結(jié)直腸癌患者骨髓中survivin基因的檢測(cè)及臨床意義

李揚(yáng)，陳明祥，胡月新

（江蘇省儀征市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，儀征 211400）

結(jié)直腸癌（CRC）是臨床常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，其發(fā)生率僅次于胃癌和食道癌。即使CRC患者病理檢查結(jié)果顯示淋巴結(jié)陰性，但在術(shù)后5年內(nèi)，多數(shù)仍因腫瘤復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等因素使治療以失敗告終，這可能與血液、骨髓和淋巴結(jié)中存在一般方法較難檢測(cè)出的微轉(zhuǎn)移灶有關(guān)［1］。作為凋亡抑制蛋白家族（IAP）的重要成員之一，生存素（survivin）特異性表達(dá)于多數(shù)人的腫瘤組織中，而在正常組織中不表達(dá)，因此可作為一種新型的腫瘤標(biāo)志物［2］。本研究主要探討了survivin mRNA在CRC骨髓中的表達(dá)及其臨床意義，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2008年1月～2010年7月本院收治的經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診的原發(fā)性CRC患者68例，所有患者手術(shù)前均未進(jìn)行過(guò)放、化療，其中男38例，女30例；年齡44～83歲，中位年齡62歲；按照2010年國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期12例，Ⅱ期27例，Ⅲ期27例，Ⅳ期（肝轉(zhuǎn)移）2例；細(xì)胞分化依據(jù)Broders分級(jí)系統(tǒng)。經(jīng)患者知情同意和醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，術(shù)前抽取髂前上棘處約1mL的骨髓液，通過(guò)上海源聚生物科技有限公司提供的淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行有核細(xì)胞分離，生理鹽水洗滌后放入-80℃冰箱保存，待測(cè)。同時(shí)，分別收集同期10例CRC術(shù)后的組織標(biāo)本與10例結(jié)直腸良性疾病患者的骨髓穿刺液作為對(duì)照。

1.2 方法

選用美國(guó)Invitrogen公司生產(chǎn)的Trizol一步法提取細(xì)胞及組織的總RNA，并用無(wú)RNA酶的DNase清除混雜的DNA，最后采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量。具體操作如下：首先取1～2μg總RNA，在70℃條件下預(yù)變性5min后，采用日本Takara公司生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行第1鏈cDNA的合成；其次取4μL cDNA模板進(jìn)行第1輪聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增，并選取0.5μL第1輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行第2輪的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系主要包含2.5μL dNTP mixture（終濃度為250mmol/L）、2.5μL 10×PCR buffer（含 Mg2＋，終濃度為1.5mmol/L）、Takara公司提供的 0.15μL Taq酶、上下游引物各2μL（20pmol）以及滅菌去離子水補(bǔ)足至25μL，引物序列及反應(yīng)條件見(jiàn)表1。此外，抽取5μL的第2輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，并通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

表1 巢式PCR引物序列及反應(yīng)條件

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，應(yīng)用Fisher確切概率法或χ2檢驗(yàn)進(jìn)行率的比較，采用Log-rank檢驗(yàn)或Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRC骨髓中STC-1表達(dá)

68例CRC患者骨髓中，survivin mRNA陽(yáng)性者共20例。10例結(jié)直腸良性疾病患者骨髓survivin mRNA表達(dá)均為陰性，10例CRC術(shù)后組織標(biāo)本的survivin mRNA表達(dá)均為陽(yáng)性。典型的骨髓survivin mRNA表達(dá)見(jiàn)圖1。

2.2 CRC患者臨床病理特征與骨髓survivin表達(dá)的相關(guān)性

在CRC患者骨髓中，survivin mRNA陽(yáng)性表達(dá)與臨床分期（P＝0.016）及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＝0.010）密切相關(guān)，而與性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤浸潤(rùn)深度及分化程度等無(wú)相關(guān)性（見(jiàn)表2）。

圖1 CRC患者骨髓survivin mRNA表達(dá)

表2 CRC患者臨床病理特征與骨髓survivin表達(dá)的相關(guān)性［n（%）］

2.3 骨髓survivin表達(dá)與CRC預(yù)后的關(guān)系

35例患者在術(shù)后2年內(nèi)出現(xiàn)病情進(jìn)展或復(fù)發(fā)，其中CRC骨髓中survivin表達(dá)陽(yáng)性的患者平均2年無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）為18.3個(gè)月（95%CI：17.715～18.964），顯著低于survivin陰性者的21.6個(gè)月（95%CI：21.227～21.789）（P＜0.001）（見(jiàn)圖2）。

3 討論

骨髓是腫瘤細(xì)胞向靶器官轉(zhuǎn)移的第二器官或中繼站，通常在早期階段腫瘤細(xì)胞便可轉(zhuǎn)移至骨髓。有研究［3］表明，骨髓中存在的散播腫瘤細(xì)胞（DTCs）可能是腫瘤發(fā)生局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的根本，因此檢測(cè)骨髓中DTCs對(duì)于腫瘤診斷、分期、治療及預(yù)后判斷均具有十分重要的指導(dǎo)意義。人體的免疫系統(tǒng)可以消除多數(shù)DTCs，使其存活數(shù)量大大減少。反轉(zhuǎn)錄酶－聚合酶鏈鎖反應(yīng)（RT-PCR）因其具有高度敏感性，現(xiàn)已成為臨床上用于檢測(cè)微轉(zhuǎn)移的有效方法［4］。

圖2 骨髓survivin mRNA表達(dá)與CRC預(yù)后的關(guān)系

Survivin作為一種凋亡抑制因子，其作用最強(qiáng)，且主要通過(guò)抑制caspase3及caspase7來(lái)抑制細(xì)胞凋亡，其能有效維持細(xì)胞的有絲分裂，促進(jìn)細(xì)胞增殖及血管形成，從而參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展［2］。Survivin在各種惡性腫瘤組織中的表達(dá)會(huì)增加，因此可作為腫瘤微轉(zhuǎn)移的有效標(biāo)記之一。近年來(lái)的研究［5］表明，在外周血、尿液、胸腹水等人體體液中，survivin的檢測(cè)具有重要臨床意義，并已獲得廣泛認(rèn)可。Hernandez等［6］研究顯示，在正常黏膜－結(jié)腸腺瘤－腺癌中，survivin的表達(dá)依次呈增加趨勢(shì)；其在腺癌中的陽(yáng)性率高達(dá)93%，且與腫瘤的分化程度呈負(fù)相關(guān)。Fang等［7］研究發(fā)現(xiàn)，CRC患者survivin高表達(dá)表明腫瘤肝轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)有所增加，且患者生存期縮短。最近一項(xiàng)薈萃分析［8］表明，腫瘤組織中的survivin表達(dá)可以作為CRC復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的一項(xiàng)重要判斷指標(biāo)。施朕善等［9］研究顯示，survivin mRNA在CRC患者外周血中的陽(yáng)性率為76.7%，其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期相關(guān)，且行根治手術(shù)后survivin mRNA表達(dá)明顯降低；行姑息性化療的患者中，有效組survivin mRNA表達(dá)水平較化療前明顯降低，而無(wú)效組表達(dá)升高，提示survivin mRNA檢測(cè)對(duì)CRC診斷、預(yù)后及化療療效的預(yù)測(cè)均具有一定臨床意義。本研究結(jié)果表明，CRC骨髓中survivin mRNA陽(yáng)性率為29.4%，且與患者臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)survivin mRNA可作為CRC微轉(zhuǎn)移的有效標(biāo)記物。

有研究［10］發(fā)現(xiàn)，作為一項(xiàng)獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)，微轉(zhuǎn)移的價(jià)值甚至優(yōu)于腫瘤TNM分期。截至目前為止，國(guó)內(nèi)關(guān)于CRC微轉(zhuǎn)移方面的研究相對(duì)較少，且多數(shù)均局限于淋巴結(jié)的微轉(zhuǎn)移。因此，本研究為CRC的預(yù)后判斷提供了一種新途徑，對(duì)于骨髓中survivin陽(yáng)性的患者，有必要采取積極的綜合防治措施。

［1］Sirop S，Kanaan M，Korant A，etal.Detection and prognostic impact of micrometastasis in colorectal cancer［J］.Journal of Surgical Oncology，2011，103（6）：534-537.

［2］Cheung CH，Cheng L，Chang KY，etal.Investigations of survivin：the past，present and future［J］.Frontiers in Bioscience：A Journal and Virtual Library，2011，16：952-961.

［3］Riethdorf S，Wikman H，Pantel K.Review：Biological relevance of disseminated tumor cells in cancer patients［J］.International Journal of Cancer，2008，123（9）：1991-2006.

［4］Ring AE，Zabaglo L，Ormerod MG，etal.Detection of circulating epithelial cells in the blood of patients with breast cancer：comparison of three techniques［J］.British Journal of Cancer，2005，92（5）：906-912.

［5］袁昕，殷旭東，薛金俊，等.食管鱗癌放療前后外周血survivin檢測(cè)的臨床意義［J］.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，32（2）：231-235.

［6］Hernandez JM，F(xiàn)arma JM，Coppola D，etal.Expression of the antiapoptotic protein survivin in colon cancer［J］.Clinical Colorectal Cancer，2011，10（3）：188-193.

［7］Fang YJ，Lu ZH，Wang GQ，etal.Elevated expressions of MMP7，TROP2，and survivin are associated with survival，disease recurrence，and liver metastasis of colon cancer［J］.International Journal of Colorectal Disease，2009，24（8）：875-884.

［8］孫國(guó)貴，胡萬(wàn)寧，王雅棣，等.survivin蛋白在結(jié)直腸癌表達(dá)水平及與其臨床關(guān)系的薈萃分析［J］.中華全科醫(yī)學(xué)，2012，10（9）：1343-1346.

［9］施朕善，康馬飛，李文見(jiàn).抗survivin抗體與survivin mRNA在結(jié)直腸癌患者外周血中的表達(dá)及其臨床意義［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2012，41（16）：1575-1578.

［10］Delides A，Maniadakis M，Stathopoulos E.Probabilities ofidentifying a micrometastasis in a cervical lymph node from laryngeal cancer：a stereometric approach［J］.Anticancer Research，2013，33（8）：3213-3216.