犬隱孢子蟲病研究進(jìn)展

石 凱，鄧俊良，陳兆國(guó)，米榮升，黃 燕，周 鵬

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川雅安625014；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物源性食品安全研究中心，上海200241）

隱孢子蟲（Cryptosporidiumspp.）是一種廣泛寄生于魚類、兩棲類、爬行類、禽類、哺乳類，并能夠引起包括人在內(nèi)的多種動(dòng)物發(fā)生以胃腸黏膜上皮細(xì)胞損傷性腹瀉和卡他性呼吸道炎癥為主要臨床癥狀的人獸共患病的原蟲。隱孢子蟲種類較多，從1907年Tyzzer第一次發(fā)現(xiàn)并于1910年命名鼠隱孢子蟲（Cryptosporidium muris）開(kāi)始［1］，到目前為止被大多數(shù)人所公認(rèn)有效命名的隱孢子蟲共有23種，超過(guò)40多個(gè)基因型［2］。

寄生于犬科動(dòng)物的隱孢子蟲主要為犬隱孢子蟲（C.canis）［2］，此外，還有微小隱孢子蟲（C.parvum）、鼠隱孢子蟲、火雞隱孢子蟲（C.meleagridis）［3］，這些蟲種均可感染人類。但微小隱孢子蟲、鼠隱孢子蟲和火雞隱孢子蟲感染犬后一般呈隱性經(jīng)過(guò)，不表現(xiàn)出明顯癥狀，只有犬隱孢子蟲在犬隱孢子蟲?。–ryptosporidiosis）中具有臨床意義。犬是人們?nèi)粘Ｉ钪械陌閭H動(dòng)物，與人類接觸頻繁，其攜帶的人獸共患隱孢子蟲種很容易傳染給人，無(wú)論是免疫功能正常的人，還是免疫功能存在缺陷的人群，均有感染犬隱孢子蟲的報(bào)道［4］，所以犬源隱孢子蟲可直接危害人類的生活與健康。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)犬隱孢子蟲的研究尚少，本文就近年來(lái)國(guó)內(nèi)外在犬隱孢子蟲的病原學(xué)、寄生部位與致病性、流行病學(xué)、檢測(cè)和防治等方面的研究現(xiàn)狀做一綜述。

1 病 原

1.1 犬隱孢子蟲的發(fā)現(xiàn)與分類

犬隱孢子蟲病最早由Tzipori和Campbell于1981年報(bào)道，他們?cè)?0只犬血清樣品中檢測(cè)出16份陽(yáng)性隱孢子蟲抗體。1983年，Wilson等報(bào)道了第1例犬感染隱孢子蟲病的臨床病例，在1只1周齡患急性腹瀉的幼犬中發(fā)現(xiàn)了隱孢子蟲。但這些病例沒(méi)有通過(guò)基因?qū)W方法檢測(cè)，并不能確定是否由犬隱孢子蟲感染所引起。起初犬隱孢子蟲被認(rèn)為是微小隱孢子蟲?；蛐突蛉嘶蛐?，因?yàn)槿[孢子蟲在形態(tài)以及子孢子表面抗原上和后兩者相同。1999年，Xiao L等［5］從犬的糞便中分離得到隱孢子蟲卵囊，利用核糖體小亞基RNA（small subunit ribosomal RNA，SSU rRNA）基因進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，將該序列同其他隱孢子蟲序列一同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)該分離株位于一個(gè)獨(dú)立的分支上，將其命名為微小隱孢子蟲犬基因型。同年，Pieniazek N J等［6］也從攜帶HIV的病人糞便中檢測(cè)到隱孢子蟲卵囊，經(jīng)SSU rRNA基因擴(kuò)增后測(cè)序，與Xiao L等［5］報(bào)道的微小隱孢子蟲犬基因型序列同源性達(dá)到100%，為同一個(gè)基因型。2001年，F(xiàn)ayer R等［7］又從病犬和 HIV感染病人中分離到該基因型蟲株，并進(jìn)行動(dòng)物感染試驗(yàn)和基于SSU rRNA、卵囊壁蛋白（Cryptosporidiumoocyst wall protein，COWP）與熱休克蛋白70（heat－shock protein 70，HSP 70）基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果顯示該基因型為一個(gè)新種，將其命名為犬隱孢子蟲，目前該蟲種已經(jīng)得到廣泛認(rèn)可。

1.2 犬隱孢子蟲的基因型研究

研究發(fā)現(xiàn)，犬隱孢子蟲并不只有一種基因型，目前發(fā)現(xiàn)并命名的有3種基因型，即犬隱孢子蟲犬基因型（C.canisdog genotype）、郊狼基因型（C.caniscoyote genotype）和狐基因型（C.canisfox genotype）［8］。這幾種基因型都可感染所有的犬科動(dòng)物，但是狐基因型和郊狼基因型只在野生犬科動(dòng)物中有報(bào)道。另外，日本Satoh M等［9］于2006年報(bào)道，日本主島北部的宮城地區(qū)發(fā)現(xiàn)的犬隱孢子蟲種和美國(guó)等其他多個(gè)地區(qū)所報(bào)道的犬隱孢子蟲種的18S rRNA略有不同，在長(zhǎng)度為1 741bp的18SrRNA序列中，第1 684位和第1 685位置的堿基發(fā)生了替換，與其他地區(qū)相比有0.11%的差別。這表明不同地區(qū)之間的犬隱孢子蟲也存在著一定的種內(nèi)隔離。

1.3 形態(tài)特征

犬隱孢子蟲卵囊呈橢圓球形，無(wú)色或蒼白色。在改良抗酸染色標(biāo)本中，卵囊為玫瑰紅色，背景為藍(lán)綠色，對(duì)比性很強(qiáng)，殘?bào)w為暗黑色或棕色顆粒，成熟卵囊內(nèi)含4個(gè)裸露的子孢子和少量殘?bào)w。

犬隱孢子蟲卵囊的形態(tài)大小在不同地區(qū)報(bào)道的有所差別，具體如表1所示，這表明犬隱孢子蟲在形態(tài)學(xué)上存在多樣性，這可能是不同地區(qū)外界環(huán)境不同，犬隱孢子蟲在種內(nèi)也存在一定的差異。另外，在光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡鏡下，其大小和形狀與其他隱孢子蟲相似并互有重合，所以形態(tài)學(xué)上的差異不能作為隱孢子蟲種鑒別的依據(jù)。

表1 不同地區(qū)犬隱孢子蟲卵囊形態(tài)比較Table 1 Comparison of oocyst morphology of Cryptosporidium canis isolated from different regions

2 犬隱孢子蟲寄生部位與致病性

2.1 宿主特異性

犬隱孢子蟲不能感染小鼠，而微小隱孢子蟲能夠感染免疫抑制小鼠；犬隱孢子蟲能夠感染牛，而人隱孢子蟲則不能感染［6］，這也是將其作為一個(gè)獨(dú)立蟲種的主要依據(jù)之一。但當(dāng)人免疫抑制或者免疫功能不全時(shí)也會(huì)感染犬隱孢子蟲，現(xiàn)已有多例犬隱孢子蟲感染艾滋病病人和健康兒童的報(bào)道。

2.2 寄生部位

犬隱孢子蟲一般被認(rèn)為是腸道寄生蟲，寄生于小腸上皮細(xì)胞的刷狀緣納蟲空泡內(nèi)。早期曾有報(bào)道稱犬隱孢子蟲在有寄生蟲和病毒感染的情況下可寄生于犬胃黏膜和呼吸道黏膜［10］。但當(dāng)時(shí)還未命名犬隱孢子蟲，且沒(méi)有經(jīng)分子鑒定，不能確診是否是犬隱孢子蟲感染。2003年，Miller D L等［12］報(bào)道犬胃部隱孢子蟲感染，一只8周齡雌性約克夏犬胃部和腸部黏膜刮取物中發(fā)現(xiàn)犬隱孢子蟲，并且寄生于胃部黏膜的卵囊數(shù)量多于腸道黏膜，這表明犬隱孢子蟲也可寄生于胃部上皮細(xì)胞，但其原因和機(jī)理并不明確。

2.3 內(nèi)生發(fā)育史

當(dāng)宿主吞食成熟卵囊后，在消化液的作用下，子孢子在小腸脫囊而出，先附著并侵入腸上皮細(xì)胞，在被侵入的胞膜與胞質(zhì)之間形成納蟲空泡，蟲體先在空泡內(nèi)無(wú)性繁殖發(fā)育為滋養(yǎng)體，經(jīng)3次核分裂發(fā)育為含有8個(gè)裂殖子的Ⅰ型裂殖體。Ⅰ型裂殖子被釋出后侵入其他上皮細(xì)胞，發(fā)育為第2代滋養(yǎng)體。第2代滋養(yǎng)體經(jīng)2次核分裂發(fā)育為含4個(gè)裂殖子的成熟Ⅱ型裂殖體。此裂殖子釋出后侵入腸上皮細(xì)胞發(fā)育為雌、雄配子體，進(jìn)入有性生殖階段。雌配子體進(jìn)一步發(fā)育為雌配子，雄配子體產(chǎn)生16個(gè)雄配子，雌雄配子結(jié)合形成合子，然后發(fā)育為卵囊，進(jìn)入孢子生殖階段。

2.4 致病性

犬隱孢子蟲的致病性主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面，一是寄生性因素，另一個(gè)就是機(jī)體免疫反應(yīng)。寄生性因素體現(xiàn)在消化道感染，雖然不引起明顯的肉眼病變，但在病理組織學(xué)上呈現(xiàn)典型的腸炎變化，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化、轉(zhuǎn)運(yùn)、吸收出現(xiàn)障礙，引起消化不良和腹瀉。機(jī)體免疫反應(yīng)體現(xiàn)在犬隱孢子蟲感染后，宿主CD3＋、CD4＋T細(xì)胞百分率降低，T細(xì)胞活化障礙，不能分泌足夠的細(xì)胞因子參與免疫應(yīng)答，使感染持續(xù)存在［13］。并且機(jī)體免疫功能下降，增加了其他寄生蟲和傳染病的發(fā)生幾率。

3 犬隱孢子蟲病流行病學(xué)

犬隱孢子蟲病傳染源是人和犬排出的卵囊，病愈后機(jī)體仍可排出卵囊達(dá)數(shù)月之久。這些卵囊對(duì)外界環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力，在潮濕的環(huán)境下能夠存活數(shù)月。犬隱孢子蟲病傳播主要是通過(guò)糞口途徑，犬可通過(guò)其食糞性、梳理皮毛、野外狩獵、食用污染的食物或飲水等接觸卵囊而進(jìn)入消化道引起感染，造成了犬隱孢子蟲病的廣泛傳播。

犬隱孢子蟲病一年四季都可發(fā)生，呈全球性分布，但在潮濕地區(qū)和季節(jié)多發(fā)。從2001年至今，美國(guó)、澳大利亞、日本、英國(guó)、巴西、意大利、伊朗等多個(gè)國(guó)家先后報(bào)道了犬隱孢子蟲病流行情況，其感染率從0.3%～9.3%不等［9，11－18］。中國(guó)部分地區(qū)也開(kāi)展了犬隱孢子蟲病流行病學(xué)調(diào)查，其感染率在3.71%～30.18%之間［20］。造成感染率差異較大的原因，除了可能與樣本的采集地點(diǎn)、樣本數(shù)等相關(guān)外，還可能與犬隱孢子蟲病間歇性排卵的獨(dú)特特性以及不同的檢測(cè)方法有關(guān)。

在感染蟲種上，犬隱孢子蟲占16.7%～100%，其中家養(yǎng)馴化犬科動(dòng)物感染的蟲種主要為犬隱孢子蟲，而野生犬科或流浪馴化犬科動(dòng)物多感染有其他蟲種。例如，Trout J M等［16］在美國(guó)賓夕法尼亞州對(duì)郊狼糞便進(jìn)行采樣檢查，發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲總感染率為27.28%，其中犬隱孢子蟲感染率為22.73%，鼠隱孢子蟲感染率為4.55%。這可能與野外生活環(huán)境中能夠攝食或接觸鼠科動(dòng)物相關(guān)。

此外，犬感染隱孢子蟲還與犬的生理因素，包括年齡、營(yíng)養(yǎng)健康狀況、生活環(huán)境、體型大小等有關(guān)，其中腹瀉犬的感染率高于健康犬的感染率；幼犬比成年犬更容易感染［17］；小型品種犬比大型犬更容易感染；流浪犬、舍養(yǎng)犬和經(jīng)常聚集的犬［18］比家養(yǎng)犬更容易感染。例如，2006年意大利的Giangaspero等調(diào)查了240只犬的隱孢子蟲感染情況，其中舍養(yǎng)犬和家養(yǎng)犬各半，結(jié)果發(fā)現(xiàn)舍養(yǎng)犬的隱孢子蟲感染率為5.00%，高于家養(yǎng)犬的1.68%；腹瀉犬隱孢子蟲的檢出率高于非腹瀉犬。造成這種結(jié)果的可能原因是幼犬免疫功能比較差，隨著年齡的增長(zhǎng)，其免疫功能逐漸增強(qiáng)，感染率和感染強(qiáng)度逐漸降低；小型品種犬身體狀況比較差，免疫力和抵抗力均較差；流浪犬和舍養(yǎng)犬的生活條件較差，免疫力較低，生活環(huán)境容易被污染，也容易發(fā)生交叉感染；腹瀉犬多感染有其他病原，如犬細(xì)小病毒、博卡病毒［21］等，這些病原主要損害消化道，破壞消化道免疫機(jī)能，而犬隱孢子蟲主要寄生于消化道，這也使腹瀉犬感染隱孢子蟲的幾率高于健康犬。

4 犬隱孢子蟲病的診斷

由于犬隱孢子蟲多呈隱性感染，感染者往往是帶蟲者，可以只向外界排出卵囊，而不表現(xiàn)出任何臨診癥狀。一些發(fā)病犬，即使有明顯癥狀，也往往屬于非特異性，只能作為診斷的參考指標(biāo)，而不能憑此做出確診［22］。而且犬隱孢子蟲在形態(tài)學(xué)、抗原特性上與其他種隱孢子蟲比較相似，難以區(qū)別，鑒于這些原因，一類依賴于核酸序列分析的基因?qū)W檢測(cè)技術(shù)開(kāi)始應(yīng)用于犬隱孢子蟲的檢測(cè)。

基因?qū)W診斷主要包括兩大類，一類是探測(cè)隱孢子蟲卵囊特定基因位點(diǎn)的原位雜交（situ hybridization）技術(shù)，主要針對(duì)在細(xì)胞內(nèi)大量存在的RNA小亞基的可變區(qū)進(jìn)行雜交。雖然原位雜交技術(shù)對(duì)隱孢子蟲卵囊的檢測(cè)比較敏感，而且能夠檢測(cè)到卵囊RNA小亞基轉(zhuǎn)錄的時(shí)期，對(duì)于研究卵囊感染性變化和轉(zhuǎn)錄時(shí)期的關(guān)系提供了研究方向，但是并不能區(qū)分其蟲種和基因型，這在一定程度上限制了它的運(yùn)用。另一類是針對(duì)DNA的聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和分子標(biāo)記技術(shù)，這些方法不僅準(zhǔn)確性高，而且能夠提高對(duì)隱孢子蟲種群遺傳學(xué)、種群分布和流行病學(xué)的了解和認(rèn)識(shí)。但是這些檢測(cè)方法都需要新鮮或者冷凍糞便樣品，而犬感染隱孢子蟲后，卵囊排出量較少且呈間歇性排出，很容易漏檢，所以犬隱孢子蟲的實(shí)際感染率往往大于檢出率。

5 犬隱孢子蟲病的防控

5.1 預(yù)防

隱孢子蟲病患犬和病原攜帶犬能排出大量的卵囊，而普通消毒方法對(duì)卵囊的滅活效果并不理想，并且也沒(méi)有商品化的疫苗用于臨床。所以加強(qiáng)消毒和衛(wèi)生管理，是降低接觸犬隱孢子蟲和感染犬隱孢子蟲概率的主要方法。

5.1.1 衛(wèi)生管理 要經(jīng)常清潔消毒病犬污染的環(huán)境及籠舍，及時(shí)妥善處理病犬的糞便、污水和污物等，提供獨(dú)立的清洗消毒設(shè)施，注意食物和飲水衛(wèi)生，避免交叉感染。健康寵物犬要經(jīng)常檢查健康狀況，溜犬時(shí)避免接觸污水、流浪犬、野生動(dòng)物，避免野外攝獵活動(dòng)等。

5.1.2 消毒 由于隱孢子蟲卵囊有著堅(jiān)硬的外殼，一般消毒劑無(wú)法通過(guò)卵囊的外脂質(zhì)層而攻擊到內(nèi)層穩(wěn)定的糖蛋白層，滅活感染階段的子孢子而限制了其應(yīng)用的效果。有研究證實(shí)表面活性劑可以提高卵囊表面的濕潤(rùn)度，增強(qiáng)普通消毒劑的滲透能力，從而提高消毒效果［23］。臭氧在所有消毒劑中效果最好，1mg／L的臭氧作用5min之后就可以滅活90%以上的卵囊，而1.3mg／L的二氧化氯作用60min才可以達(dá)到相同效果［24］。濕熱消毒滅活卵囊是最理想的消毒方法，卵囊暴露在45℃～60℃的濕熱條件下5min～9min就可以使卵囊完全失去感染活力。

5.2 治療

目前還沒(méi)有特效藥物用于犬隱孢子蟲病的臨床治療，現(xiàn)階段用于治療的藥物根據(jù)使用方法和來(lái)源可以分為以下幾種：

5.2.1 中草藥 對(duì)隱孢子蟲病有治療效果的中藥主要有大蒜素、苦參合劑、黃芪多糖、當(dāng)歸補(bǔ)血湯、補(bǔ)骨脂、雙氫青蒿素等［25］。大部分學(xué)者認(rèn)為中藥是通過(guò)提高自身免疫力，利用機(jī)體的自愈能力達(dá)到治療的效果。也有研究證明某些中藥在提高機(jī)體免疫力的同時(shí)還能殺傷卵囊，降低感染程度，減輕腸道病理變化。另外，中藥中的一些鞣酸能夠保護(hù)胃腸黏膜，減輕患犬的腹瀉癥狀。從目前研究結(jié)果來(lái)看，中藥對(duì)隱孢子蟲病有一定療效，但作用機(jī)理和有效成分不是特別明確，需要進(jìn)一步研究。

5.2.2 化學(xué)合成藥 近幾十年來(lái)，治療隱孢子蟲病的化學(xué)藥物的篩選研究已成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)，但大量體內(nèi)外試驗(yàn)表明目前還沒(méi)有特效藥物［26］。目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道［27］臨床用于犬隱孢子蟲病治療的有效藥物包括阿奇霉素（azithromycin），每天每千克體重10mg口服，直至臨床癥狀消失；硝唑尼特（nitazoxanide），每千克體重口服25mg，每天2次，至少7d；巴龍霉素（paromomycin），每千克體重口服125 mg～165mg，每天2次，至少5d；泰樂(lè)菌素（tylosin），每千克體重口服10～15mg，每天2次，共15 d。另外，最新研究表明，常山酮（halofuginone）、螺旋霉素（spiramycin）、金精三羧酸（aurintricarboxylic acid）、姜黃色素（curcumin）、苯并咪唑（benzimidazole）、米替福 新 （miltefosine）、癸 氧 喹 酯 （decoquinate）等在動(dòng)物體內(nèi)外試驗(yàn)中也有一定的療效［27］。

但這些藥物的臨床效果取決于機(jī)體免疫狀況、用藥療程、聯(lián)合用藥等多方面因素；并且還存在清除卵囊不徹底、療程長(zhǎng)、毒性大、僅在免疫正常機(jī)體有效、停藥后易復(fù)發(fā)等缺點(diǎn)，例如，巴龍霉素不能應(yīng)用于有血便的隱孢子蟲病患犬，它會(huì)通過(guò)損傷的腸道進(jìn)入機(jī)體，產(chǎn)生很強(qiáng)的腎臟毒性和耳毒性。所以這些藥物的臨床應(yīng)用還需進(jìn)一步研究改善。

5.2.3 生物制劑 國(guó)內(nèi)外研究人員用高免初乳、高免血清、單克隆抗體、牛轉(zhuǎn)移因子、裂解肽及白介素等生物制品，直接提高或刺激機(jī)體提高免疫功能來(lái)達(dá)到免疫治療的效果。但由于生物制品成本較高，療效不很確切，故大規(guī)模應(yīng)用尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

5.2.4 其他藥物 止瀉藥和補(bǔ)液藥對(duì)犬隱孢子蟲引起的腹瀉癥狀和脫水癥狀也有一定的改善。例如，Paraud C等［28］報(bào)道動(dòng)物灌服混合活性炭的木酢液（wood vinegar liquid），能夠使卵囊排出數(shù)量減少，并能顯著減輕腹瀉癥狀。另外還有最近研究比較熱門的分子靶標(biāo)抑制劑等，可以從內(nèi)部抑制隱孢子蟲或卵囊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的合成和代謝［29］。

6 展望

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)犬隱孢子蟲的研究多停留在利用子孢子抗原蛋白建立檢測(cè)技術(shù)，或采用常規(guī)的濃集法、染色法技術(shù)進(jìn)行調(diào)查研究，對(duì)于犬隱孢子蟲的病原學(xué)、生物學(xué)特性、病理學(xué)、基因組學(xué)等研究還比較少，對(duì)犬感染的隱孢子蟲基因分型或相關(guān)研究工作還有待加強(qiáng)。

隨著對(duì)隱孢子蟲蛋白組學(xué)和基因組學(xué)研究的深入，人們對(duì)犬隱孢子蟲的生物學(xué)特性的了解會(huì)越來(lái)越深入，對(duì)其分子流行病學(xué)和致病機(jī)理的研究將更加深刻，其檢測(cè)方法將更加快捷有效，治療藥物越來(lái)越多，相信不久的將來(lái)隱孢子蟲病疫苗的研究也將取得重要進(jìn)展。

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