漢防己甲素對系統(tǒng)性白念珠菌感染小鼠的治療作用

石建萍，李水秀，朱坤舉，張玲玲，張藝山，張 宏

?

漢防己甲素對系統(tǒng)性白念珠菌感染小鼠的治療作用

石建萍1，李水秀2，朱坤舉2，張玲玲2，張藝山2，張 宏2

目的 觀察漢防己甲素在系統(tǒng)性白念珠菌感染小鼠中抗真菌療效、細胞免疫調(diào)節(jié)效應及兩者相關(guān)性。方法 雌性BALB/c小鼠隨機分為對照組和感染組。對照組予生理鹽水，感染組在尾靜脈注射白念珠菌懸液后3 h，經(jīng)腹腔注射不同劑量漢防己甲素(0、15、30、45和90 mg/kg)，每日一次，連續(xù)7 d。觀察小鼠生存時間、腎臟載菌量以及腎臟組織病理學檢查評估抗真菌療效；同時以ELISA法檢測血清和Real-time RT-PCR檢測腎組織中細胞因子IFN-γ、IL-10、TGF-β1 和IL-17A水平的動態(tài)變化。結(jié)果 與腹腔注射生理鹽水的感染小鼠比較，漢防己甲素在90 mg/kg時，腎臟載菌量減少(P<0.05)，與升高血清及腎組織IFN-γ、TGF-β1水平，降低IL-10、IL-17A水平有相關(guān)性；在 45 mg/kg及以下劑量時，生存時間、組織載菌量及細胞因子無差異(P>0.05)。結(jié)論 漢防己甲素在90 mg/kg時對系統(tǒng)性白念珠菌感染小鼠具有治療作用，與其細胞免疫調(diào)節(jié)有相關(guān)性。

漢防己甲素；白念珠菌；小鼠

系統(tǒng)性白念珠菌病成為各種重癥患者和免疫功能低下患者主要感染并發(fā)癥之一[1]。對白念珠菌感染發(fā)病機制的研究表明[2-3]，細胞免疫在白念珠菌感染中占主導地位，是宿主抵御真菌感染的主要機制，免疫細胞發(fā)揮作用的主要方式之一是分泌細胞因子，包括各種促炎因子及抑炎因子，它們在血清和組織中含量的高低，代表著機體抵御病原生物感染的能力及免疫狀況，從而造成疾病的不同發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。

漢防己甲素(Tetrandrine, TET)，是從天然藥用植物防己科千金藤屬植物粉防己的塊根中抽提出來的一種生物堿，藥理作用廣泛，用于抗炎、抗高血壓、抗矽肺、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)等治療[4]。其在免疫調(diào)節(jié)的作用是多方面的[5-6]，包括抑制 T 淋巴細胞、嗜中性粒細胞及單核巨噬細胞等炎癥細胞的增殖和激活、抗自由基損傷、抑制炎癥介質(zhì)釋放。近十年，我們證實，在體外、實驗動物局部外用和單純性陰道念珠菌病志愿患者局部外用，漢防己甲素對氟康唑等唑類藥物抗白念珠菌活性有顯著的增效作用[7-13]。但漢防己甲素對系統(tǒng)性白念珠菌病的體內(nèi)影響，尚未明確。檢索文獻，未見報道。因此，在本實驗中，我們以系統(tǒng)性白念珠菌感染小鼠為研究對象，通過腹腔注射不同劑量漢防己甲素，以小鼠生存時間、腎臟真菌載菌量以及腎臟組織病理學檢查評估其抗真菌療效；以ELISA法檢測血清和Real-time RT-PCR檢測腎臟中細胞因子IFN-γ、IL-10、TGF-β1和IL-17A水平，評估其對各細胞因子的影響情況，初步探討其抗真菌療效、細胞免疫調(diào)節(jié)效應以及兩者的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 白念珠菌標準株SC5314 由William A Fonzi教授( Department of Microbiology and Immunology，Georgetow n University, Washington DC, USA) 惠贈。菌種-80 ℃保存。

1.1.2 藥物 TET，陜西慧科植物有限公司，批號20041226，純度98%。TET 粉用滅菌蒸餾水和0.1 mol/L HCI溶解，配制成15 mg/mL的儲備液，根據(jù)實驗要求將原液分別稀釋為15、30、45和90 mg/kg。

1.1.3 實驗動物 SPF 級雌性BALB/c小鼠，6-8周齡，體質(zhì)量17～20g，由廣東省實驗動物實驗中心提供，批號：No.43007101008664。飼養(yǎng)于深圳北京大學香港科技大學醫(yī)學中心[動物許可證號：SYXK(粵)2010-0106]，動物倫理委員會批準號：(2013-005)。

1.1.4 試劑 ELISA試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；抗小鼠CD4 FITC-CD4抗體、抗小鼠TGF-β1 PE-TGF-β1抗體、抗小鼠IL-17APE-IL17A抗體、抗小鼠IL-10 PE-IL10抗體、抗小鼠IFN-γPE-IFN-γ抗體、破膜劑緩沖液及布雷非德菌素購自Ebioscience USA公司；Trizol總RNA提取試劑盒購自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限；FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；UltraSYBR Mixture購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.1.5 主要儀器設備 ST16R高性能通用臺式冷凍離心機購自美國賽默飛世爾科技有限公司；實時熒光定量PCR儀購自ABI 7000(美國應用生物系統(tǒng)公司)；酶標儀型號SpectraMax M2購自美國分子儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建系統(tǒng)性白念珠菌感染小鼠模型 挑取白念珠菌SC5314 單克隆菌落，接種前菌株經(jīng)2次SDA培養(yǎng)基活化(培養(yǎng)溫度為 35 ℃)后，挑取新培養(yǎng) 24 h 的白念珠菌菌落，采集對數(shù)生長期細胞(搖菌12-16h)，洗滌，懸浮在生理鹽水中，血球計數(shù)板記數(shù)，以5 ×105CFU/mL的白念珠菌懸液0.2 mL尾靜脈注射小鼠。

1.2.2 分組及治療[14]分為6組，每組23只小鼠。對照組：正常小鼠，給予生理鹽水；感染組：白念珠菌懸液接種小鼠，TET0組為生理鹽水； TET15組、 TET30組、TET45組、TET90組分別為TET的不同劑量(15、30、45和90 mg/kg)，在接種小鼠后3 h，開始腹腔注射，每日一次，連續(xù)7 d。

1.3 TET在系統(tǒng)性白念珠菌感染小鼠中抗真菌療效1.3.1 生存時間觀察 各組8只小鼠，從尾靜脈注射白念珠菌懸液，成功構(gòu)建白念珠菌感染小鼠開始觀察，包括在連續(xù)腹腔注射7 d以及停止治療后，觀察至28 d，每天觀察并記錄各組小鼠的死亡情況。

1.3.2 腎臟載菌量測定 以腎臟菌落形成單位(CFU)表示。分別予第1 d、4 d、8 d，每組各取5只小鼠，無菌取小鼠一側(cè)腎臟。具體步驟：①用微量電子天平稱量左側(cè)腎臟的重量；②將腎臟剪成小塊裝入組織勻漿器中，加入1 mL無菌生理鹽水，研磨；③移液器吸取100 μL組織勻漿加入900 μL無菌生理鹽水10倍稀釋，取100 μL接種于SDA平面培養(yǎng)基上，35 ℃孵育48 h；④計數(shù)培養(yǎng)基平面上生長的菌落數(shù)并計算出單位重量小鼠腎臟所含的菌量(log10CFU/g )。

1.3.3 病理組織活檢 第8 d處死小鼠，無菌取出小鼠一側(cè)腎臟浸入4%多聚甲醛固定，乙醇脫水，二甲苯固定透明，石蠟包埋，連續(xù)組織切片(片厚5 μm)。予HE染色和PAS染色。

1.4 TET在系統(tǒng)性白念珠菌感染小鼠中IFN-γ、IL-10、IL-17A 和TGF-β1影響

1.4.1 ELISA檢測血清IFN-γ、IL-10、IL-17A 和TGF-β1水平 分別予第1 d、4 d、8 d，每組各取5只小鼠，內(nèi)眥靜脈取血至肝素抗凝管，通過雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定血清IFN-γ、IL-10、IL-17A 和TGF-β1水平。

1.4.2 Real-time RT-PCR檢測腎臟中IFN-γ、IL-10、IL-17A 和TGF-β1 mRNA相對表達量 Trizol提取腎臟組織總RNA，按照FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒說明書操作步驟合成cDNA，應用SYBR Green染料法，通過ABI 7000定量PCR儀檢測。擴增引物合成，設計長度約15～20 bp，各種細胞因子的引物由上海生物工程有限公司合成，用ddH2O稀釋至200 pmpl/μL，分裝后-20 ℃冰箱保存。

引物序列如下：

基因序 列(5'-3')UB-FAGCCATAGATGAGCGCAAGTUB-RTTACTAGGCAGATGGCCACAIFN-γ-FACAGCCCGGAAGACAATAACIFN-γ-RCAGCTGGTCCTTTGTTTGAAIL-10-FACAGCCGGGAAGACAATAACIL-10-RCAGCTGGTCCTTTGTTTGAAATGF-β1-FACAATTCCTGGCGTTACCTTTGF-β1-RGAAAGCCCTGTATTCCGTCTIL-17A-FACAGCCTGGAAGACAATAACIL-17A-RCAGCTGGTCCTTTGTTTGAA

以相同的cDNA擴增目的基因，分別取cDNA 1 μL加入PCR八連管，依次加入UltraSYBR Mixture 10 μL，目的基因上下游引物各0.5 μL，無菌蒸餾水8 μL，構(gòu)成20 μL反應體系，每個樣品做3次重復。擴增條件：95 ℃預變性10 min，變性95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 32 s，共40個循環(huán)。結(jié)果根據(jù)目標基因和內(nèi)參基因UB 得到的Ct值，采用2-△△Ct法進行樣品間相對定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 TET對系統(tǒng)性白念珠菌感染小鼠中抗真菌療效

2.1.1 生存時間觀察 對照組和TET0、TET15、TET30、TET45、TET90組中小鼠中位生存時間分別為25 d、12 d、12 d、12 d、12 d、16 d。經(jīng)Log-rank檢驗，與TET0組生存率曲線比較，TET15、TET30和TET45組無差異(P>0.05)；而TET90組與對照組和其他TET劑量組比較，有差異(P<0.05)，見圖1。

圖1 TET在各組中的生存曲線Fig.1 Survival curves of control group and TET at 0 to 90 mg/kg groups respectively in mice infected with C. albicans 5314. Each group consisted of 8 mice.

Mice were infected with i.v. for 5×105 via SC5314 C. albicans yeast cells. At 3h later they received TET i.p. at 0, 15, 30, 45 and 90 mg/kg body weight． Kidneys CFU were assessed on day1, 4, 8. Bar indicates standard error (S.E.). Each group consisted of 5 mice.*P<0.05.圖2 TET在系統(tǒng)性白念珠菌小鼠的抗真菌作用Fig.2 Effect of TET in the treatment in mice with Candida albicans.

2.1.2 腎臟載菌量測定 在不同時間點，與TET0組比較，TET15、TET30和TET45組檢測腎臟載菌量，無差異(P>0.05)，TET15、TET30、TET45組間兩兩比較，也無差異(P>0.05)，均隨著時間推移，腎臟真菌載菌量增加。在第4 d，TET90組與TET0、TET15、TET30、TET45組兩兩比較，無差異(P>0.05)，而在第8d，TET0、TET15、TET30、TET45和TET90組腎臟載菌量均數(shù)分別為8.67、8.51、8.77、8.50 和6.34 log10 CFU/g，TET90組出現(xiàn)腎臟載菌量減少，與各組比較，均有差異(F=37.28，P=0.000)?？梢奣ET在45 mg/kg及以下劑量時，均無抗真菌作用，而TET 90 mg/kg連續(xù)腹腔注射7 d后，出現(xiàn)腎臟載菌量減少，提示TET在90 mg/kg劑量對白念珠菌有一定抑制作用。見圖2。2.1.3 病理組織學檢查 在第8 d，TET0、TET15、TET30、TET45各組中，HE染色鏡下可見腎間質(zhì)充血、水腫，有大量中性粒細胞浸潤，腎小管部分壞死，核固縮；PAS染色中可見大量，成團菌絲；而TET90組小鼠，HE染色鏡下可見腎小管胞漿紅染變性，少量中性粒細胞浸潤；PAS 染色可見少量菌絲。見圖3。

圖3 系統(tǒng)性白念珠菌感染小鼠中各組腎臟的病理學變化(HE×200，PAS×200)Fig.3 Histopathologic assessment of the kidneys in mice with disseminated candidiasis (HE×200，PAS×200)

2.2 TET對系統(tǒng)性白念珠菌感染小鼠中IFN-γ、IL-10、IL-17A 和TGF-β1影響

2.2.1 血清ELISA 檢測IFN-γ、IL-10、IL-17A 和TGF-β1水平 與對照組比較，TET0組在第1 d，IFN-γ水平出現(xiàn)降低，IL-10、IL-17A 水平升高，TGF-β1水平無變化；在第4 d，IFN-γ水平升高，IL-17A 進一步升高，IL-10、TGF-β1出現(xiàn)下降，在第8 d，IFN-γ、TGF-β1水平出現(xiàn)下降，IL-10、IL-17A明顯升高。TET15、TET30和TET45組各小鼠的IFN-γ、IL-10、IL-17A 和TGF-β1動態(tài)水平與TET0組一致，無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。TET90組小鼠在第1 d、第4 d，各細胞因子動態(tài)變化與其他感染組一致，無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。但在第8 d，TET90組檢測IFN-γ、TGF-β1水平升高，IL-10、IL-17A水平下降，與TET0、TET15、TET30和TET45組比較，均有差異(P<0.05)，見圖5。

圖5 血清ELISA 檢測IFN-γ、IL-10、IL-17A 和TGF-β1水平Fig.5 Serum level of IFN-γ, IL-10, TGF-β1 and IL-17A by ELISA detection

2.2.2 RT-PCR 檢測腎組織中IFN-γ、IL-10、IL-17A 和TGF-β1mRNA表達水平 在腎組織RT-PCR結(jié)果中，與正常小鼠比較，TET0、TET15、TET30和TET45組在第1 d，IFN-γ、TGF-β1 mRNA表達量降低，IL-10、IL-17A mRNA表達量升高，均有差異(P<0.05)；在第4 d，IFN-γ、IL-17A mRNA表達量升高，IL-10、TGF-β1 mRNA表達量下降，均有差異(P<0.05)；在第8 d，IFN-γ、TGF-β1 mRNA表達量出現(xiàn)下降，IL-10、IL-17A mRNA表達量升高，均有差異(P<0.05)。而TET0、TET15、TET30和TET45各組間在每個時間點各細胞因子mRNA表達量，兩兩比較，均無差異(P>0.05)。TET90組，在第1 d、第4 d，與正常小鼠比較，均有差異(P<0.05)；而與TET0、TET15、TET30和TET45各組比較，細胞因子表達量變化趨勢與各組一致，均無差異(P>0.05)；但在第8 d，TET90組的小鼠IFN-γ、TGF-β1 mRNA表達量出現(xiàn)升高，IL-10、IL-17A mRNA表達量出現(xiàn)降低，與正常小鼠比較，均有差異(P<0.05)；與TET0組、TET15、TET30和TET45各組比較，均有差異(P<0.05)，見圖6。

圖6 Rt-PCR 檢測腎組織中IFN-γ、IL-10、IL-17A 和TGF-β1mRNA表達水平Fig.6 Relative expression of IFN-γ, IL- 10, TGF-β1 and IL-17A mRNA in Kidney

2.3 相關(guān)性分析 第8天時，TET90組小鼠腎臟載菌量下降，發(fā)現(xiàn)與與血清IFN-γ、TGF-β1濃度呈明顯負相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)分別為-0.790和-0.827；P均<0.05)；與血清IL-10、IL-17A濃度呈正相關(guān)相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)分別為0.911和0.795，P均<0.05)，見圖7A。與腎臟組織中IFN-γ、TGF-β1 mRNA表達水平呈明顯負相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)分別為-0.730和-0.841；P均<0.05)，與IL-17A、IL-10 mRNA表達水平呈明顯正相關(guān)相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)分別為0.847和0.971；P均<0.05)見圖7B。

3 討論

有關(guān)TET免疫方面的研究報道中，調(diào)節(jié)免疫機能的作用是多方面的，包括抑制T淋巴細胞增殖，下調(diào) CD4+和CD8+T細胞亞群的 Th1和 Th2細胞因子表達、抑制嗜中性粒細胞及單核巨噬細胞等炎癥細胞的增殖和激活、抗自由基損傷、抑制炎癥介質(zhì)釋放或?qū)寡装Y介質(zhì)的效應[5-6]。He FQ等報道[15]，發(fā)現(xiàn)TET通過抑制NF-KB p65表達，減少IL-1β和TNF-α的分泌，從而減少小膠質(zhì)損害的神經(jīng)毒性和保護小膠質(zhì)神經(jīng)細胞；Chen Y[16]等報道，TET通過下調(diào)樹突狀細胞的CD80 和CD86的表達，從而提高了IL-10的分泌，延長了小鼠皮膚移植存活時間。

(7A): scatter diagram of Pearson correlation analyses between kidneys CFU and Serum level of IFN-γ, IL-10, TGF-β1 and IL-17A;(7B): scatter diagram of Pearson correlation between kidneys CFU and relative expression of IFN-γ, IL- 10, TGF-β1 and IL-17A mRNA in kidney.圖7 TET90組腎臟載菌量與細胞因子的相關(guān)性分析Fig.7 Correlatation analyzes between kidneys CFU and cytokines in TET90 group

IFN-γ 能活化中性粒細胞、NK細胞，刺激血管內(nèi)皮細胞和白細胞合成的粘附分子，促進Th1細胞發(fā)育和抑制Th2細胞活化與增殖，刺激B細胞產(chǎn)生的抗體類型向調(diào)理素方向轉(zhuǎn)變[17]。IL-10細胞不但能抑制Th1細胞合成IFN-γ，還可抑制單核/巨噬細胞、樹突狀細胞抗原提呈能力，同時是一種抗炎因子，具有抑制炎癥反應的發(fā)生發(fā)展和減輕炎癥損傷的作用[18]。IL-17A是Th17細胞分泌的最重要的細胞因子，與炎癥因子TNF-α等有協(xié)同作用，放大其致炎效應。在白念珠菌感染的臟器組織中Thl7細胞以及IL-17、IL-21、IL-22等的表達明顯升高，其濃度隨著病情加重而逐漸升高趨勢，說明IL-17的表達水平與白念珠菌炎癥程度及疾病進展密切相關(guān)，被認為是介導白念珠菌感染中炎癥反應的重要細胞[19]。TGF-β1在抑制免疫反應、介導免疫耐受等過程中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)在白念珠菌感染小鼠，Treg細胞抑制Th1和Th2，但能提高Th17[20]。

目前CD4+T細胞可分化為Thl、Th2、Treg、Th17等4個細胞亞群。Th1/Th2、Th17/Treg是兩對相互制約的細胞，其比值平衡對維持機體免疫穩(wěn)態(tài)有重要作用。其中IFN-γ、IL-10、TGF-β1和IL-17A分別是Th1、Th2、Treg、Th17具有代表性的一種細胞因子，這些細胞因子交叉調(diào)節(jié)Th1、Th2、Treg和Th 17細胞，既可誘發(fā)有效免疫應答起保護作用，又可因在此過程中引起的炎癥反應造成器官損傷[21-22]。

由于腎臟的血液循環(huán)較其他組織更為豐富，有利于菌的生長繁殖，且腎小球血管迂曲，血流較慢，不利于真菌的清除，因此腎臟常是機體內(nèi)白念珠菌最易感染且最后一個清除的臟器，所以我們以腎臟載菌量作為真菌療效的指標。

在本實驗中，早期TGF-β1改變只在腎臟組織中檢測到，在血清未檢測到。一方面表明白念珠菌作為一個致病菌抗原對機體的腎臟免疫系統(tǒng)有明顯的刺激作用，從而調(diào)動機體整體免疫反應。另一方面可見通過RT-PCR檢測腎組織中細胞因子表達較ELISA檢測血清中細胞因子水平在早期更有提示作用。在白念珠菌感染早期的血清、腎組織最先調(diào)動的是IL-17A的升高，促進早期炎癥反應，IFN-γ水平的變化可能受到IL-17A的促進而逐漸呈上升作用，但在第4 d隨著IL-10與TGF-β1水平的逐漸下降，促炎因子及抑炎因子的平衡失調(diào)；在第8 d，IFN-γ與TGF-β1水平下降，IL-10與IL-17A水平的升高，致使Th1/Th2，Treg/Th17平衡失調(diào)。早期因促炎細胞因子升高，機體組織損害，后期又因免疫抑制因子升高造成機體免疫低下，使得疾病逐漸惡化至死亡。組織病理上可見到腎小管、腎小球充血，壞死的改變。隨著時間推移，小鼠腎臟載菌量逐漸增加，小鼠于第10 d開始出現(xiàn)死亡，平均生存時間為12 d。在給予感染小鼠 15、30和45 mg/kg的TET治療后，其細胞因子動態(tài)變化、小鼠生存時間、真菌載菌量與給予生理鹽水的感染小鼠一致。而當TET 90 mg/kg劑量時，在第8 d，細胞因子的變化與其他組不一致，血清、腎組織中IFN-γ和TGF-β1水平上升，IL-10和Th17A水平下降。在TET 90 mg/kg，出現(xiàn)小鼠生存時間延長、真菌載菌量有下降、組織病理炎癥反應減少，菌絲減少，與TET其他各組，均有差異(P<0.05)。且相關(guān)性分析表明腎臟載菌量與血清、腎組織IFN-γ、TGF-β1水平與呈負相關(guān)性，與IL-10、Th17A水平呈正相關(guān)性?？梢奣ET在90 mg/kg時，機體免疫中Th1/Th2趨于表現(xiàn)為Th1為主，Treg/Th17趨于表現(xiàn)為Treg，對白念珠菌感染小鼠的免疫影響趨于正性調(diào)節(jié)，機體免疫力促使有效抵抗真菌感染。而TET 在45 mg/kg及以下劑量時，所引起的各CD4+細胞因子水平改變還不足以引發(fā)Th細胞之間的極化，不足以增強機體抵御白念珠菌感染的能力及機體免疫狀況。

[1] Thakur JK, Arthanari H, Yang F, et al. A nuclear receptor-like pathway regulating multidrug resistance in fungi [J]. Nature, 2008,452(7187):604-609.DOI: 10.1038/nature06836.

[2] Rebecca A, Drummond, Wallace C,et al. Cutting edge: failure of antigen-specific CD4+T cell recruitment to the kidney during systemic candidiasis [J]. J Immunol, 2014,193(11):5381-5385.DOI: 10.4049/jimmunol.1401675. Epub 2014 Oct 24

[3] Kim J,Han BJ,Kim H,et al.Th1 immunity induction by ginsenoside Re involves in protection of mice against disseminated candidiasisdue to Candida albicans [J]. Int Immunopharmacol, 2012,14(4):481-486.DOI: 10.1016/j.intimp.2012.08.014. Epub 2012 Aug 29

[4] Lu JJ, Bao JL, Chen XP, et al. Alkaloids isolated from natural herbs as the anticancer agents [J]. Evid Based Complement Alternat Med,2012,2012:485042.DOI: 10.1155/2012/485042. Epub 2012 Sep 4

[5] Lai JH, Ho LJ, Lu KC, et al. Western and Chinese antirheumatic drug-induced T cell apoptotic DNA damage uses different caspase cascades and is independent of Fas/Fas ligand Interaction [J]. J Immunol, 2001, 166 (11):6914-6924.

[6] Jang BC, Lim KJ, Paik JH, et al. Tetrandrine-induced apoptosis is mediated by activation of caspases and PKCdelta in U937 cells [J]. Biochem Pharmacol, 2004, 67(10):1819-1829.

[7] Zhang H, Gao AL, Li FX, et al. Mechanism of action of tetrandrine,a natural inhibitor ofCandidaalbicansdrug efflux Pumps [J].Yakugaku Zasshi, 2009, 129(5)：623-630.

[8] Guo H, Xie SM, Li SX, et al. Synergistic mechanism for tetrandrine on fluconazole againstCandidaalbicansthrough the mitochondrial aerobic respiratory metabolism pathway[J]. J Med Microbiol. 2014,63(7):988-96.DOI: 10.1099/jmm.0.073890-0. Epub 2014 May 1

[9] Gao LQ, Zhang H, Zhang XL, et al. Differential proteomic analysis of fluconazole-sensitiveCandidaalbicansbefore and after tetrandrine treatment[J].Chin Dermatol,2011, 44(8):560-563.(in Chinese)

高來強, 張宏, 張曉利, 等. 白念珠菌經(jīng)漢防己甲素作用前后的差異蛋白質(zhì)組學分析[J].中華皮膚科雜志, 2011, 44(8):560-563.[10] Wang KL, Zhang H, Jiang HH, et al.Invitrostudy on tetrandrine as a synergist to fluconazole in murine model of vaginal candidiasis[J]. Chin J Zoonoses, 2007, 23(5): 474-478,483. (in Chinese)

王凱麗，張宏，姜紅浩，等. 漢防己甲素對氟康唑抗白念珠菌活性的增效作用的體內(nèi)實驗研究[J]. 中國人獸共患病學報,2007,23(5):474-478，483.

[11] Zhang X,Guo H,Gao L,et al. Molecular mechanisms underlying the tetrandrine-mediated reversal of the fluconazole resistance ofCandidaalbicans[J]. Pharm Biol,2013,51(6):749-752.DOI: 10.3109/13880209.2013.764537. Epub 2013 Mar 25.

[12] Zhang XL,Zhang GH,Wang ZY,et al. Proteomic analysis reveals that Adh1p is involved in a synergistic fluconazole and tetrandrine mechanism against Candida albicans[J]. Pharmazie, 2013, 68(12):951-954.

[13] Shi JP, Zhang H, Zhang ZD,et al. Clinical investigation on the synergistic effect of tetrandrine on the antifungal activity of fluconazole for vulvovaginal candidiasis[J]. Chin J Zoonoses,2009,25(11):1121-1123.(in Chinese)

石建平, 張宏, 張志東, 等.漢防己甲素對氟康唑外用治療單純性外陰陰道念珠菌病增效作用的臨床研究[J].中國人獸共患病學報,2009,25(11):1121-1123.

[14] Shi J, LI S, MA Z,et al.Acute and sub-chronic toxicity of tetrandrine in intravenously exposed female BALB/c Mice[J]. Chin J Integr Med,DOI:10.1007/s11655-015-2303-2.2015,10.29

[15] He FQ, Qiu BY, Li TK, et al. Tetrandrine suppresses amyloid-β-induced inflammatory cytokines by inhibiting NF-κB pathway in murine BV2 microglial cells[J].Immunopharmacol, 2011,11(9):1220-1225.DOI: 10.1016/j.intimp.2011.03.023. Epub 2011 Apr 13

[16] Chen Y, Lai HS, Chiang BL, et al.Tetrandrine attenuates dendritic cell-mediated alloimmune responses and prolongs graft survival in mice[J].Lanta Med, 2010,76(13):1424-1430.DOI:10.1055/s-0029-1240909. Epub 2010 Feb 25.

[17] Fatahinia M,Khosravi AR,Shokri H. Propolis efficacy on TNF-α, IFN-γ and IL2 cytokines production in old mice with and without systemic candidiasis [J].J Mycol Med, 2012,22(3):237-242. DOI:10.1016/j.mycmed.2012.05.004. Epub 2012 Aug 9

[18] Shimonkevitz R, Bar-Or D, Harris L, et al. Granulocytes, including neutrophils, synthesize IL-10 after traumatic pancreatitis:case report [J]. Trauma, 2000,48(1):165-168.

[19] Hernández-Santos1 N and Gaffen SL.Th17 cells in immunity toCandidaalbicans[J]．Cell Host Microbe. 2012,11(5): 425-435.DOI:10.1016/j.chom.2012.04.008.

[20] Whibley N, MacCallum DM, Vickers MA, et al. Expansion of Foxp3+ T-cell populations byCandidaalbicansenhances both Th17-cell responses and fungal dissemination after intravenous challenge[J].Eur J Immunol, 2014,44(4):1069-1083.DOI: 10.1002/eji.201343604. Epub 2014 Feb 13

[21] Mottet C, Uhlig H H, Powrie F. Cutting edge:cure of colitis by CD4+CD25+regulatory T cells [J]. Immunol, 2003,170:3939-3943.

[22] Zhou L, Lopes JE, Chong MM, et al. TGF-beta-induced Foxp3 inhibitsT(H) 17 cell differentiation by antagonizing ROR gammat function [J]. Nature, 2008,453(7192):236-240. DOI:10.1038/nature06878. Epub 2008 Mar 26

Zhang Hong, Email: tzhangh@jnu.edu.cn

Tetrandrine on the dynamic changes of cytokines and antifungal effect in mice withCandidaalbicans

SHI Jian-ping1, LI Shui-xiu2, ZHU Kun-ju2, ZHANG Ling-ling2, ZHANG Yi-shan2, ZHANG Hong2

( 1.ShenzhenShajingAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Shenzhen518000,China;2.TheFirstAffiliatedHospitalandInstituteofMycology,JinanUniversity,Guangzhou510632,China)

To study the therapeutic effect of tetrandrine(TET) on the mice infected withCandidaalbicans. The mice with disseminated candidiasis were randomly divided into experimental group and control group, The serum level of the IFN-γ, IL-10, TGF-β1 and IL-17A were determined by ELISA and kidney IFN-γ, IL-10, TGF-β1 and IL-17A mRNA expression levels were tested with real-time RT-PCR method. At the same time, kidmey fungal burdens were measured. Results showed that therapy with TET ranging from 15 to 45 mg/kg did not affect organ fungal burdens and survival times (P>0.05), and has nothing with the cellular immunity. However, 90 mg/kg of TET decreased organ fungal burdens and prolonged survival times, and correlated with increasing levels of cytokines of IFN-γ and TGF-β1, decreasing levels of IL-17A and IL-10 when observed in mice infected with SC5 314 compared with control group on day 8 after infection. Thus, 90 mg/kg of TET has therapeutic effects on disseminated candidiasis of mice.

tetrandrine;Candidaalbicans; mice

國家自然科學基金(No.81171542/81471995)廣東省醫(yī)學科研基金(No.A2016377)聯(lián)合資助

張宏，Email: tzhangh@jnu.edu.cn

1.廣州醫(yī)學院附屬深圳沙井醫(yī)院皮膚科,深圳 518000

2.暨南大學附屬第一醫(yī)院、暨南大學真菌病研究所，廣州 510632

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.08.002

R378

A

1002-2694(2016)08-0689-08

2015-10-25；

2016-02-20

Supported by grants from the National Natural Science Foundation of China (Nos. 81171542/81471995) and the Guangdong Provincial Medical Research Fund(No. A2016377)