動物布魯氏菌病快速診斷方法研究進展

吳 彤，王慧煜，吳紹亮，崔金磊，楊曉野，吳紹強

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動物布魯氏菌病快速診斷方法研究進展

吳 彤1,2，王慧煜2，吳紹亮3，崔金磊1，楊曉野1，吳紹強1

布魯氏菌病是一種流行范圍廣、危害嚴重的人畜共患傳染病。近年來，布魯氏菌病的人畜疫情在國內(nèi)外均出現(xiàn)回升勢頭，嚴重影響了流行地區(qū)的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展，并引發(fā)嚴重的公共衛(wèi)生問題。因此，該病的快速準確檢測能為預防、治療提供早期、有效的疫病信息。鑒于布魯氏菌病危害的嚴重性，建立快速有效的檢測方法是十分必要的，是布魯氏菌病早期診斷和疾病控制的關鍵。本文將對多重PCR、實時定量熒光PCR、LAMP等分子生物學檢測方法以及ELISA、膠體金試紙條等免疫學檢測方法兩個方面對布魯氏菌病快速檢測方法的研究進展進行綜述。其中LAMP方法和膠體金免疫層析法對布病的檢測更加適合在基層的推廣和使用，并且免疫層析技術正朝著定量、高靈敏度、多標記檢測等方向發(fā)展。

布魯氏菌??；多重PCR；熒光PCR；環(huán)介導等溫擴增反應；酶聯(lián)免疫吸附試驗；膠體金試紙條；診斷

布魯氏菌病，簡稱布病，是由布魯氏菌屬細菌引起的重大人獸共患疾病。該病是OIE法定上報動物疫病，我國將其列為二類動物疫病。布魯氏菌病嚴重影響著家畜的生產(chǎn)力和動物性產(chǎn)品的生物安全，給畜牧業(yè)發(fā)展造成嚴重的經(jīng)濟損失, 而且嚴重危害人類的健康。進入21世紀，布病疫情日趨加重，呈現(xiàn)從牧區(qū)、半牧區(qū)向農(nóng)區(qū)甚至城市蔓延的趨勢，被WHO稱為“再度肆虐”的傳染病。首先，布魯氏菌病病原復雜，共有6個有效種、19個生物型[1]，而且易感宿主眾多，許多病原變異與背景情況尚不清楚；其次，包括美國等發(fā)達國家在內(nèi)的170多個國家和地區(qū)都發(fā)生過或正在發(fā)生布病，這些國家大都與我國有貿(mào)易往來,更為嚴重的是我國周邊國家疫情頻頻發(fā)生，布病極易通過貿(mào)易或者邊境動物活動跨境傳播到我國。另外，野生動物攜帶布魯氏菌，進而引起家畜患病也是布病老病新發(fā)的原因。因此，布病是我們目前面對的最重要的人獸共患疾病之一，防控布病成為當前我國和全球關注的重大社會公共衛(wèi)生問題。

布魯氏菌的傳統(tǒng)檢測技術主要包括病原分離、培養(yǎng)特性鑒定、生化試驗及血清學等試驗，隨著科學技術的發(fā)展，一些新的技術被應用到布魯氏菌的檢測中來，本文將對其中的一些布魯氏菌病快速診斷方法進行介紹。

1 分子生物學方法

聚合酶鏈式反應(簡稱PCR)創(chuàng)立于1985年，目前已成為病原微生物檢測的常規(guī)技術，具有特異性強、靈敏度高、簡便、快速、對標本的純度要求較低等特點，在PCR方法的基礎上，一些新的分子生物學方法隨之被運用于布魯氏菌的檢測中來。

1.1 多重PCR 目前，多重PCR方法已廣泛應用于各類疫病的檢測，針對布魯氏菌的快速檢測也做出了許多研究。杜昕穎[2]等針對外膜蛋白31 kD、22 kD和2a基因,建立了能特異地檢測標本中布魯氏菌的多重PCR檢測方法。張三東等[3]根據(jù)GenBank上發(fā)表的布魯氏菌omp31、bp26、omp10基因序列，設計合成3對特異性引物，成功地建立了布魯氏菌多重PCR快速檢測方法，在模擬布魯氏菌陽性牛奶標本中最低可檢出細菌數(shù)為80 CFU/mL。陳軍[4]等建立了可以鑒別布魯氏菌6個種的多重PCR方法和用于鑒別感染豬的布魯氏菌5個生物型的多重PCR方法，兩種方法均具有較好的特異性和重復性。陳思[5]等建立了一種快速檢測牛、羊、豬、犬布魯氏菌病的多重PCR方法。該方法檢測牛、羊、豬、犬布魯氏菌的靈敏度分別為1.1×102、5.1×102、3.5×102、2.5×102CFU/mL。應用該方法檢測模擬的布魯氏菌陽性牛奶樣品,靈敏度達到1.0×103CFU/mL。謝芝勛[6]等根據(jù)牛布魯氏菌BCSP-31K基因和牛分枝桿菌23S rRNA建立了多重PCR快速檢測鑒別這兩種病原體的方法。

由此可知，多重PCR應用靈活性強，而且操作簡便、靈敏度高、可快速檢測鑒別多種病原體,在臨床多種病原體混合感染的鑒別診斷上具有獨特優(yōu)勢和很高的實用價值。但多重PCR引物設計復雜，易產(chǎn)生PCR副產(chǎn)物焦磷酸，且結果不穩(wěn)定，這些問題是多重PCR方法需要克服的。

1.2 實時熒光定量PCR 實時熒光定量PCR,是美國PE公司于1995年研制出的一種核酸定量檢測技術，融合了PCR的高靈敏性、DNA雜交的高特異性和光譜技術的高精確定量等優(yōu)點，通過直接探測PCR過程中熒光信號的變化判定目的片段的有無和含量。

曾慶賀等[7]以16S rDNA片段設計了布魯氏菌引物及Taqman探針，構建的布魯氏菌Taqman熒光PCR檢測方法的靈敏度為102拷貝。李光輝[8]等以布魯氏菌編碼31 kDa核周質(zhì)蛋白的BCSP31基因作為靶基因建立了布魯氏菌Taqman實時熒光定量PCR快速檢測方法，并組裝了檢測試劑盒，成為布魯氏菌病診斷、流行病學調(diào)查的有力工具。2010年，夢茹[9]等人建立了二重實時熒光定量技術鑒別診斷布魯氏菌和結核桿菌的方法，該方法對布魯氏菌最低檢出量為20拷貝，結核桿菌為50拷貝，兩病原都存在時為100拷貝,比常規(guī)PCR高100倍。利用此方法檢測樣品的符合率為100%結果證明該試驗建立的方法可用于同時檢測布魯氏菌和結核桿菌。高正琴[10]等建立了運用TaqMan MGB探針檢測布魯氏菌病的實時熒光定量PCR方法。該方法能夠準確地從布魯氏菌陽性樣本中檢測到布魯氏菌DNA，最低能夠檢測到的布魯氏菌數(shù)量為9.3拷貝，比常規(guī)PCR方法的靈敏度高100倍。對773份動物樣本進行檢測，結果TaqMan MGB探針實時熒光定量PCR能檢出53份布魯氏菌陽性樣本，而常規(guī)PCR只檢出37份陽性。Dahouk[11]等也提出，實時熒光定量聚合酶鏈反應可以滿足快速、可靠、靈敏、特異、簡便和自動化的布魯氏菌檢測系統(tǒng)的迫切需要。

目前，實時熒光定量PCR方法引物及探針設計困難，且最佳濃度的確定需要進行長期的摸索。但一旦具備這些條件，該方法快速，靈敏度高，特異性好，易操作，重復性好等優(yōu)勢將更好地適用于臨床上布魯氏菌病的早期診斷和流行病學的監(jiān)測。

1.3 環(huán)介導等溫擴增技術 環(huán)介導等溫擴增(LAMP)是一種在近年來有極大發(fā)展的核酸擴增技術，LAMP具有便捷和特異性高的特性，應用于檢測家畜的布魯氏菌病具有十分重要的意義。

馬國瑞等[12]針對布魯氏菌外膜蛋白基因omp25的4個區(qū)域設計6條引物，建立并優(yōu)化了布病LAMP檢測方法，為推廣基層用LAMP檢測布魯氏菌病提供了一定的理論依據(jù)。潘文等[13]通過試驗發(fā)現(xiàn)應用LAMP檢測布魯氏菌基因組DNA的敏感度達10 pg,且與其他常見的細菌無交叉反應。用該方法檢測人工污染牛布魯氏菌的牛奶樣品，檢測敏感性達5.2×103CFU/mL；還可以直接用于動物組織中布魯氏菌的檢測。藺國珍[14]等建立的LAMP方法能從奶樣和血樣中檢出6個種的布魯氏菌病原，檢出最低限度為9 fg/μL，較PCR方法高出10倍。許鄒亮[15]等針對布魯氏菌外膜蛋白OMP25基因保守區(qū)設計6條LAMP特異引物，用染料羥基萘芬藍(HNB)作為LAMP擴增的指示劑，63 ℃恒溫反應60 min，根據(jù)HNB的顏色變化進行結果判定。結果顯示，本方法最低檢出限約為17 fg/μL。Ohtsuki[16]等利用BCSP31基因序列設計了檢測布魯氏菌的LAMP方法，可最低檢出10 fg基因組的DNA。張利[17]等將LAMP方法應用于布魯氏菌的檢測，并將LAMP方法與熒光定量PCR方法進行了比較。證明LAMP方法可以用肉眼直接判定，成本大幅下降、便捷性明顯提高，而且不需要專用的儀器(普通水浴鍋即可)，因此該方法更適合于農(nóng)村以及偏遠山區(qū)，特別適用于布魯菌病的基層衛(wèi)生防疫。不過,LAMP方法也存在一定問題，首先一個突出的問題就是多重擴增比較困難；其次相比熒光定量PCR更易受到污染，從而影響結果。

所以，對于LAMP方法，我們要做到引物設計嚴謹，試驗過程嚴格無菌，并且選擇最佳染料進行結果的觀察。

2 免疫學方法

近年來，運用于布魯氏菌菌臨床檢測的免疫學方法主要有：虎紅平板凝集試驗(RBPT)、試管凝集試驗(SAT)、補體結合試驗(CFT)、乳環(huán)試驗(MRT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和膠體金免疫層析法(GICA)等。

2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) ELISA檢測方法是目前普及速度較快的一種檢測方法，該方法優(yōu)點很多，包括靈敏性高、特異性好、操作比較簡便、酶標儀直接讀數(shù)可避免主觀判斷帶來的誤差等。

1976年Garin—Bastuji[18]等首次用ELISA檢測布魯氏菌抗體，并發(fā)現(xiàn)其敏感性比SAT要高10～100倍。左玉柱[19]等將原核表達并純化的布魯氏菌外膜蛋白 BP26作為包被抗原，采用方陣法確定包被抗原和待檢血清的最佳工作濃度，進行條件優(yōu)化，建立了牛布魯氏菌間接ELISA抗體檢測方法。該方法對其他相關的牛病病原無交叉反應，其組內(nèi)和組間的變異系數(shù)均小于10%；用建立的間接 ELISA 方法對100份臨床血清樣品進行檢測，與IDEXX公司的同類試劑盒比較，符合率為93%。賈劍峰[20]等應用研制的針對羊布魯氏菌O鏈M抗原的單克隆抗體2D10和牛布魯氏菌O鏈A抗原的單克隆抗體4B8，建立了用于檢測人布魯氏菌抗原的雙抗夾心ELISA方法。經(jīng)檢驗該方法與大腸桿菌O157、小腸結腸炎耶爾森氏菌09及鼠傷寒沙門氏菌不發(fā)生交叉反應，與SAT、分離培養(yǎng)的符合率均為100%。王志明[21]等篩選出3株抗布魯氏菌的特異性單克隆抗體5C10、4D2和3E4，利用單抗5C10建立了檢測血清中布魯氏菌抗體的競爭ELISA(cELISA)方法。張輝[22]等通過對布魯氏菌粘附素SP41蛋白進行表達、純化，以表達重組蛋白為包被抗原，建立了檢測布魯氏菌病綿羊血清抗體的間接ELISA方法。通過交叉實驗、阻斷試驗、重復性試驗表明，該方法的重復性好、特異性強，且陽性檢出率高于虎紅平板實驗和試管凝集實驗。酶聯(lián)免疫吸附試驗擁有它獨特的快速、方便、通量大、成本低、診斷率高等優(yōu)勢，特別適合大量檢測。但同時它也不可避免地存在著一些缺陷，如存在交叉反應、易出現(xiàn)假陽性、重復性不好、干擾因素較多、對試劑的選擇性高、難于同時分析多種病菌等。

2.2 膠體金免疫層析法(GICA) 膠體金免疫層析技術是將膠體金標記技術、免疫檢測技術和蛋白層析技術相結合的以硝酸纖維膜為載體的快速固相膜免疫分析技術。該技術已成為當前獸醫(yī)臨床診斷動物疫病最簡便、快速、敏感特異的免疫學檢測技術之一，有巨大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的應用前景。

程婷婷等[23]以大腸埃希菌表達、純化的OMP31與BP26重組蛋白作為檢測抗原，采用金黃葡萄球菌A蛋白(SPA)作為膠體金標記物質(zhì)，制備膠體金免疫層析試紙條。交叉試驗證明試紙條不與其他非相關疾病感染血清反應，且檢測結果與琥紅平板試驗方法的符合率為92%。朱明東[24]等建立了GICA快速診斷牛布魯氏菌病的方法，結果顯示：GICA快速診斷牛布魯氏菌病最佳血清用量為10 μL，檢測敏感性和特異性分別達到91.3%和97.3%。張付賢[25]等用金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)標記膠體金技術制作金標墊,以親和層析法純的BP26蛋白作為檢測抗原(T線),建立檢測小鼠布魯菌感染血清的膠體金試紙條,可成功鑒別牛布魯菌S19感染和BP26缺失疫苗株YZ2免疫的小鼠。試紙條檢測與布魯菌屬同源性較近的幾株細菌的陽性血清,結果無交叉反應，且敏感性高于虎紅平板凝集試驗檢測方法,近似于ELISA方法，準確性同于ELISA方法,該試紙條具有鑒別布魯菌病自然感染和疫苗免疫的應用前景。1999年Zagoskina[26]等又發(fā)表了應用膠體金顆粒標記蛋白多糖布魯氏菌抗原檢測特異性抗體的斑點免疫金滲濾法，該方法可有效檢測被布魯氏菌感染的牛、兔、人血清。2002年Ismail[27]等建立了膠體金試紙條檢測方法，對分離培養(yǎng)的25份陽性布魯氏菌血清進行檢測，23份陽性，2份陰性，符合率93%。2003年Clavijo[28]等發(fā)表了對比膠體金試紙條與傳統(tǒng)血清學方法檢測布魯氏菌病IgM抗體的試驗，結果對感染布魯氏菌的133份病人血清，SAT試驗檢測陽性率92%，ELISA檢測陽性率為80.5%，膠體金試紙條檢測的陽性率為93.1%。

膠體金免疫層析技術自誕生以來便以其簡便、快速、敏感、特異、成本低、無需設備、儀器，適用范圍廣，結果易于觀察判斷等優(yōu)點被廣泛應用于獸醫(yī)臨床快速檢測和現(xiàn)場診斷上，顯示出了巨大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的應用前景。目前，該技術已成為多領域研究與應用的熱點。然而，當前的免疫膠體金層析技術還有一些不足之處，如定量問題、質(zhì)控指標不一、檢測的靈敏度有待于提高等。隨著該技術的臨床應用，進一步提高免疫膠體金層析試驗的敏感性、特異性，實現(xiàn)多元檢測、定量或半定量檢測是未來膠體金免疫層析技術發(fā)展的方向。

表1 檢測方法對比
Table.1 Comparison of detection methods

檢測方法Detectionmethods檢測靶標Detectiontarget敏感性Sensitive優(yōu)點Advantage缺點Disadvantage分子生物學方法Methodsofmolecularbiology多重PCR抗原略高應用靈活性強,可快速檢測鑒別多種病原體,特異,靈敏引物設計困難,易產(chǎn)生副產(chǎn)物,結果不穩(wěn)定實時熒光定量PCR抗原較高快速,靈敏度高,特異性好,易操作,重復性好引物及探針設計困難,且濃度需要摸索環(huán)介導等溫擴增技術抗原高快速,有效,簡便,成本低,靈敏度高于普通PCR10～1000倍,達到或高于熒光定量PCR試驗本身不需要特殊儀器,但是觀察結果需要特殊儀器,且需對染料進行挑選免疫學方法Methodsofimmunology酶聯(lián)免疫吸附試驗抗體高適合大量檢測,成本低,操作簡便,診斷率較高易出現(xiàn)假陽性,重復性不好,干擾因素較多膠體金免疫層析法抗原、抗體較高操作簡便、快速,成本低,操作要求低,無需設備、儀器,適用范圍廣,結果易于觀察判斷定量問題,靈敏度問題,存在帶現(xiàn)象,質(zhì)控指標不一

3 總 結

綜上所述，隨著國家對布魯氏菌病感染的重視，布魯氏菌病的檢測技術有了很大的發(fā)展。雖然法定的檢測手段仍是以細菌學和免疫學為主，但很難有一種檢測方法能夠滿足所有情況下的檢測需求，分子生物學和血清學技術在檢測布魯氏菌病的應用中發(fā)揮著不同的作用。其中LAMP方法和膠體金免疫層析法對布病的檢測更加適合在基層的推廣和使用，并且免疫層析技術正朝著定量、高靈敏度、多標記檢測等方向發(fā)展[29]?？傊m合于基層檢測的快速免疫層析技術正受到越來越多的關注，可以預見，隨著該技術的不斷發(fā)展，將會研發(fā)出更多的方法加入到布病的快速檢測當中，使得檢測工作更加準確、快速、方便，促進我國動物醫(yī)學及公共衛(wèi)生事業(yè)健康、快速和持續(xù)發(fā)展。

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Yang Xiao-ye, Email: xiaoyeyang122@sohu.com

Research progress on rapid diagnosis of animal brucellosis

WU Tong1,2, WANG Hui-Yu2，WU Shao-liang3，CUI Jin-lei1，YANG Xiao-ye1, WU Shao-qiang1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Huhehot010018,China;2.InstituteofAnimalQuarantine,ChineseAcademyofInspectionandQuarantine,Beijing100029,China；3.ThePeople’sHospitalofLinshu,Shandongprovince,Linshu276700,China)

Brucellosis is a serious zoonosis which is widely prevalent in the world. Recently, the morbidity of human and animal brucellosis has threatened the development of animal husbandry and the safety of public health. Prompt and accurate diagnosis for brucellosis plays a key role in disease control and eradication. The molecular biological method such as multiplex PCR, real-time quantitative PCR, LAMP and the immunological method including ELISA and GICA, used in the rapid brucellosis diagnosis is reviewed in this article.It is indicated that the lamp method and colloidal gold immunochromatography detection of brucellosis is more suitable for the promotion and use in basic and in immunochromatographic technique for quantitative, high sensitivity, multi marker detection.

brucellosis; multiplex PCR; real time quantitative PCR; LAMP; ELISA, GICA; diagnosis

國家質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項基金(No.201510017)資助

楊曉野，Email：xiaoyeyang122@sohu.com

吳紹強，Email：sqwu@sina.com

1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院,呼和浩特 010000；

2.中國檢驗檢疫科學研究院動物檢疫研究所，北京 100029；

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.08.012

R378

A

1002-2694(2016)08-0746-06

2016-03-09；

2016-05-11

3.山東省臨沭縣人民醫(yī)院，臨沭 276700

Supported by the National Quality Inspection and Welfare Industry Research Special Fund(No.20150017)