種公豬PCV－2感染與繁殖障礙

孫 燕，梁望旺，謝建華，周 瓊，曾 政，熊仲良，米自由＊

（1.重慶市動物疫病預防控制中心，重慶渝北401120；2.重慶璧山縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，重慶璧山402760））

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）是1974年Tischer等在豬腎細胞系（porcine kidney cell line，PK－15）中發(fā)現(xiàn)的一種單鏈環(huán)狀DNA病毒，該病毒以滾環(huán)方式復制，呈20面體對稱，無囊膜，直徑為17nm。PCV有2種基因型（PCV－1和PCV－2），二者的核苷酸同源性為68%。PCV－1無致病性，而PCV－2是引起仔豬多種疾病的病原之一，如斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Post－weaning multisystemic syndrome，PMWS）、豬皮炎－腎病綜合征（Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）、豬呼吸道疾病綜合征（Porcine respiratory disease complex，PRDC）等，現(xiàn)統(tǒng)稱圓環(huán)病毒相關疾?。≒CV－associated disease，PCVAD）。病原學及血清學調(diào)查表明，PCV－2在許多國家都廣泛存在，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。

PCV－2感染一般發(fā)生于母源抗體消失后的斷奶仔豬（7周齡～15周齡），引起臨床或亞臨床疾病。垂直傳播是引起繁育母豬和仔豬感染的重要途徑。本文就感染PCV－2公豬的癥狀及檢測、人工授精精液的病毒污染情況，精液傳播的檢測等幾方面進行了綜述。

1 PCV－2感染公豬的臨床癥狀和眼觀病變

通常，性成熟的公豬感染PCV－2普遍缺乏相關的臨床癥狀與眼觀病變［1］，在自然或試驗條件下感染PCV－2的公豬其精液形態(tài)、活力及精液品質(zhì)也不會受影響［2］。但是，Opriessnig T 等［3］報道了11月齡PCV－2感染陽性豬混合感染了肺炎支原體和多殺性巴氏桿菌的臨床病例。

2 PCV－2感染公豬的檢測

對流產(chǎn)或產(chǎn)弱仔的母豬生殖器官或其拭子及弱仔豬的血清進行PCV－2、PRRSV、PPV、衣原體和鉤端螺旋體等的PCR檢測發(fā)現(xiàn)，雖然60%～70%的繁殖障礙發(fā)生于繼發(fā)感染，而PCV－2檢出率可達14.7%，大多數(shù)為混合感染［4－5］。通過對 PCV－2血清陽性的母豬人工授精輸入PCV－2b感染的精液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，宮內(nèi)暴露仍可使母豬發(fā)生感染，同時由于母體抗體滴度的降低也增加了胎兒感染的幾率［6］。

2.1 精液的病毒檢測

在接種PCV－2后2d～5d的急性感染期，能從血清和精液中檢測到PCV－2DNA。Larochelle R等［7］觀察記錄4頭PCV－2陰性的豬通過鼻內(nèi)接種病毒后精液含病毒的情況，47d的觀察期內(nèi)可間歇性檢測到病毒DNA。Grasland B等［8］對4頭接種病毒的公豬精液樣本連續(xù)監(jiān)測了8周，也得到相同結(jié)論。Madson D M等對12頭長白豬滴鼻和肌肉注射接種病毒，連續(xù)監(jiān)測90d，發(fā)現(xiàn)精液可持續(xù)帶毒。自然感染的公豬一直到27.3周精液中仍零星檢測到PCV－2DNA，病毒DNA含量在接種后9d～20d達到最高，為105.1基因拷貝／mL～106.0基因拷貝／mL。

2.2 血液的病毒檢測

試驗接種的公豬至少持續(xù)90d表現(xiàn)為病毒血癥，且最后一次檢測到無細胞病毒血癥后至少47d仍能從血液中檢測出病毒DNA［1］。這種現(xiàn)象被認為是由于外周血中單核細胞中還有結(jié)合病毒。通常病毒血癥的檢出時間早于精液，但也有報道無病毒血癥者也可能在精液中含有病毒［7］。通常接種2周后可產(chǎn)生PCV－2抗體。有研究發(fā)現(xiàn)，血清或血液的PCV－2PCR檢測結(jié)果與精液的PCR結(jié)果并不完全一致［9］，因而不能以血清或血液樣本檢出PCV－2的DNA來說明精液中也含有PCV－2的DNA。但在急性感染期，二者具有相關性，血清樣品PCR檢測結(jié)果對精液中是否有具PCV－2有可預測性［1］。

2.3 性腺組織的病毒檢測

感染PCV－2的公豬性腺和副性腺含有病毒DNA或抗原。在無臨床癥狀的公豬的尿道球腺、睪丸、附睪、前列腺和精囊，通過免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）和原位雜交技術(shù)（insituhybridization，ISH）均 能 檢 測 到 PCV－2 抗 原 和DNA［3，10］。采用IHC從自然感染公豬的精囊間質(zhì)性巨噬細胞和成纖維細胞樣細胞內(nèi)檢測到豐富的PCV－2抗原［3］。從受感染公豬的尿道球腺，附睪組織比其他副性腺檢測到PCV的幾率更大［2］。實時定量PCR檢測到試驗感染公豬的睪丸、尿道球腺、附睪、前列腺和精囊含有PCV－2DNA，陽性檢測量基本相同［1］。從自然感染的公豬陰莖中也檢測到病毒 DNA［10］。

3 人工授精與PCV－2傳播

3.1 人工授精與豬的繁育

人工授精（artificial insemination，AI）是世界上絕大多數(shù)大型種豬繁育系統(tǒng)采取的標準做法。20世紀90年代初，北美近60%的豬群均采用AI技術(shù)進行繁育，西歐國家豬群AI的比率高達90%以上。雖然AI在養(yǎng)豬生產(chǎn)中能大大加速遺傳改良進程，但從外部（AI中心）引進公豬精液時也可能有疾病傳播，從公豬精液中可檢測到多種病毒，其中就包括PCV－2［11］。

3.2 人工授精與PCV－2的傳播

有研究者對精液作為PCV－2傳播源的風險進行了調(diào)查和評估。對安大略省的25個PCV－2血清學陽性豬場的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，無論使用購買精液或自然交配，都沒有發(fā)現(xiàn)精液與生長豬PMWS的發(fā)病率之間的關聯(lián)。對瑞典和新西蘭PMWS發(fā)病豬群的流行病調(diào)查也發(fā)現(xiàn)，PCV－2不通過精液傳播，疾病的空間分布與公豬精液無關。

為更全面的分析公豬精液是否引發(fā)PMWS，研究人員對法國149個豬場進行了調(diào)查，它們都從同一個供精站購買精液，其中59個發(fā)生PMWS的自繁自養(yǎng)豬場，有55個豬場從來沒有發(fā)生PMWS，35個豬場以前發(fā)生過PMWS已恢復正常，表明購買公豬精液和發(fā)生PMWS沒有相關性。但是，生長豬發(fā)生PMWS的風險與農(nóng)場精液是否帶毒呈正相關［12］。

3.3 精液中病毒DNA檢出情況

公豬精液中是否能檢測到PCV－2DNA主要取決于年齡和品種［13］。表1總結(jié)了不同國家患病PCV－2的精液散播。除年齡和品種之外，如果不進行預防接種，那么任何時候抽檢一個精液站，其中約20%的公豬個體的精液帶毒。

表1 PCV－2的精液散播Table 1 Transmission of PCV－2in boar semen

4 人工授精中的PCV－2傳播

4.1 病毒分離

公豬精液中可能含有多種細菌和病毒，并傳染到繁育母豬。很難采用細胞培養(yǎng)的方式來對PCV－2感染精液進行評估，因為不僅精液對細胞系有毒性，而且PCV－2是非致細胞病變的病毒。然而，Kim J等［14］報道曾成功地從原始精液樣本分離到PCV－2。

4.2 生物測定

Madson D M 等［15］采用腹腔注射 PCV－2a或PCV－2b建立的急性感染3周齡的公豬模型，用于觀測對精液的感染，將攜帶PCV－2a或PCV－2b的精液輸精給PCV－2陰性的母豬，結(jié)果PCV－2不能傳給后備母豬或后代，使用自然感染PCV－2的公豬精液進行AI也不能感染繁育母豬。但在精液稀釋液中加入5mL病毒細胞培養(yǎng)原液（104.2TCID50／mL），則可使陰性母豬發(fā)生繁殖障礙［16］，也可能造成血清學陽性母豬子宮內(nèi)胎兒感染［17］。血清學陽性的母豬表現(xiàn)出病毒血癥的持續(xù)時間短（1周～2周），也沒有明顯的臨床癥狀，娩出非活產(chǎn)仔豬沒有增多，但仔豬表現(xiàn)PCV－2病毒血癥。上述研究表明PCV－2通過AI的傳染性具有劑量依賴性，通過精液也可能造成PCV－2的傳播。

雖然精液稀釋后病毒濃度降低，通過精液傳播的風險減小，但由于種公豬群PCV－2陽性率高而增加了AI傳播的風險，可能導致原來自然交配的繁育場或PCV－2陰性的動物也發(fā)生感染。因此，在動物育種方案中建議對原來為陰性的動物場群以及供精的公豬群精液加以檢測，以降低通過精液傳播的潛在風險。

4.3 精液中PCV－2的檢測

除了病毒分離技術(shù)，更敏感的PCR方法通常用來檢測精液中是否含有病毒DNA。套式PCR［14，18］和實時定量PCR［19］已被證明能用于檢測自然暴露和試驗感染公豬的精液中PCV－2DNA。有研究報道將60份原始精液離心分離成精漿、非精子細胞成分和精子組份，結(jié)果28份精液（46.7%）中檢測到病毒DNA，所有28份精液中精漿都呈陽性，11份非精子細胞成分和4份精子組分中含有病毒DNA［19］。研究人員還用套式PCR檢測了98份精液的PCV－1，PCV－2和PPV，其中26份（26.53%）含有病毒DNA，再對26份陽性精液進行組分分離檢測，結(jié)果26份精漿、9份非精子細胞成分和3份精子組份為病毒DNA陽性［14］。

用實時定量PCR發(fā)現(xiàn)精液細胞組分中較精漿組分中含有更多的病毒DNA［19］。從原始精液中的所有組分中均可檢測出病毒DNA，套式PCR檢測表明精漿中可能含有更大量的DNA。以精液作為檢測樣本，實時定量PCR不僅可以篩查精液是否含有病毒，也可以診斷公豬精液是否傳播病毒。

5 對種豬PCV－2相關疾病的控制

在無可用的商業(yè)PCV－2疫苗之前，主要通過管理措施，包括減少應激、減少混合感染等來預防豬群PCVAD等相關疾病。近年來已有商業(yè)性滅活疫苗，但有關PCV－2疫苗對公豬保護的有效性的評估研究較少。

Erlandson K R等［20］報道，接種疫苗的種公豬比不接種的公豬的ELISA檢測抗體陽性率高，但在84d的試驗期內(nèi)發(fā)現(xiàn)接種對公豬是否表現(xiàn)病毒血癥無影響，公豬在進入精液采集站后的30d，接種疫苗的并未降低精液帶毒率。另有報道［21］對16頭5月齡的長白公豬中的8頭接種了PCV－2疫苗，35d后對所有公豬進行PCV－2感染。結(jié)果接種了疫苗的公豬檢測到病毒血癥，從病毒接種后4、7、14、21d的精液中檢測到病毒DNA。病毒感染后的4d，接種疫苗后的公豬精液中含有較少的病毒DNA，而未接種疫苗的病毒含量較高。通過建立PCV－2和豬肺炎支原體混合感染試驗模型評估了PCV－2疫苗接種公豬的效果研究表明，分別在混合感染模型建立前的35d和21d對PCV－2陰性的成年公豬接種疫苗，收集混合感染后5周內(nèi)的精液和血清樣品，檢測其PCV－2DNA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，混合感染又沒有接種疫苗的公豬精液中病毒DNA含量遠高于單一感染和疫苗接種的公豬［22］。

Blomqvist G等［23］嘗試采用對精液進行梯度離心和浮游的方法對精液中的病毒進行清除，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能去除99%的病毒，且對精液質(zhì)量沒有明顯影響。

由于相關文獻和信息有限，難以對疫苗接種公豬的時間、劑量、接種次數(shù)、疫苗類型以及免疫效果提出有效建議，但試驗研究已經(jīng)表明接種疫苗有助于降低精液的帶毒比率。由于精液采集站和母豬繁育場同樣具有PCV－2傳播風險，因此，推薦在進入精液采集場之前接種疫苗或加強公豬的免疫反應性。

6 問題與展望

雖然在PCV－2引起繁殖障礙的研究中，PCV－2可能通過公豬傳播被大量文獻支撐，但有關PCV－2感染和垂直傳播的確切發(fā)病機制仍知之甚少。Nauwynck H J等［24］對PCV－2的嗜細胞性和進入細胞的過程進行了研究，華利忠等［25］認為PCV－2感染通過胞內(nèi)Ca2＋超載誘導細胞凋亡。劉羽茜［26］的研究發(fā)現(xiàn)，豬源鈣結(jié)合蛋白S100A12能持續(xù)穩(wěn)定地促進 PCV－2在 PK－15細胞中的復制，推 測S100A12可能在PCV－2感染和增殖過程中起著重要作用。李建東等［27］用PCV－2感染40日齡健康長白仔豬后定期對皮膚源DC內(nèi)源性抗原加工遞呈相關分子（LMP7、UBP、MHC－I、calreticulin）mRNA水平的變化進行定量分析，結(jié)果表明，PCV－2在感染早期可抑制豬皮膚源DC內(nèi)源性抗原加工提呈能力。

要切實阻斷精液傳播的路徑，提出切實可行的種公豬免疫方案，包括疫苗接種的時間、劑量及接種次數(shù)等做出具體有效的建議，除了對疫苗的研制進行優(yōu)化外，還需對PCV－2傳播入種豬群在精液中的最小劑量、抑或是輸入到母畜子宮內(nèi)的引起感染的最小劑量、母體抗體水平與病毒劑量、病毒進入子宮內(nèi)感染母畜的作用機制等方面進行深入研究。

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