厄貝沙坦聯(lián)合格列齊特對2型糖尿病大鼠腎功能的保護(hù)作用與機(jī)制

蘭海濤，劉紅，買文麗，劉行海，劉華，鄭倩

（川北醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，南充 637000）

隨著肥胖人群的快速增長，2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者數(shù)量也不斷增加。據(jù)全國糖尿病研究協(xié)作組報(bào)告［1］，我國糖尿病患病人數(shù)已經(jīng)超過9 000萬，潛在患者超過6 000萬，成為世界第一糖尿病大國。在所有糖尿病患者中，90%以上都是T2DM［2］。糖尿病腎病對患者生存質(zhì)量具有顯著影響，也是糖尿病患者主要死亡原因之一［3］，探索糖尿病腎臟功能保護(hù)的治療方案，具有重大的臨床和社會價(jià)值。近年來研究［4，5］表明，腎素－血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）不僅存在于循環(huán)系統(tǒng)中，也存在于局部組織中，腎組織長期RAS活躍，可以引起腎臟微循環(huán)血管的損害，腎臟系膜細(xì)胞纖維化，最終導(dǎo)致腎臟組織結(jié)構(gòu)重塑，造成腎臟功能嚴(yán)重受損。所以，本實(shí)驗(yàn)探索在傳統(tǒng)降血糖藥物格列齊特基礎(chǔ)上，聯(lián)合厄貝沙坦治療糖尿病大鼠，觀察其對模型大鼠腎臟功能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

格列齊特片Ⅱ（天津華津制藥廠）、厄貝沙坦（廣州海瑞藥業(yè)有限公司）、鏈脲佐菌素（STZ，Sigma公司），總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、血肌酐（Cr）、血尿素氮（BUN），鈉泵檢測試劑盒（南京建成生物公司）、血清胰島素（FINS）檢測試劑盒（上海市生物制藥研究所），快速血糖測定儀及芯片（三諾SXT－1型，長沙）、無創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測量分析系統(tǒng)（北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技公司）。每100mL蒸餾水中溶入1.0g格列齊特Ⅱ和0.5g厄貝沙坦。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料

雌性Wistar大鼠，2月齡，清潔級，體質(zhì)量130～160g。普通飼料：6%脂肪、22%蛋白質(zhì)、57%碳水化合物、7%纖維素和8%其他成分。高能飼料（62%常規(guī)飼料、20%蔗糖和18%豬油）。

1.3 動(dòng)物模型建立與分組

參照實(shí)驗(yàn)室傳統(tǒng)方法［6］建立糖尿病大鼠模型：80只實(shí)驗(yàn)大鼠，16只用于正常對照，64只用于復(fù)制T2DM模型。全部實(shí)驗(yàn)大鼠普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，造模大鼠高能飼料飼養(yǎng)4w后一次性腹腔注射STZ 25mg/kg（注射前30min用0.1mol/L枸櫞酸液配成0.25%的終濃度）。高能飼料繼續(xù)飼養(yǎng)4 w后采尾靜脈血測定空腹血糖（FBG）、TC、TG、FINS，計(jì)算胰島素敏感指數(shù)（insulin sensitivity index，ISI）＝-ln（FBG＊FINS）［7］。最后選取 FBG＞7.8mmol/L，同時(shí)伴有ISI降低的48只大鼠作為T2DM模型［8］，其余淘汰。將實(shí)驗(yàn)大鼠分成正常對照組（A1、A2）、模型對照組（B1、B2）、格列齊特治療組（C1、C2）、厄貝沙坦聯(lián)合格列齊特治療組（D1、D2），每小組n＝8，分別用于8w和16w治療及相應(yīng)對照實(shí)驗(yàn)。治療組每日給予格列齊特100mg/kg或者厄貝沙坦50mg/kg＋格列齊特100mg/kg［9，10］，一次性灌胃治療。正常對照組與模型對照組每日給予等量的溶劑灌胃。在治療期間，全部大鼠都用普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別于治療后8w末和16w末（期間死亡2只動(dòng)物）禁食不禁水12h，測尾動(dòng)脈收縮壓（SBP），30mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后從心臟采血提取血清用于生化檢查、FINS檢測，摘取雙側(cè)腎臟，去包膜后用濾紙吸干水分后稱重，將雙腎質(zhì)量（g）與體質(zhì)量（kg）之比（KW/BW）作為腎臟肥大指數(shù)。左側(cè)腎臟-70℃凍存?zhèn)溆?，用于腎皮質(zhì)的分離和鈉泵活性測定。

1.4 指標(biāo)檢測

嚴(yán)格按照試劑盒說明書，血糖儀測定血糖，751分光光度計(jì)測定TG、TC、Cr和BUN，放射免疫分析法測定FINS。提取腎皮質(zhì)，按照鈉泵活性檢測試劑盒要求，測定鈉泵活性。尾動(dòng)脈測壓法：把實(shí)驗(yàn)鼠放入40℃控溫盒5min后，再放入37℃恒溫大鼠固定器中，暴露出實(shí)驗(yàn)鼠的尾巴測量SBP，每個(gè)實(shí)驗(yàn)鼠加溫的時(shí)間相同。每次測血壓時(shí)連續(xù)記錄5個(gè)血壓讀數(shù)，舍去最高和最低值，其他3個(gè)值的平均值作為此次的血壓值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析和t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 厄貝沙坦聯(lián)合格列齊特對T2DM大鼠一般情況的影響

造模結(jié)束時(shí)，模型大鼠出現(xiàn)明顯的糖尿病“三多一少”癥狀，毛發(fā)紊亂，弓背蜷體，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，并且癥狀隨病程逐漸加重。經(jīng)格列齊特或厄貝沙坦聯(lián)合格列齊特治療8w后，上述癥狀體征明顯好轉(zhuǎn)，治療16w后，情況更進(jìn)一步好轉(zhuǎn)。

2.2 厄貝沙坦聯(lián)合格列齊特對T2DM大鼠血脂、血糖和SBP的影響

與同期正常對照組比較，糖尿病模型對照組大鼠8w和16w時(shí)，TC、TG、FBG和SBP均顯著升高（P＜0.01）；格列齊特治療組8w和16w時(shí)，TC、TG和SBP均顯著升高（P＜0.01），F(xiàn)BG差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；厄貝沙坦聯(lián)合格列齊特治療8w和16w后，大鼠TC和TG仍顯著升高（P＜0.01），但FBG和SBP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型對照組比較，格列齊特治療組8w和16w時(shí)，大鼠TC、TG和FBG水平顯著降低（P＜0.01），SBP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；厄貝沙坦聯(lián)合格列齊特治療8w和16w后，大鼠TC、TG、FBG和SBP水平顯著降低（P＜0.01）。與格列齊特治療組比較，聯(lián)合治療組SBP顯著下降（P＜0.01），TC、TG和FBG差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。聯(lián)合治療組8w與16w大鼠比較，TC、TG、FBG和SBP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見表1）。

表1 厄貝沙坦聯(lián)合格列齊特對T2DM大鼠血脂、血糖和SBP的影響（±s）

表1 厄貝沙坦聯(lián)合格列齊特對T2DM大鼠血脂、血糖和SBP的影響（±s）

aP＜0.01，與同期A組比較；b P＜0.01，與同期B組比較；c P＜0.01，與同期C組比較

組別 n TG/mmol·L－1 TC/mmol·L－1 FBG/mmol·L－1 SBP/mmHg A18 0.82±0.24 1.96±0.35 4.82±0.47 125.15± 9.26 A2 8 0.94±0.26 2.12±0.41 5.56±0.59 126.42± 9.31 B1 8 2.61±0.46a 3.55±0.87a 16.28±2.33a 136.35±11.82a B2 6 2.23±0.40a 3.28±0.62a 15.25±2.16a 145.10±12.68a C1 8 1.48±0.32ab 2.83±0.44ab 5.21±0.47b 133.52±10.26a C2 8 1.26±0.25ab 2.56±0.33ab 5.40±0.49b 143.01±11.75a D1 8 1.54±0.35ab 2.66±0.45ab 5.06±0.54b 121.03±11.47bc D2 8 1.24±0.28ab 2.45±0.36ab 5.21±0.48b 120.24±10.45bc

2.3 厄貝沙坦聯(lián)合格列齊特對T2DM大鼠FINS、ISI、Cr、BUN和KW/BW和腎皮質(zhì)鈉泵活性的影響

與同期正常對照組比較，模型對照組大鼠8w和16w時(shí)，F(xiàn)INS、Cr、BUN顯著升高，腎皮質(zhì)鈉泵活性和ISI顯著降低；模型對照組大鼠16w時(shí)，KW/BW也顯著升高（P＜0.01）。與模型對照組比較，格列齊特治療組8w和16w時(shí)，大鼠FINS、Cr和BUN顯著降低，ISI和腎皮質(zhì)鈉泵活性顯著降低升高（P＜0.01），16w時(shí)KW/BW也顯著升高（P＜0.01）；厄貝沙坦聯(lián)合格列齊特治療8w和16w時(shí)，大鼠FINS、Cr和BUN顯著降低，ISI和腎皮質(zhì)鈉泵活性顯著升高（P＜0.01），16w時(shí)KW/BW也顯著升高（P＜0.01）。與格列齊特治療組比較，聯(lián)合治療組Cr和BUN顯著降低，ISI和腎皮質(zhì)鈉泵活性顯著升高（P＜0.01），16w時(shí)KW/BW也顯著升高（P＜0.01）。聯(lián)合治療組8w與16w大鼠比較，16 w時(shí)BUN顯著降低（P＜0.01），其余指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見表2）。

表2 厄貝沙坦聯(lián)合格列齊特治療對T2DM大鼠FINS、ISI、Cr、BUN、KW/BW和腎皮質(zhì)鈉泵活性的影響（±s）

表2 厄貝沙坦聯(lián)合格列齊特治療對T2DM大鼠FINS、ISI、Cr、BUN、KW/BW和腎皮質(zhì)鈉泵活性的影響（±s）

aP＜0.01，與同期A組比較；b P＜0.01，與同期B組比較；c P＜0.01，與同期C組比較；d P＜0.01，與D1組比較

組別 n FINS/mIU·L ISI Cr/μmol·L－1 BUN/mmol·L－1 KW/BW 鈉泵活性/pmol·mm－1·h－1 A1 8 16.43±3.55 -4.15±0.33 60.22±6.21 5.68±0.49 6.06±0.24 1746±122 A2 8 17.68±4.72 -4.38±0.34 63.15±6.48 5.87±0.54 6.04±0.25 1783±135 B1 8 22.24±5.86a -5.18±0.46a 72.17±7.44a21.51±4.83a 6.21±0.38 1575±196a B2 6 24.37±5.66a -6.14±0.55a 86.39±9.72a32.11±5.82a 8.63±0.45a 1281±112a C1 8 19.42±5.58b -4.71±0.29b 69.22±6.34b 18.41±3.87ab 6.15±0.26 1630±129b C2 8 19.87±5.31b -4.46±0.37b 77.86±7.19b 13.73±2.05ab 7.83±0.41b 1451±116b D1 8 17.39±5.48b -4.28±0.31bc 62.91±6.55bc 15.36±3.79abc 6.12±0.30 1801±140b D2 8 17.27±5.13b -4.06±0.32bc 65.38±7.06bc 9.45±1.28abcd 7.35±0.44bc 1776±127bc

3 討論

實(shí)驗(yàn)復(fù)制的T2DM大鼠具有中度高血糖、高血脂，F(xiàn)INS不低但I(xiàn)SI顯著下降的特點(diǎn)，同時(shí)還具有多飲、多食、多尿和精神活動(dòng)下降的癥狀，這與人類T2DM的癥狀和體征十分類似。T2DM模型大鼠經(jīng)過厄貝沙坦聯(lián)合格列齊特治療8w和16w后，血糖血脂、Cr、BUN和FINS顯著降低，ISI和腎皮質(zhì)鈉泵活性顯著升高，糖尿病“三多一少”的癥狀也得到不同程度改善，表明厄貝沙坦聯(lián)合格列齊特對T2DM模型大鼠具有顯著的治療作用。

格列齊特主要作用于胰島B細(xì)胞，可恢復(fù)胰島素生理性分泌模式，提高血中胰島素水平，同時(shí)抑制肝糖原分解，并促進(jìn)肌肉組織利用葡萄糖，從而降低血糖［11］。

有研究［12］證實(shí)，格列齊特可升高血清脂聯(lián)素，降低白介素-6、腫瘤壞死因子，從而減輕血管的炎癥破壞，改善內(nèi)皮細(xì)胞和微循環(huán)功能。

研究［13］表明，在高糖狀態(tài)下，腎臟局部RAS異常活躍。厄貝沙坦為血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）受體抑制劑，通過選擇性地阻斷AngⅡ與AT1受體的結(jié)合，抑制血管收縮和醛固酮的釋放，產(chǎn)生降壓作用。近年來研究［14］發(fā)現(xiàn)，RAS不僅存在于循環(huán)系統(tǒng)中，也存在于局部組織中，機(jī)體幾乎所有組織器官，如心臟、血管、腦、腎臟、肺臟、肝臟、腎上腺、卵巢、睪丸和脂肪等組織都已證實(shí)存在RAS，其在局部組織中的作用甚至超過循環(huán)系統(tǒng)中的RAS。長期血管緊張素生成增高，不僅會導(dǎo)致血壓升高，還能引起組織結(jié)構(gòu)重塑，造成心、腦、腎、眼等器官的損害。對循環(huán)系統(tǒng)中RAS正常的高血壓患者，抑制血管緊張素作用的藥物也能顯著降低患者的血壓。如果腎臟組織局部RAS過高，可以引起腎臟微循環(huán)血管的損害，腎臟系膜細(xì)胞纖維化，最終導(dǎo)致腎臟組織結(jié)構(gòu)重塑，造成腎臟功能嚴(yán)重受損［15］。厄貝沙坦可以選擇性阻斷AngⅡ與AT1受體結(jié)合，降低皮質(zhì)轉(zhuǎn)化生長因子β1及其Ⅱ型受體mRNA的表達(dá)，抑制細(xì)胞外基質(zhì)積聚，減輕腎臟肥大，延緩糖尿病腎病的發(fā)展［16，17］。

糖尿病患者腎皮質(zhì)鈉泵活性的變化早于腎臟形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變，這種改變可能加重小管與間質(zhì)細(xì)胞的功能和病理損害［18］。研究［19］表明，長期的高血糖，能夠激活腎皮質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），而PKC能使鈉泵磷酸化而降低活性。實(shí)驗(yàn)第8周末，腎皮質(zhì)鈉泵活性顯著降低，同時(shí)Cr和BUN升高，表明腎小管和集合管物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能已經(jīng)受損，但此時(shí)還未發(fā)生器質(zhì)性改變，腎臟未見肥大。16w時(shí)，腎皮質(zhì)鈉泵活性進(jìn)一步降低，Cr和BUN進(jìn)一步升高，腎臟已經(jīng)顯著肥大，表明腎臟已經(jīng)由功能損害轉(zhuǎn)為形態(tài)改變。不管是格列齊特單獨(dú)治療還是厄貝沙坦聯(lián)合格列齊特治療8w和16w后，腎皮質(zhì)鈉泵活性降低的效應(yīng)被顯著抑制，Cr和BUN也明顯下降，但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示聯(lián)合用藥組效果明顯優(yōu)于格列齊特單獨(dú)治療組，其原因可能與厄貝沙坦聯(lián)合格列齊特治療后，糖尿病大鼠血糖血脂水平下降，對腎皮質(zhì)細(xì)胞膜上鈉泵的磷酸化作用減弱導(dǎo)致鈉泵活性升高，同時(shí)厄貝沙坦抑制了腎臟局部和血液中RAS的活性相關(guān)。

綜上所述，厄貝沙坦聯(lián)合格列齊特對T2DM大鼠腎臟功能具有一定的保護(hù)作用，而且其作用優(yōu)于格列齊特單獨(dú)治療，其機(jī)制可能與聯(lián)合用藥可降低糖尿病大鼠血糖水平，減弱PKC對鈉泵的磷酸化，從而穩(wěn)定腎皮質(zhì)鈉泵活性的同時(shí)，厄貝沙坦抑制腎臟局部和血液中RAS的活性有關(guān)。

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