• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    微小隱孢子蟲在HCT-8細(xì)胞內(nèi)的培養(yǎng)

    2016-12-01 05:38:44朱惠麗劉利敏王臣榮張素梅張龍現(xiàn)王榮軍
    關(guān)鍵詞:密度梯度卵囊蟲體

    朱惠麗,劉利敏,王臣榮,張素梅,張龍現(xiàn),王榮軍

    ?

    微小隱孢子蟲在HCT-8細(xì)胞內(nèi)的培養(yǎng)

    朱惠麗1,2,劉利敏1,王臣榮1,張素梅1,張龍現(xiàn)1,王榮軍1

    目的 將人回盲腸癌(HCT-8)細(xì)胞作為微小隱孢子蟲IId亞型體外感染對象,觀察蟲體在細(xì)胞中的生長發(fā)育過程。方法 將純化的隱孢子蟲IId亞型感染HCT-8細(xì)胞,通過Giemsa染色法觀察微小隱孢子蟲IId亞型在HCT-8細(xì)胞中發(fā)育過程,運(yùn)用PCR方法對不同感染時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞樣品DNA進(jìn)行檢測。結(jié)果 在感染后72 h內(nèi),隱孢子蟲出現(xiàn)連續(xù)發(fā)育階段,包括脫囊、子孢子、滋養(yǎng)體、裂殖體、配子體、合子和卵囊;PCR的檢測結(jié)果顯示,在感染細(xì)胞96 h仍能檢測到蟲體DNA。結(jié)論 通過HCT-8細(xì)胞,觀察到微小隱孢子蟲IId亞型的完整的生長發(fā)育過程,為抗隱孢子蟲藥物的篩選提供理論基礎(chǔ),亦可成為微小隱孢子蟲IId亞型卵囊體外擴(kuò)增的方法。

    微小隱孢子蟲;感染模型;HCT-8細(xì)胞;培養(yǎng)

    Invitroculture ofCryptosporidiumparvumin HCT-8

    隱孢子蟲(Cryptosporidium)是一種引起人獸共患病的機(jī)會(huì)性原蟲,其嚴(yán)重威脅免疫功能低下及免疫功能缺陷者的生命安全,特別是艾滋病患者[1]。隱孢子蟲可以感染包括人和其他哺乳動(dòng)物、鳥類、爬行類、兩棲類和魚類的240多種動(dòng)物[2],造成重大經(jīng)濟(jì)影響和社會(huì)影響。同時(shí),隱孢子蟲病也是一種重要的食源/水源性疾病, 從2004年至2010年12月,全球有記錄的水源性隱孢子蟲病暴發(fā)共120起,與飲用水和娛樂水相關(guān)的暴發(fā)占46%和54%[3]。在我國的水體系統(tǒng)中,隱孢子蟲的分布也極其廣泛,在河水、水庫和飲用原水中均檢測到有隱孢子蟲。隱孢子蟲已被我國列為城市用水和飲用水的監(jiān)測指標(biāo)之一。

    盡管相關(guān)的隱孢子蟲的研究報(bào)道有很多,但對該病的致病機(jī)制仍不明晰,亦無有效的藥物或疫苗治療這種原蟲病[1]。近年來,體外培養(yǎng)作為研究隱孢子蟲生活史、感染機(jī)制和藥物篩選的手段已取得了一定的進(jìn)展[4-10]。但是這些研究方法通常需要借助免疫熒光、激光共聚焦和電鏡等技術(shù),這些方法試驗(yàn)周期長,時(shí)常存在假陽性等缺陷。因此,建立一種簡便快捷和易于觀察的隱孢子蟲體外培養(yǎng)方法勢在必行。

    微小隱孢子蟲(Cryptosporidiumparvum)作為人類隱孢子蟲病的重要病原種類,具有感染譜廣,致病性嚴(yán)重,具有重要的公共衛(wèi)生意義。HCT-8細(xì)胞可作為多種隱孢子蟲體外培養(yǎng)的宿主細(xì)胞,可觀察到其各個(gè)發(fā)育階段形態(tài)特征[11-13]。另外,HCT-8細(xì)胞比其他的宿主細(xì)胞更有利于C.parvum的培養(yǎng),因?yàn)镠CT-8細(xì)胞可容許數(shù)量較多的C.parvum感染發(fā)育,增加感染細(xì)胞的數(shù)量而有利于觀察蟲體在細(xì)胞的發(fā)育過程[14]。

    本研究利用HCT-8細(xì)胞體外培養(yǎng)C.parvumIId亞型,運(yùn)用Giemsar染色法觀察C.parvumIId亞型在HCT-8細(xì)胞中的不同發(fā)育階段特征,對不同感染時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞樣品DNA進(jìn)行PCR檢測,以期為隱孢子蟲的藥物篩選和致病機(jī)制的研究打基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 蟲株和細(xì)胞株 通過飽和蔗糖溶液漂浮法從鄭州某奶牛場奶牛糞便收集到C.parvumIId亞型卵囊,采用Xiao等方法[15]的方法進(jìn)行GP60基因擴(kuò)增測序鑒定為C.parvumIId亞型,用2.5%重鉻酸鉀4 ℃保存。

    HCT-8細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫,培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FCS)的RPMI1640培養(yǎng)液中,置37 ℃,5% CO2溫箱中培養(yǎng),待細(xì)胞生長融合至單細(xì)胞層后以胰酶消化,計(jì)數(shù),分裝6孔板,并觀察96 h內(nèi)HCT-8細(xì)胞的生長情況,為蟲體感染做準(zhǔn)備。

    1.2 主要試劑與儀器 RPMI 1640液體培養(yǎng)液購自Giboco公司(4 ℃,避光保存),胎牛血清購自杭州四季青公司,Giemsa染料試劑盒,牛黃膽酸鹽和HEPES購自Sigma公司,基因組DNA提取試劑盒和PCR檢測試劑盒購自TOYOBO公司,CO2培養(yǎng)箱購自Thermo公司,低溫高速離心機(jī)Sigma公司,倒置顯微鏡購自LEICA公司。

    細(xì)胞接種C.parvumIId亞型卵囊后,應(yīng)更換為維持培養(yǎng)液,其成分為每100 mL培養(yǎng)基中含0.03 g/L L-谷氨酰胺、0.3 g/L碳酸氫鈉、0.02 g/L牛黃膽酸鹽、0.1 g葡萄糖、25 μg葉酸,100 μg對氨基苯甲酸、50 μg泛酸鈣、875 μg葉酸、2%FCS、15-20 mmol/L HEPES緩沖液、100單位/mL青霉素和0.01 g/mL鏈霉素,37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1C.pavumⅡd亞型卵囊大量收集與純化 從鄭州某奶牛場奶牛糞便收集到C.parvumIId亞型卵囊,通過未食初乳的4日齡犢牛進(jìn)行卵囊的傳代擴(kuò)增,收集排卵囊期間的犢牛糞便溶于蒸餾水,經(jīng)80目銅篩過濾,濾液3 500 r/min離心10 min,棄上清,加入等體積的乙醚去除糞便中的脂肪,3 500 r/min離心10 min用清水洗3遍,去上清,沉淀加入飽和蔗糖溶液,充分混勻,3 500 r/min離心10 min,用金屬吊環(huán)收取上層卵囊,加入10倍稀釋的蒸餾水混勻,3 500 r/min離心10 min,棄上清,用適量蒸餾水混勻。

    卵囊純化:取50 mL離心管,加入25 mL 1∶1蔗糖溶液30 mL,在蔗糖溶液上層小心加入上述收取卵囊液5 mL,3 600 r/min離心15 min,吸取卵囊?guī)в跓?;每次吸取的卵囊?guī)в靡欢康恼麴s水稀釋并充分混勻之后,離心留沉淀,用適量蒸餾水均勻;根據(jù)Arrowood等[16]方法,配制氯化銫(CsCl)工作液,采用離心的方法收取卵囊?guī)コs質(zhì)對卵囊作進(jìn)一步的純化;然后純化的卵囊用5%次氯酸鈉4 ℃作用10 min進(jìn)行無菌化處理,蒸餾水清洗5次,去除殘留的次氯酸鈉。最后卵囊沉淀用含2% FCS的RPMI 1640維持培養(yǎng)液重懸,用于感染細(xì)胞。1.3.2C.pavumIId亞型在細(xì)胞中的發(fā)育過程觀察 將無菌化處理的20 mm蓋玻片置6孔板中,在每個(gè)蓋玻片上中加入10%FCS的RP MI1640培養(yǎng)液,內(nèi)含有1×105個(gè)HCT-8細(xì)胞,置37 ℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長融合至85%時(shí),棄掉培養(yǎng)液, 以無菌PBS洗滌2次,每個(gè)玻片上接種2×105個(gè)處理后的卵囊培養(yǎng)液。2.5 h后棄去未結(jié)合細(xì)胞的卵囊,換上維持培養(yǎng)液(2% FCS)。分別取感染后2 h、5 h、12 h、18 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、96 h、108 h玻片樣品,以無菌PBS緩沖液洗滌2次,各個(gè)時(shí)間點(diǎn)共6份玻片樣品,取其中3份樣品用微分干涉顯微鏡觀察蟲體形態(tài),另外3份樣品用甲醇固定后,用Giemsa染色試劑盒進(jìn)行染色,觀察蟲體發(fā)育情況并照相。同時(shí)設(shè)空白對照。

    1.3.3 用PCR法檢測不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞樣品DNA的GP60基因

    1.3.3.1C.pavumIId亞型的細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)及卵囊感染同1.3.2,孔板中不加蓋玻片。待培養(yǎng)6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h后收集上清與細(xì)胞后,上清沉淀物保存于-20 ℃用于制備模板DNA,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3次重復(fù),同時(shí)加空白對照。

    每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3次重復(fù),同時(shí)加空白對照。

    1.3.3.2 基于GP60基因的PCR檢測GP60基因是隱孢子蟲基因組中最具多態(tài)性的標(biāo)記基因,是應(yīng)用最廣泛的隱孢子蟲亞型靶基因。根據(jù)GenBank發(fā)表的C.pavumGP60基因序列,應(yīng)用Primer 5.0生物信息軟件設(shè)計(jì)一對巢式PCR引物,擴(kuò)增片段為832 bp。引物序列:gp60-F1,5′-ATA GTC TCC GCT GTA TTC-3′,gp60-R1,5′-GGA AGG AAC GAT GTA TCT-3′,gp60-F2,5′-TCC GCT GTA TTC TCA GCC-3′,gp60-R2,5′-GCA GAG GAA CCA GCA TC-3′,由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

    樣品DNA提取方法參照Mag Extractor基因組提取試劑盒說明書進(jìn)行,提取DNA后,-20 ℃保存?zhèn)溆?。以上述制備的DNA為模板,用kold plus酶擴(kuò)增GP60基因,PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳后,在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果,拍攝照片保存。

    3 結(jié) 果

    3.1 Giemsa染色法觀察細(xì)胞 隱孢子蟲感染HCT-8細(xì)胞,經(jīng)Giemsa染色,見HCT-8細(xì)胞呈紅色或紫紅色,各發(fā)育階段隱孢子蟲呈藍(lán)色或藍(lán)紫色。隱孢子蟲感染細(xì)胞2 h~12 h,大部分的隱孢子蟲脫囊,釋放出子孢子(圖1B,1b);感染12 h~24 h,子孢子侵入HCT-8細(xì)胞,發(fā)育為滋養(yǎng)體(圖1C,1c);感染36 h,可見HCT-8細(xì)胞內(nèi)含有6個(gè)裂殖子的裂殖體(圖1D,1d);感染48 h,HCT-8細(xì)胞內(nèi)見小配子及其殘?jiān)?圖1E,1e)、配子體(圖1F,1f)和合子(圖1G,1g);感染60 h,HCT-8細(xì)胞內(nèi)見卵囊(圖1H,1h),收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清中,除見到大量的游離卵囊,還有大量細(xì)胞碎片。

    A-H:微分干涉顯微鏡;a-h:吉姆薩染色;A、a:未感染蟲體的細(xì)胞對照;B、b:隱孢子蟲脫囊階段;C、c:滋養(yǎng)體階段;D、d:裂殖體階段;E、e:大配子階段;F、f:小配子階段;G、g:合子階段;H、h:卵囊階段

    A-H: differential interference microscope, a-h: Giemsa staining. A,a: uninfected cell control; B,b: Cryptosporidium excystation; C,c: trophozoites; D,d: schizont; E,e: megagametophyte; F,f: microgametocyte; G,g: zygote; H,h: oocyst

    圖1 微小隱孢子蟲IId亞型在HCT-8細(xì)胞中各發(fā)育階段蟲體的形態(tài)觀察(×1000)

    Fig.1 Observation of various development stage ofCryptosporidiumparvumIId in HCT-8 cells (×1000)

    3.2 不同時(shí)間點(diǎn)HCT-8細(xì)胞DNA的PCR檢測

    將提取的不同時(shí)間點(diǎn)的上清與細(xì)胞樣品DNA,分別進(jìn)行GP60基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)。電泳結(jié)果顯示:細(xì)胞上清DNA樣品在6 h、12 h、24 h、48 h未能擴(kuò)增出832 bp特異型性片段,而在72 h和96 h擴(kuò)增出832 bp的特異性片段,細(xì)胞樣品在不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞樣品中均能擴(kuò)增出832 bp的特異性片段。詳見圖2,圖3。

    M:DL2000 分子marker;1:空白細(xì)胞對照,2-7:卵囊接種6 h,12 h,24 h,48 h,72 h,96 h的細(xì)胞樣品,8:陰性對照(無菌蒸餾水)M: DL 2000 molecular marker; 1: blank cell control, 2-7: cell samples post inoculated hours 6, 12, 24, 48, 72, and 96, 8: negtive control(distilled water)圖2 微小隱孢子蟲IId亞型在HCT-8細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞中卵囊DNA檢測Fig.2 Detection of C. parvum IId DNA at different times in HCT-8 cell

    M:DL2000 分子marker;1:空白細(xì)胞對照,2-7:卵囊接種6 h,12 h,24 h,48 h,72 h,96 h的細(xì)胞上清樣品,8:陰性對照(無菌蒸餾水)M: DL 2000 molecular marker; 1: blank cell control, 2-7: cell supernatant post inoculated hours 6, 12, 24, 48, 72, and 96, 8: negtive control(distilled water)圖3 微小隱孢子蟲IId亞型在HCT-8細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞上清中卵囊DNA檢測Fig.3 Detection of C. parvum IId DNA at different times in HCT-8 cell supernatant

    4 討 論

    純化隱孢子蟲卵囊主要用于體外培養(yǎng)、抗原制備和隱孢子蟲DNA提取研究。本實(shí)驗(yàn)采用1∶1的蔗糖溶液純化隱孢子蟲卵囊,收到的卵囊量大而且較為純凈,此時(shí)的卵囊可用于提取隱孢子蟲DNA。由于本文的卵囊的用途是感染細(xì)胞,要求細(xì)胞純凈,無雜質(zhì),所以要對卵囊作進(jìn)一步的純化。文獻(xiàn)報(bào)道,對于卵囊的純化,一般采用Percoll密度梯度離心和CsCl密度梯度離心和免疫磁性分離法(IMS)等。Hadfield等[17]用IMS和CsCl的密度梯度離心對比試驗(yàn)顯示IMS法適用于小量的卵囊純化,而CsCl密度梯度離心法適用于量大樣品的純化。陳甫等[18]用Percoll密度梯度離心和CsCl密度梯度離心法處理卵囊的對比實(shí)驗(yàn)表明,兩者雖都存在卵囊丟失,但是CsCl密度梯度離心卵囊丟失率低,且純化的卵囊純度明顯高于Percoll密度梯度離心,而且不用做任何滅菌處理,直接可以感染細(xì)胞。由于本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞感染需要大量的卵囊,因此使用CsCl密度梯度離心的方法純化卵囊,而Arrowood[16]的方法簡便,可操作性強(qiáng),回收率高。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Arrowood等[16]的試驗(yàn)方法進(jìn)行純化卵囊,做了些改動(dòng),即離心機(jī)的轉(zhuǎn)速和時(shí)間與文獻(xiàn)報(bào)道不太一致,我們采取的離心機(jī)轉(zhuǎn)速與時(shí)間比文獻(xiàn)報(bào)道要高,否則的話,形成的卵囊?guī)?,容易造成卵囊的大量丟失。

    研究表明,用于感染細(xì)胞的卵囊必須是新鮮的,一般是3個(gè)月以內(nèi)的卵囊,越早越好。在感染之前要用次氯酸鈉處理以除去卵囊液中的病原微生物,而且采用次氯酸鈉處理可使卵囊壁變薄(特別是新鮮卵囊壁更容易變薄),有助于子孢子的溢出又可以防止微生物污染[7]。加之細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)含有定量的牛黃膽酸鹽的刺激,更有利于子孢子的溢出。因此本研究中的卵囊在感染前并未進(jìn)行脫囊而直接感染細(xì)胞。

    采用PCR方法從分子方面確認(rèn)了C.parvumⅡd亞型在HCT-8細(xì)胞中生長發(fā)育過程以及遺傳穩(wěn)定性。細(xì)胞樣品在不同的感染時(shí)間點(diǎn)均能擴(kuò)增出832 bp的GP60基因片段,測序結(jié)果分析顯示均為C.parvumIId亞型。而細(xì)胞上清樣品在6 h、12 h、24 h、48 h未能檢測出C.parvumIId亞型蟲體DNA,卻在72 h和96 h檢測出C.parvumIId亞型蟲體DNA。說明感染早期,卵囊在細(xì)胞中進(jìn)行生長發(fā)育,在上清中檢測不到蟲體DNA,但在感染后期(72 h后),隨著細(xì)胞的不斷崩解,導(dǎo)致C.parvumIId亞型卵囊脫離細(xì)胞,游離于上清中,因而細(xì)胞上清中能夠檢測到蟲體DNA。因此,通過HCT-8細(xì)胞體外培養(yǎng)C.parvumIId亞型卵囊時(shí),我們還需對細(xì)胞的培養(yǎng)條件、特別是細(xì)胞感染后血清濃度、感染蟲體數(shù)量和細(xì)胞數(shù)量的比例以及培養(yǎng)環(huán)境等方面的問題需要進(jìn)一步的摸索,為建立微小隱孢子的體外培養(yǎng)模型奠定基礎(chǔ)。

    [1] Karanis P, Aldeyarbi HM. Evolution ofCryptosporidiuminvitroculture[J]. Int J Parasitol, 2011, 41(12): 1231-1242.

    [2] Plutzer J, Karanis P. Genetic polymorphism inCryptosporidiumspecies: an update[J]. Vet Parasitol, 2009, 165: 187-199.

    [3] Baldersson S, Karanis P. Waterborne transmission of protozoan parasites: review of worldwide outbreaks-an update 2004-2010[J]. Water research, 2011, 45(20): 6603-6614.

    [4] Morada M, Lee S, Gunther-Cummins L, et al. Continuous culture ofCryptosporidiumparvumusing hollow fiber technology[J]. Int J Parasitol, 2016, 46(1): 21-29.

    [5] Aldeyarbi HM, Karanis P. Electron microscopic observation of the early stages ofCryptosporidiumparvumasexual multiplication and development ininvitroaxenic culture[J]. Eur J Protistol, 2015, 52: 36-44.

    [6] Jenkins MC, O'Brien CN, Santin M, et al. Changes in the levels of Cryspovirus duringinvitrodevelopment ofCryptosporidiumparvum[J]. Parasitol Res, 2015, 114(6): 2063-2068.

    [7] Dibao-Dina A, Follet J, Ibrahim M, et al. Electrical impedance sensor for quantitative monitoring of infection processes on HCT-8 cells by the waterborne parasiteCryptosporidium[J]. Biosens Bioelectron, 2015, 66: 69-76.

    [8] Schupfner M, Greif G, Lendner M, et al. Evaluation of putative anti-cryptosporidial drugs in aninvitroculture system[J].Parasitol Res, 2013, 112(Suppl 1): 149-162.

    [9] Castellanos-Gonzalez A, Cabada MM, Nichols J, et al. Human primary intestinal epithelial cells as an improvedinvitromodel forCryptosporidiumparvuminfection[J]. Infect Immun, 2013, 81(6): 1996-2001.

    [10] Yang R, Elankumaran Y, Hijjawi N, et al. Validation of cell-free culture using scanning electron microscopy (SEM) and gene expression studies[J]. Exp Parasitol, 2015, 153: 55-62.

    [11] Morada M, Pendyala L, Wu G, et al.Cryptosporidiumparvuminduces an endoplasmic stress response in the intestinal adenocarcinoma HCT-8 cell line[J]. J Biol Chem, 2013, 288(42): 30356-30364.

    [12] Johnson AM, Giovanni GD, Rochelle PA. Comparison of assays for sensitive and reproducible detection of cell culture-infectiousCryptosporidiumparvumandCryptosporidiumhominisin drinking water[J]. Appl Environ Microbiol, 2012, 78(1):156-162.

    [13] Wu L, Jiang XG, Shen YJ, et al. Efficacy of ginkgolic acids againstCryptosporidiumandersoni in cell culture[J]. Parasitol Res, 2011, 109(5): 1475-1479.

    [14] Hijjawi N.Cryptosporidium: new developments in cell culture[J]. Exp Parasitol, 2010, 124(1): 54-60.

    [15] Xiao L, Fayer R, Ryan U, et al.Cryptosporidiumtaxonomy: recent advances and implications for public health[J]. Clin Microbiol Rev, 2004, 17: 72-97.

    [16] Arrowood MJ, Donaldson K. Improved purification methods for calf-derivedCryptosporidiumparvumoocysts using discontinuous sucrose and cesium chloride gradients[J]. J Eukaryot Microbiol, 1996, 43(5): 89S.

    [17] Hadfield SJ, Pachebat JA, Swain MT, et al. Generation of whole genome sequences of newCryptosporidiumhominisandCryptosporidiumparvumisolates directly from stool samples[J]. BMC Genomics, 2015, 16: 650.

    [18] Chen P, Huang KH. Study on methods for isolation and purification ofCryptosporidiumparvum oocysts in feces from mouse feces[J]. China Journal of Parasitology and Parasitic Diseases, 2006, 24(3): 219-222.(in Chinese)

    陳甫,黃克和.從鼠糞中分離純化微小隱孢子蟲卵囊方法的研究[J]. 中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志, 2006, 24(3): 219-222.

    ZHU Hui-li1,2, LIU Li-min1, WANG Cheng-rong1, ZHANG Su-mei1,ZHANG Long-xian1,WANG Rong-jun1

    (1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryScience,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002,China;2.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryScience,HenanInstituteofScience

    andTechnology,Xinxiang453003,China)

    In order to developinvitroinfected model forCryptosporidiumparvumand to observe its developmental stages in the cells, the human ileocecal cancer (HCT-8) cells were selected to culture the parasite. The purified oocysts ofC.parvumIId subtype infected HCT-8 cellsinvitro, the developmental processes ofC.parvumIId subtype in HCT-8 cells were observed using Giemsa staining, and the DNA ofC.parvumIId subtype from different time points of infection were detected by Polymerase Chain Reaction (PCR). Following 72 h co-culture, excystation, sporozoites, trophozoites, meronts, microgametocytes, macrogametocytes, zygote and oocyst appeared orderly. Furthermore, the DNA ofC.parvumIId subtype in cells were still detected at 96 h post-infection. The complete developmental processes ofC.parvumIId subtype can be observed in HCT-8 cells, which provides a theoretical basis for the screening of anti-Cryptosporidiumdrugs and becomes a method forC.parvumIId oocyst amplification byinvitroculture.

    Cryptosporidiumparvum; infection model; HCT-8 cell; culture

    國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(No.31330079)、國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(No.31302079)和河南省高校科技創(chuàng)新人聯(lián)合資助

    王榮軍,email:wrj-1978@163.com

    1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院,鄭州 450002;

    2.河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,新鄉(xiāng) 453003

    10.3969/j.issn.1002-2694.2016.08.005

    R382

    A

    1002-2694(2016)08-0706-05

    2016-01-20;

    2016-01-20

    Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31330079) and (Grant No.31302079) and Science and technology innovation talents in Colleges and Universities in Henan Province(No.16HASTIT018)

    猜你喜歡
    密度梯度卵囊蟲體
    “躺平”大師海蝸牛
    TPMS點(diǎn)陣結(jié)構(gòu)的密度梯度雜交優(yōu)化設(shè)計(jì)
    重組pET30a-EgM9蛋白高免兔血清對體外培養(yǎng)細(xì)粒棘球絳蟲發(fā)育的影響
    從寄生蟲的生命周期到疾病防控
    中國首臺(tái)準(zhǔn)環(huán)對稱仿星器中離子溫度梯度模的模擬研究*
    羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病的診斷及危重病例治療
    犬絲蟲性眼炎的防治
    雞球蟲免疫成功要點(diǎn)
    仔豬球蟲病的診斷與防治
    對Meselson和Stahl半保留復(fù)制實(shí)驗(yàn)的解析
    日韩 亚洲 欧美在线| 宅男免费午夜| 国产av精品麻豆| 波多野结衣一区麻豆| 久久久国产一区二区| 一区二区三区乱码不卡18| 丝袜在线中文字幕| 国产毛片在线视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 多毛熟女@视频| 在线 av 中文字幕| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 日韩三级伦理在线观看| a级毛片黄视频| 国产色爽女视频免费观看| videosex国产| 亚洲国产av新网站| 最后的刺客免费高清国语| 久久久久久久国产电影| 亚洲国产日韩一区二区| 日韩精品有码人妻一区| 午夜91福利影院| 精品福利永久在线观看| 精品久久蜜臀av无| 国产 精品1| 国产日韩欧美在线精品| 人成视频在线观看免费观看| 欧美国产精品一级二级三级| 欧美人与性动交α欧美软件 | 国产永久视频网站| 久久ye,这里只有精品| 美女国产高潮福利片在线看| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 国产精品久久久久久av不卡| 国产日韩欧美亚洲二区| 满18在线观看网站| 男女国产视频网站| 在线观看www视频免费| 日韩成人伦理影院| 99香蕉大伊视频| 日本av手机在线免费观看| 久久精品久久久久久久性| kizo精华| 国产一区二区三区av在线| 国产精品一区二区在线不卡| 香蕉精品网在线| 午夜福利,免费看| 只有这里有精品99| 卡戴珊不雅视频在线播放| 丝袜在线中文字幕| 国产高清不卡午夜福利| 午夜激情久久久久久久| a 毛片基地| 在线观看免费视频网站a站| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产精品欧美亚洲77777| 熟女人妻精品中文字幕| 人妻一区二区av| 街头女战士在线观看网站| 久久影院123| 国产精品国产三级国产专区5o| 少妇的逼水好多| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 丝袜在线中文字幕| 国产男女超爽视频在线观看| 高清av免费在线| 水蜜桃什么品种好| 国产av一区二区精品久久| 久久免费观看电影| 人人澡人人妻人| 妹子高潮喷水视频| 免费高清在线观看日韩| 在线观看三级黄色| a级毛色黄片| 99国产精品免费福利视频| 波多野结衣一区麻豆| 亚洲,一卡二卡三卡| 久久久久久久国产电影| 日本-黄色视频高清免费观看| 精品久久蜜臀av无| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产一区二区激情短视频 | 亚洲高清免费不卡视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| 亚洲一码二码三码区别大吗| 在线观看美女被高潮喷水网站| 超碰97精品在线观看| 十八禁网站网址无遮挡| 日韩制服骚丝袜av| 色婷婷久久久亚洲欧美| 中国美白少妇内射xxxbb| av播播在线观看一区| 午夜免费鲁丝| 免费黄网站久久成人精品| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲国产av影院在线观看| 精品少妇久久久久久888优播| 午夜老司机福利剧场| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲精品美女久久av网站| 日本与韩国留学比较| 久久青草综合色| 18禁观看日本| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 下体分泌物呈黄色| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲av男天堂| 国产精品99久久99久久久不卡 | 美女中出高潮动态图| 国产永久视频网站| 免费观看无遮挡的男女| av黄色大香蕉| 久久久亚洲精品成人影院| 国国产精品蜜臀av免费| 飞空精品影院首页| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产男女内射视频| 久热久热在线精品观看| 国产免费福利视频在线观看| 两个人看的免费小视频| 男女午夜视频在线观看 | 在线观看www视频免费| 国产一区二区激情短视频 | 免费日韩欧美在线观看| 亚洲国产精品999| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产精品久久久久成人av| 美女中出高潮动态图| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 热re99久久国产66热| 午夜福利视频在线观看免费| 18在线观看网站| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲国产精品国产精品| 2022亚洲国产成人精品| 嫩草影院入口| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 精品福利永久在线观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 男女午夜视频在线观看 | 欧美日韩亚洲高清精品| 国产免费福利视频在线观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 男女午夜视频在线观看 | 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 性色av一级| 久久精品人人爽人人爽视色| www.熟女人妻精品国产 | 亚洲成国产人片在线观看| 国产精品久久久久久精品电影小说| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 欧美97在线视频| 国产精品国产三级专区第一集| 国产成人免费无遮挡视频| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 亚洲精品国产av蜜桃| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 精品一区在线观看国产| av黄色大香蕉| 大香蕉久久成人网| 一本大道久久a久久精品| 国产成人午夜福利电影在线观看| 桃花免费在线播放| 亚洲五月色婷婷综合| 成年人免费黄色播放视频| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产亚洲精品久久久com| 考比视频在线观看| 一区二区av电影网| 久久人人爽人人片av| 看免费成人av毛片| 大码成人一级视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 伊人亚洲综合成人网| 国产综合精华液| 亚洲图色成人| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产成人免费无遮挡视频| 夜夜爽夜夜爽视频| 国产国语露脸激情在线看| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 熟女av电影| 亚洲国产av影院在线观看| 欧美精品亚洲一区二区| 香蕉丝袜av| 青春草亚洲视频在线观看| 免费黄网站久久成人精品| 永久免费av网站大全| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产色爽女视频免费观看| 一区二区三区精品91| 丰满少妇做爰视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 高清av免费在线| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 美女福利国产在线| 亚洲,欧美精品.| 精品久久久久久电影网| 啦啦啦啦在线视频资源| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 9191精品国产免费久久| 高清视频免费观看一区二区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产一级毛片在线| 母亲3免费完整高清在线观看 | 国产精品嫩草影院av在线观看| 人妻一区二区av| 各种免费的搞黄视频| 免费看av在线观看网站| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 最近手机中文字幕大全| 少妇高潮的动态图| 精品第一国产精品| 午夜免费观看性视频| 人人妻人人澡人人看| 国产精品久久久久久精品电影小说| av有码第一页| 黑人欧美特级aaaaaa片| 免费人成在线观看视频色| av福利片在线| a级毛色黄片| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产又色又爽无遮挡免| 一级片'在线观看视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 精品人妻偷拍中文字幕| 春色校园在线视频观看| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲综合色网址| 久久久久久人人人人人| 超色免费av| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 国产精品不卡视频一区二区| 九色成人免费人妻av| 18禁观看日本| av免费观看日本| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 伦理电影免费视频| 美女中出高潮动态图| 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲精品第二区| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 青青草视频在线视频观看| 国产精品久久久av美女十八| av片东京热男人的天堂| 久久久久久久国产电影| 男人操女人黄网站| 99热6这里只有精品| 99视频精品全部免费 在线| 天美传媒精品一区二区| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲成国产人片在线观看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 欧美日韩视频精品一区| 激情视频va一区二区三区| 国产免费一级a男人的天堂| 美女福利国产在线| 尾随美女入室| 国产精品一区二区在线不卡| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 日本欧美视频一区| 各种免费的搞黄视频| 男人舔女人的私密视频| 国产一区二区在线观看日韩| 亚洲av综合色区一区| 日韩人妻精品一区2区三区| 成人无遮挡网站| 欧美激情国产日韩精品一区| 一级a做视频免费观看| 高清在线视频一区二区三区| 成人国产麻豆网| 丰满饥渴人妻一区二区三| 高清黄色对白视频在线免费看| 久久午夜福利片| 免费在线观看完整版高清| 少妇的逼好多水| 国产乱人偷精品视频| av免费观看日本| 人妻系列 视频| 在线看a的网站| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产免费现黄频在线看| 美女福利国产在线| 伦理电影大哥的女人| 视频中文字幕在线观看| 日韩成人伦理影院| 亚洲国产精品一区三区| 亚洲,欧美精品.| 一级a做视频免费观看| 丝袜喷水一区| 女人精品久久久久毛片| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲综合色惰| 精品亚洲成a人片在线观看| 看非洲黑人一级黄片| 日韩一区二区三区影片| 亚洲av国产av综合av卡| 免费黄色在线免费观看| 亚洲av中文av极速乱| 精品一区二区三区视频在线| 男女下面插进去视频免费观看 | 91午夜精品亚洲一区二区三区| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 波野结衣二区三区在线| 精品国产国语对白av| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 夫妻性生交免费视频一级片| 嫩草影院入口| 免费高清在线观看日韩| 99九九在线精品视频| 成人免费观看视频高清| 91精品伊人久久大香线蕉| 欧美日本中文国产一区发布| 岛国毛片在线播放| 久久97久久精品| 欧美人与善性xxx| 久久影院123| 久久毛片免费看一区二区三区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 丝袜喷水一区| av片东京热男人的天堂| 男人舔女人的私密视频| 国产麻豆69| 亚洲国产成人一精品久久久| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 18禁观看日本| 国产一区二区在线观看av| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲美女黄色视频免费看| 一级黄片播放器| 一级,二级,三级黄色视频| 老司机亚洲免费影院| 在线天堂最新版资源| 亚洲高清免费不卡视频| 99视频精品全部免费 在线| 久久精品国产综合久久久 | 国产精品99久久99久久久不卡 | 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 欧美国产精品va在线观看不卡| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 最后的刺客免费高清国语| 免费高清在线观看日韩| 一本大道久久a久久精品| 在线天堂最新版资源| 亚洲综合精品二区| 日本黄大片高清| 又黄又粗又硬又大视频| 国产免费一级a男人的天堂| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 色婷婷久久久亚洲欧美| 美女大奶头黄色视频| 五月天丁香电影| 久久99一区二区三区| 热99国产精品久久久久久7| 日本黄大片高清| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 久久婷婷青草| 欧美精品av麻豆av| 99国产精品免费福利视频| 黄色怎么调成土黄色| 免费看光身美女| 观看美女的网站| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 午夜免费男女啪啪视频观看| 人人澡人人妻人| 91精品三级在线观看| 久久青草综合色| 国产在线免费精品| 咕卡用的链子| 在线看a的网站| 女性被躁到高潮视频| 永久免费av网站大全| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 黄片无遮挡物在线观看| 国产精品蜜桃在线观看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产一区亚洲一区在线观看| 久久这里有精品视频免费| 国产精品欧美亚洲77777| 午夜免费男女啪啪视频观看| 午夜免费鲁丝| 成人免费观看视频高清| 最近手机中文字幕大全| 满18在线观看网站| 99热全是精品| 中文字幕人妻熟女乱码| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 免费在线观看完整版高清| 国产综合精华液| 岛国毛片在线播放| 咕卡用的链子| 人成视频在线观看免费观看| 狂野欧美激情性bbbbbb| 制服丝袜香蕉在线| 亚洲国产最新在线播放| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 亚洲五月色婷婷综合| 欧美日韩成人在线一区二区| 三上悠亚av全集在线观看| 成人国产麻豆网| 国产日韩欧美亚洲二区| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 久热这里只有精品99| 国产亚洲最大av| 国产伦理片在线播放av一区| 卡戴珊不雅视频在线播放| 大陆偷拍与自拍| 热99国产精品久久久久久7| 美女大奶头黄色视频| 国产乱来视频区| 国产一区二区三区av在线| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产成人免费观看mmmm| 久久狼人影院| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 日本黄色日本黄色录像| av电影中文网址| 精品福利永久在线观看| 另类精品久久| 亚洲国产av影院在线观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 午夜久久久在线观看| 日韩成人伦理影院| av卡一久久| 黑丝袜美女国产一区| av不卡在线播放| 男的添女的下面高潮视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 99香蕉大伊视频| 国产日韩欧美亚洲二区| 一边亲一边摸免费视频| 中国美白少妇内射xxxbb| 亚洲精品av麻豆狂野| 99精国产麻豆久久婷婷| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲天堂av无毛| 丝瓜视频免费看黄片| 各种免费的搞黄视频| 国产av一区二区精品久久| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 老司机影院毛片| 亚洲精品日本国产第一区| 2022亚洲国产成人精品| 亚洲美女搞黄在线观看| xxx大片免费视频| 18+在线观看网站| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲成国产人片在线观看| 中文字幕免费在线视频6| 精品一区二区免费观看| 亚洲丝袜综合中文字幕| 精品少妇久久久久久888优播| 国产高清不卡午夜福利| 国产成人aa在线观看| 波多野结衣一区麻豆| 国产日韩欧美亚洲二区| 精品一区在线观看国产| 久久久久久久久久久免费av| 国产精品久久久久久精品电影小说| 久久99蜜桃精品久久| 久久精品国产a三级三级三级| 777米奇影视久久| 18禁国产床啪视频网站| 好男人视频免费观看在线| 亚洲精品aⅴ在线观看| 免费看av在线观看网站| av免费在线看不卡| 午夜免费男女啪啪视频观看| av卡一久久| 亚洲精品aⅴ在线观看| 成人二区视频| 久久久久视频综合| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 大片免费播放器 马上看| 久久99一区二区三区| 热re99久久精品国产66热6| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 欧美97在线视频| 国产成人av激情在线播放| 国产欧美亚洲国产| 亚洲精品日本国产第一区| 国产精品无大码| 91成人精品电影| 中文字幕最新亚洲高清| 成人亚洲欧美一区二区av| 丝袜脚勾引网站| 亚洲天堂av无毛| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产视频首页在线观看| 久久国产精品大桥未久av| 午夜激情av网站| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲三级黄色毛片| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 免费观看在线日韩| 性色av一级| 色吧在线观看| 午夜福利,免费看| 一本久久精品| 街头女战士在线观看网站| 丁香六月天网| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产男女内射视频| av有码第一页| 日韩 亚洲 欧美在线| 成人国产麻豆网| 久久久精品免费免费高清| av在线播放精品| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 欧美 日韩 精品 国产| 欧美精品国产亚洲| 十八禁网站网址无遮挡| 亚洲精品日本国产第一区| 69精品国产乱码久久久| 亚洲国产看品久久| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 人成视频在线观看免费观看| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产成人精品婷婷| 亚洲久久久国产精品| 我要看黄色一级片免费的| 日本与韩国留学比较| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 免费大片18禁| 日本黄大片高清| 晚上一个人看的免费电影| 久久人人爽人人爽人人片va| 黄色一级大片看看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲熟女精品中文字幕| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 最近中文字幕高清免费大全6| 成人毛片60女人毛片免费| 国产精品蜜桃在线观看| 一级a做视频免费观看| 亚洲经典国产精华液单| 国产日韩欧美视频二区| av免费在线看不卡| 91精品三级在线观看| 成年人午夜在线观看视频| 观看av在线不卡| 久久婷婷青草| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 超色免费av| 午夜影院在线不卡| 日日摸夜夜添夜夜爱| 日韩一本色道免费dvd| 伊人久久国产一区二区| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 久热久热在线精品观看| 亚洲欧洲日产国产| 看十八女毛片水多多多| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲av男天堂| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 午夜日本视频在线| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲av日韩在线播放| 免费黄网站久久成人精品| 搡老乐熟女国产| 久久久久久久久久人人人人人人| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲内射少妇av| 夫妻性生交免费视频一级片| 在线观看www视频免费| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲中文av在线| 国产日韩欧美视频二区| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 成人免费观看视频高清| 青春草国产在线视频| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 亚洲精品美女久久av网站| 最近的中文字幕免费完整| av免费在线看不卡| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 九草在线视频观看| 久久人人爽人人片av| xxx大片免费视频| 亚洲经典国产精华液单| 热re99久久精品国产66热6| 国产精品免费大片| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲欧洲日产国产| 在线天堂最新版资源| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 中文字幕最新亚洲高清| 在线看a的网站| 国产乱人偷精品视频| 最近中文字幕高清免费大全6| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲欧美色中文字幕在线|