zhuǎn)錄作用在基因mtd的可變區(qū)引入核苷酸替換，引起主要趨向性決定蛋白的末端變異，使其可與不同的細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)相互作用，從而導(dǎo)致噬菌體吸附，最終逆轉(zhuǎn)因細(xì)菌表面受體變異而引起的吸附抑制作用。最近的比較基因組學(xué)研究表明，包括雙歧桿菌在內(nèi)的19種噬菌體均含有DGRs系統(tǒng)，該系統(tǒng)可能在不同環(huán)境中噬菌體與其宿主菌的共進(jìn)化過程中發(fā)揮重要作用。

細(xì)胞外的聚合物不僅有利于細(xì)菌在惡劣的環(huán)境中存活，還能為細(xì)菌在噬菌體和受體間提供一個物理屏障。但是在快速進(jìn)化過程中，一些噬菌體可通過多糖水解酶或裂合酶識別甚至破壞細(xì)胞外多糖聚合物。一些假單胞菌，固氮菌可產(chǎn)生藻酸鹽增加對噬菌體的抵抗；而以假單胞菌為宿主的F116噬菌體能合成一種藻酸鹽裂解酶，能減低細(xì)胞外基質(zhì)的黏滯性，更有利于噬菌體在細(xì)胞外基質(zhì)中擴(kuò)散。大腸埃希菌（E.coli）細(xì)胞表面具有脂多糖O抗原和莢膜多糖K抗原；噬菌體隨著細(xì)菌的多樣性進(jìn)化而進(jìn)化，一些噬菌體能與這些抗原特異性結(jié)合，如莢膜缺陷的菌株對K抗原特異性的噬菌體不敏感。在沙門氏菌噬中也能觀察到同樣的現(xiàn)象：P22噬菌體能識別O抗原。P22噬菌體的尾部具有內(nèi)切糖苷酶活性，能使噬菌體穿過100 nm的O抗原層。E.coliO157：H7的O抗原特異性噬菌體ΦV10具有乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，能對O157抗原進(jìn)行修飾，阻止噬菌體ΦV10和其他相似噬菌體的吸附。流感嗜血桿菌的噬菌體HP1c1同樣面臨宿主菌細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的相變，Lic2A基因編碼的蛋白參與表面脂低聚糖的合成，對Lic2A進(jìn)行修飾能使流感嗜血桿菌發(fā)生相變，阻止HP1c1的吸附。

細(xì)菌可以利用環(huán)境中的小分子特異性結(jié)合到噬菌體的受體上，從而使噬菌體不能與這些受體結(jié)合。如大腸桿菌合成的鐵轉(zhuǎn)運蛋白FhuA［3］，同時也是大腸桿菌噬菌體T1、T5和Φ80進(jìn)入細(xì)菌的通道；抗菌小分子蛋白質(zhì)J25也能利用FhuA作為受體，可與T5噬菌體競爭性結(jié)合FhuA受體。J25是細(xì)菌在養(yǎng)分耗盡時合成的，通過抑制近源菌株的生長來避免噬菌體的感染，在與其他微生物的競爭中發(fā)揮著重要作用。

2 DNA穿入阻滯

超感染排除（Superinfection exclusion，Sie）系統(tǒng)是細(xì)菌阻滯噬菌體DNA穿入細(xì)胞的主要機(jī)制。Sie系統(tǒng)主要涉及細(xì)胞膜蛋白質(zhì)，編碼這些蛋白質(zhì)的基因常常也存在于噬菌體中。因此，除了在噬菌體和宿主菌相互作用中發(fā)揮效應(yīng)外，Sie系統(tǒng)在噬菌體與噬菌體相互作用中也扮演著重要的角色。

目前已經(jīng)鑒別出多種Sie系統(tǒng)，但只有少數(shù)Sie系統(tǒng)的機(jī)制被研究清楚，以革蘭陰性菌中的Sie系統(tǒng)為例。T4噬菌體是眾所周知的裂性噬菌體，其宿主大腸桿菌具有兩種Sie系統(tǒng)，分別由imm基因和sp基因編碼（Imm系統(tǒng)和Sp系統(tǒng)）。這兩種系統(tǒng)能快速地抑制DNA進(jìn)入細(xì)胞，阻止其他與T4噬菌體類似噬菌體的次級感染。盡管Imm系統(tǒng)和Sp系統(tǒng)的功能相似，但各自獨立并具有不同的作用機(jī)制。Imm系統(tǒng)具有兩個僅存在于細(xì)胞膜的特殊跨膜區(qū)域，通過改變DNA注入位點的構(gòu)象來阻止噬菌體DNA進(jìn)入細(xì)菌；Imm系統(tǒng)不能獨自完成對噬菌體的免疫，只有在其他膜蛋白的協(xié)助下才能正常發(fā)揮作用。T4噬菌體的溶菌酶存在于尾部，能在細(xì)胞壁上產(chǎn)生空洞，利于噬菌體DNA進(jìn)入細(xì)胞［4］；Sp系統(tǒng)通過抑制T4噬菌體溶菌酶對肽聚糖的降解活性來防止噬菌體DNA入侵。

目前只有少數(shù)革蘭陽性菌抑制噬菌體DNA注入的機(jī)制為人所知，它們大多數(shù)是用于工業(yè)牛奶發(fā)酵生產(chǎn)的乳酸桿菌。其中最具特征性的DNA注入機(jī)制是在乳酸桿菌噬菌體Tuc2009基因組中發(fā)現(xiàn)的Sie2009系統(tǒng)，之后又在乳酸桿菌其他菌種的噬菌體基因組中發(fā)現(xiàn)了該系統(tǒng)。包括Tuc2009在內(nèi)的大多數(shù)乳酸桿菌噬菌體都屬于P335乳酸桿菌噬菌體，來自這些噬菌體的Sie2009系統(tǒng)能夠抵抗遺傳特異性的936乳酸桿菌噬菌體。936噬菌體在乳酸桿菌特異性噬菌體中處于優(yōu)勢地位。有學(xué)者推測這個Sie系統(tǒng)位于細(xì)胞膜，通過抑制噬菌體DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞而發(fā)揮噬菌體抑制作用。隨后，一種類似于Sie系統(tǒng)的機(jī)制在另一種用于乳品發(fā)酵工業(yè)的細(xì)菌——嗜熱鏈球菌的前噬菌體中被發(fā)現(xiàn)。前噬菌體TP-J34編碼一種耐受142-氨基酸脂蛋白的單信號肽，能阻止噬菌體DNA進(jìn)入細(xì)胞。但是，這一機(jī)制能對進(jìn)入乳酸菌的乳酸噬菌體發(fā)揮抑制作用。

3 降解噬菌體DNA

3.1 限制-修飾（restriction-modification，R-M）系統(tǒng) 幾乎所有細(xì)菌都具有R-M系統(tǒng)，其活性依賴于幾種不同的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)至少可以分Ⅰ～Ⅳ型。R-M系統(tǒng)最主要的功能是防止外來DNA及病毒入侵細(xì)胞［5-6］。細(xì)菌對噬菌體的R-M系統(tǒng)由能降解侵入的噬菌體DNA的限制性內(nèi)切酶和保護(hù)宿主DNA免遭消化的甲基化成分組成。其“經(jīng)典”機(jī)制就是當(dāng)進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)的噬菌體DNA在某些特定位點上未被甲基化（即修飾作用）時，那么它就被宿主的限制性內(nèi)切酶裂解（即限制作用）［7］，這樣噬菌體就不能在細(xì)菌體內(nèi)復(fù)制。

但噬菌體也發(fā)展出多種抗R-M系統(tǒng)的策略，與細(xì)菌進(jìn)行著限制與反限制的多重較量。策略之一即是獲得宿主菌的甲基化酶基因或利用宿主菌的甲基化系統(tǒng)來修飾噬菌體基因組DNA，如λ及其衍生噬菌體編碼的Ral及Lar蛋白可促進(jìn)噬菌體DNA的甲基化修飾；策略之二是通過基因組點突變的積累而造成細(xì)菌核酸內(nèi)切酶識別位點的缺失，如多價葡萄球菌噬菌體的雙鏈DNA上缺失Sau3位點，該位點具5′-GATC-3′識別序列，或阻斷核酸內(nèi)切酶的活性，如T3噬菌體編碼的Ocr蛋白可通過水解S-腺苷蛋氨酸而抑制核酸內(nèi)切酶的作用。其中最令人稱奇的例子是在T4噬菌體中發(fā)現(xiàn)的抗R-M系統(tǒng)。該裂解性噬菌體的基因組中含有稀有堿基羥甲基胞嘧啶（hydroxymethyl cytosine，HMC），而宿主 DNA中的則是胞嘧啶。R-M系統(tǒng)只能識別具有胞嘧啶的特異序列，T4噬菌體DNA的這一特殊修飾使R-M系統(tǒng)無法識別。而在細(xì)菌與噬菌體的共進(jìn)化過程中，一些細(xì)菌已經(jīng)發(fā)展出相對應(yīng)的機(jī)制來破壞這些經(jīng)過修飾的噬菌體DNA，如與R-M系統(tǒng)不同的修飾依賴性系統(tǒng)（modified dependent systems，MDSs），可特異性地降解甲基化或羥甲基化的DNA。目前，僅少數(shù)MDSs酶被認(rèn)知，如肺炎鏈球菌中的DpnI和大腸桿菌中的McrA、McrBC及Mrr。由于HMC殘基的糖基化，T4噬菌體對MDS酶也具有抵抗力。但T4噬菌體仍然能逃避MDSs的作用，因其基因組HMC殘基已被糖基化。而大腸桿菌CT596則發(fā)展出由葡萄糖修飾抑制劑（glucose modified inhibitor，Gmr）GmrS和GmrD兩種前噬菌體蛋白構(gòu)成的二元系統(tǒng)，能識別和裂解DNA中糖基化的HMC，但對未糖基化的DNA無效。而多種T4樣噬菌體能夠編碼一種特異性針對GmrS-GmrD系統(tǒng)的內(nèi)部蛋白（internal protein，IPI），感染時，成熟的IPI伴隨噬菌體基因組進(jìn)入宿主細(xì)胞，與GmrS-GmrD復(fù)合物相互作用并使復(fù)合物失活。一些細(xì)菌能利用單一的融合多肽來對付噬菌體的IPI，以維持其對噬菌體的抵抗作用。

3.2 CRISPR-Cas系統(tǒng) CRISPR-Cas系統(tǒng)是細(xì)菌對付噬菌體的又一武器，研究者已經(jīng)對規(guī)則性集簇間隔短重復(fù)序列（CRISPRs）及其伴侶因（cas）進(jìn)行了詳細(xì)的研究［8］。自1987年首次對CRISPR-Cas系統(tǒng)進(jìn)行描述以來［9］，比較性分析表明，該基因座存在于日益增多的細(xì)菌和古細(xì)菌的全基因組中。這些基因座一般含有21～48bp的正向重復(fù)序列，而這些重復(fù)序列由長度相似的26～72bp的非重復(fù)性間隔子（non-repetitive spacers）隔開，整個基因座的一側(cè)則排列著大量的cas基因，數(shù)量從4個到20個不等。近來研究認(rèn)為，CRISPR-Cas系統(tǒng)是細(xì)菌所特有的獲得性免疫系統(tǒng)，可特異性抵抗外來核酸包括噬菌體基因組和質(zhì)粒的入侵［10］。另有研究表明，CRISPRCas系統(tǒng)可能與銅綠假單胞菌的溶原性依賴的生物膜合成抑制及群集運動性有關(guān)。

當(dāng)嗜熱鏈球菌的噬菌體敏感株被烈性噬菌體感染后，就會產(chǎn)生抗噬菌體的突變菌株。這些突變株在CRISPR基因座的重復(fù)序列-間隔子區(qū)域的5′端獲得了至少一個新的重復(fù)序列-間隔子單位。這個新產(chǎn)生的間隔子（通常在嗜熱鏈球菌中為30bp）與位于噬菌體基因組的所謂前間隔子（proto-spacer）序列完全一致，其分子機(jī)制目前尚不清楚。不同的宿主菌能從相同的噬菌體基因組中獲得各自特異的間隔子序列，惟一的共同特征是在該噬菌體基因組中前間隔子的兩側(cè)分布著一些短的保守核苷酸序列（如NNAGAAW），被稱為前間隔子相關(guān)性基序（proto-spacer-associated motif，PAM）。值得注意的是，不論PAM是位于前間隔子的上游或下游，PAM的序列及位置在CRISPR-Cas系統(tǒng)中是變化的。

關(guān)于CRISPR-Cas系統(tǒng)的作用機(jī)制已有多個假說提出。其中一個假說認(rèn)為，CRISPR-Cas系統(tǒng)能通過細(xì)菌的RNA干擾機(jī)制以RNA為目標(biāo)發(fā)揮作用。另有學(xué)者認(rèn)為，CRISPR-Cas系統(tǒng)也可以針對DNA發(fā)揮作用。幾組研究人員純化了Cas蛋白，發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)可在重復(fù)區(qū)域?qū)RISPR mRNA切成小RNAs片段，且這些小RNA片段可靶向降解剛進(jìn)入細(xì)胞的噬菌體或質(zhì)粒的RNA或DNA。

噬菌體在與細(xì)菌的相互作用中其實也已進(jìn)化出相關(guān)途徑對抗CRISPR-Cas系統(tǒng)的作用，如嗜熱鏈球菌噬菌體可通過前間隔子區(qū)的點突變、缺失或在保守的PAM區(qū)的突變來抵抗CRISPR-Cas系統(tǒng)。細(xì)菌仍然有可能獲得源自噬菌體突變株的新的間隔子序列，從而建立新的噬菌體抵抗?fàn)顟B(tài)。因此事實上，CRISPR-Cas系統(tǒng)與噬菌體的應(yīng)答正好說明了不同微生物種類間動態(tài)的共進(jìn)化關(guān)系，并且被公認(rèn)的是，CRISPR-Cas系統(tǒng)在微生物群落結(jié)構(gòu)的塑造中扮演了重要角色。

4 頓挫感染

細(xì)菌能夠合成各種同源蛋白使噬菌體的發(fā)生頓挫感染。

表1 細(xì)菌中的Abi

與前幾種抗噬菌體系統(tǒng)有所不同，頓挫感染系統(tǒng)（abortive infection，Abi）在噬菌體感染的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄或翻譯等關(guān)鍵步驟發(fā)揮作用，會導(dǎo)致感染細(xì)胞的死亡。對Abi的研究開始于50年前，但是直到現(xiàn)在僅部分了解其在少數(shù)幾種細(xì)菌中的作用方式，大多數(shù)細(xì)菌中的Abi還有待進(jìn)一步鑒定［11-26］，見表1。

除此以外，在細(xì)菌中廣泛存在的毒素-抗毒素系統(tǒng)（toxinantitoxin systems，ToxIN）也與噬菌體的頓挫感染有關(guān)，如黑腐果膠桿菌屬中的ToxIN系統(tǒng)、大腸桿菌中的hok-shok系統(tǒng)及mazeF系統(tǒng)。

5 展 望

細(xì)菌對噬菌體的抗性機(jī)制通常都是在實驗條件下進(jìn)行一次性單一的噬菌體-宿主的研究，而且細(xì)菌的菌株之間往往存在復(fù)雜多重的抗噬菌體屏障。同一個細(xì)菌中還有許多無法估計的各種系統(tǒng)之間的相互協(xié)作，噬菌體群體的共同作用和進(jìn)化效應(yīng)也常常被人們忽略，不同噬菌體之間的相互抵抗也同樣未被人重視。由于自然條件下的抗病毒系統(tǒng)反映出細(xì)菌性病毒顯著的多樣性，也反映出抗病毒系統(tǒng)在維護(hù)自然和人類環(huán)境中噬菌體-宿主平衡的作用，更多的噬菌體屏障還有待發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)在，迫切需要超越以往對噬菌體的認(rèn)識，盡力去了解這些抗病毒效應(yīng)背后的分子機(jī)制，有了對噬菌體的進(jìn)一步認(rèn)識，就能更深入的了解整個生命系統(tǒng)。

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