高效液相色譜測定山羊瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸條件優(yōu)化的研究

蘇利紅，曹雨莉，李 飛，孫小琴，劉瑞芳

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西楊凌712100）

反芻動物瘤胃就像一個密閉發(fā)酵罐，在動物消化系統(tǒng)中有著重要作用，其對飼料養(yǎng)分的消化吸收依賴于其中微生物動力學(xué)過程中產(chǎn)生的大量的揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）。VFA是碳鏈為1～6的脂肪酸，對動物體代謝作用最為重要的是乙酸、丙酸和丁酸，約占瘤胃發(fā)酵VFA總量的95%。VFA是反芻動物能量利用中一個重要的中間代謝產(chǎn)物，其含量及組成比例是反映瘤胃微生物發(fā)酵類型和消化代謝活動的重要指標(biāo)。據(jù)報道瘤胃液VFA約可提供反芻動物所需能量的70%［1］。而乙酸、丙酸和丁酸所提供的能量效率不同，所以VFA的比例影響著其供能的總量［2］。瘤胃VFA可使瘤胃維持在一個較理想的酸性環(huán)境，適合微生物的繁殖和寄生，這些微生物又進(jìn)一步通過發(fā)酵瘤胃飼料，使瘤胃處于一個良性循環(huán)的酸性環(huán)境中［3］。VFA還能增加動物血漿中胃動素和胃泌素的水平，從而促進(jìn)胃的排空，增加胃及上部腸道黏膜細(xì)胞的分裂增殖，刺激胃蛋白酶、胰島素、降鈣素的分泌和膽囊收縮。此外，VFA還能有效提高動物腸道抵御病原微生物的能力，其中乙酸和丙酸能抑制志賀菌的生長，高濃度的VFA可以抑制沙門菌和大腸埃希菌的生長。VFA還能幫助動物機體維持腸道黏膜的屏障作用，可以有效預(yù)防潰瘍性結(jié)腸炎和其他炎癥。所以，精確測定瘤胃中VFA的含量極其組成比例，不僅為研究瘤胃消化代謝提供重要參數(shù)，而且有利于動物疾病的診治［4］。

VFA傳統(tǒng)的測定方法有比色法、滴定法、熒光法及色譜法等，比色法只能測定單一的酸，不能測混合酸；滴定法分析速度較慢，步驟繁瑣，容易產(chǎn)生誤差，同時，不能將不同種類的揮發(fā)性脂肪酸有效分離；熒光法測定VFA的原理是將VFA轉(zhuǎn)化為具有熒光特性的物質(zhì)，然后通過熒光分光光度計測定VFA的含量，此方法因為需要VFA可以轉(zhuǎn)化成帶有強烈熒光特性的物質(zhì)，因此不能廣泛應(yīng)用；氣相色譜法測定VFA樣品前處理的方法較繁瑣，特別是酯化、萃取酯化等中間步驟需要耗費相當(dāng)長的時間?？傊⒁环N快速、簡單、有效的測量VFA的方法是非常有意義的。反相高效液相色譜測量脂肪酸具有快速、預(yù)處理簡單、分析結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點，而利用高效液相色譜測定VFA的報道較少［5－7］。高效液相色譜中流動相通常是各種低沸點溶劑和水溶液，它對組分有親和力，并參與固定相對組分的競爭。同時，流動相pH是影響分離效果的一個關(guān)鍵因素。

因此，本試驗主要從流動相、pH等方面研究高效液相色譜測定VFA的條件選擇和優(yōu)化。為廣泛利用高效液相色譜測定VFA提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 高效液相色譜分析儀（日立，Hi－tachi L－2000型）；進(jìn)樣器（安捷倫，Agilent 7693A）；精密pH計（賽多利斯，PHS－3C型）。

1.1.2 主要試劑 磷酸、磷酸二氫鉀、乙酸、丙酸、丁酸標(biāo)準(zhǔn)品均為分析純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；甲醇、乙腈為高效液相色譜純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；試驗用水為超純水綜合系統(tǒng)（PL5124）制得的超純水。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 安裝瘤胃瘺管的山羊作為瘤胃液供體，用采樣管于晨飼前在瘤胃腹囊中進(jìn)行樣品采集，將采集的樣品用4層脫脂紗布過濾，取4mL濾液并加入250mL／L偏磷酸溶液1mL，置－20℃保存。樣品解凍后于4℃以19 000r／min離心15min，取上清液過0.22μm濾膜，進(jìn)樣。

1.2.2 色譜條件 色譜柱為 Agilent TC－C18柱（250mm×4.6mm i.d.5μm）；流速為0.6mL／min；進(jìn)樣體積20μL；紫外檢測波長210nm；柱溫為室溫。流動相經(jīng)0.22μm纖維素膜過濾，超聲波脫氣。1.2.3 試驗分組 本試驗流動相設(shè)置兩個水平，甲醇和乙腈，pH也設(shè)置兩個水平，2.05和2.30，根據(jù)流動相組成和pH，將流動相分為A、B、C、D 4種水平組合（表1）。

表1 不同流動相組成Table 1 Composition of different mobile phases

1.2.4 回收率和精密度的計算 用瘤胃液空白樣測定本底值，在瘤胃液空白樣中分別加入200mmol／L的標(biāo)樣，檢測4種測定條件的回收率，回收率的計算利用以下的公式：

加標(biāo)回收率＝ （加標(biāo)試樣測定值－試樣測定值）÷加標(biāo)量×100%。

日內(nèi)精密度：測定同1天內(nèi)不同時間點4種檢測條件下3種VFA的濃度，每個測定項目重復(fù)6次，計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

日間精密度：連續(xù)3d測定4種檢測條件下3種VFA的濃度，每個測定項目重復(fù)6次，計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 同一樣品不同流動相組間比較由t檢驗完成，結(jié)果用ˉx±SD表示，顯著水平為P＜0.05。統(tǒng)計分析由SPSS 17.0完成。

2 結(jié)果

2.1 乙酸、丙酸、丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線及計算結(jié)果

精確配制一定濃度乙酸、丙酸和丁酸（33.838、26.498、39.700mmol／L）的混合標(biāo)樣，上樣前經(jīng)過0.22μm的合成纖維素酯膜過濾。以摩爾濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程如表2所示。

表2 高效液相色譜測定乙酸、丙酸和丁酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Standard curves of content measuring of acetic acid，propionic acid and butanoic acid by high performance liquid chromatography

2.2 乙酸、丙酸、丁酸標(biāo)準(zhǔn)液圖譜的采集

利用流動相A、B、C、D對乙酸、丙酸、丁酸標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行分離采集圖1～圖4所示的圖譜。根據(jù)峰形和保留時間采集圖譜，4個不同流動相測定乙酸、丙酸和丁酸標(biāo)準(zhǔn)液的圖譜如圖1～4所示，圖1和圖2中，乙酸的出峰時間分別為4.11和4.10，丙酸的出峰時間均為6.64，丁酸的出峰時間均為14.00；圖3和圖4中，乙酸的出峰時間為3.71，丙酸的出峰時間分別為5.08和5.11，丁酸的出峰時間為8.93和9.01。從這些數(shù)據(jù)可看出，同種流動相在不同pH條件下標(biāo)準(zhǔn)液（乙酸、丙酸和丁酸）的出峰時間基本一致。

2.3 回收率和精密度的測定

本研究通過測定精密度和回收率對4種檢測體系的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性進(jìn)行了評價。檢測結(jié)果如表3和表4所示。結(jié)果顯示，4種檢測體系測定VFA的回收率均在90%以上，檢測的日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差＜2%，日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差＜10%。這表明4種檢測條件檢測的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性均能達(dá)到VFA檢測的要求。

2.4 瘤胃液樣品測定

利用甲醇和乙腈作流動相測定瘤胃液中的乙酸、丙酸、丁酸，根據(jù)采集的圖譜，得知樣品中3種酸對應(yīng)的峰面積和濃度如表5和表6所示。

圖1 乙酸、丙酸和丁酸標(biāo)準(zhǔn)樣圖譜 （流動相A）Fig.1 Standard chromatograms of acetate，propionate and butyrate（Mobile phase A）

圖2 乙酸、丙酸和丁酸標(biāo)準(zhǔn)樣圖譜（流動相B）Fig.2 Standard chromatograms of acetate，propionate and butyrate（Mobile phase B）

圖3 乙酸、丙酸和丁酸標(biāo)準(zhǔn)樣圖譜（流動相C）Fig.3 Standard chromatograms of acetate，propionate and butyrate（Mobile phase C）

圖4 乙酸、丙酸和丁酸標(biāo)準(zhǔn)樣圖譜（流動相D）Fig.4 Standard chromatograms of acetate，propionate and butyrate（Mobile phase D）

表3 不同測定條件下乙酸、丙酸和丁酸檢測的回收率Table 3 Recovery of acetic acid，propionic acid and butanoic acid under different test conditions

表4 不同測定條件下乙酸、丙酸和丁酸檢測的精密度（n＝6）Table 4 Precision of acetic acid，propionic acid and butanoic acid under different test conditions

表5 瘤胃液樣品乙酸、丙酸和丁酸峰面積和濃度Table 5 Peak area and concentration of acetate，propionate and butyrate in rumen fluid sample

表6 不同流動相測定乙、丙、丁酸濃度的比較Table 6 Concentration comparison of acetate，propionate and butyrate with different mobile phases

同一瘤胃液樣品在4個流動相下分別采集圖譜，并根據(jù)圖譜的峰面積計算乙酸、丙酸和丁酸的濃度，如表5所示。樣品1和樣品2是甲醇作流動相時測定的結(jié)果，而樣品3和樣品4是乙腈作流動相時測定的結(jié)果。從表5、表6中看出，同種流動相測定樣品時，乙酸、丙酸和丁酸的濃度值相近，分別用甲醇和乙腈作流動相測定時，乙酸、丙酸和丁酸的濃度有差異，經(jīng)顯著性檢驗差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

在高效液相色譜分析中，甲醇和乙腈是兩種常用的流動相溶劑。甲醇具有價格低廉的優(yōu)點，但也存在活性高，容易與樣品反應(yīng)的不足。而且甲醇在低波長下會吸收一定量的紫外線，這些均會降低分析方法的靈敏度。相比較而言，乙腈具有洗脫能力強，不易與待測物反應(yīng)的優(yōu)點，但也存在毒性強，價格高的缺點［9］。為了優(yōu)化高效液相色譜準(zhǔn)確檢測瘤胃液中3種VFA含量的條件，本研究首先對甲醇和乙腈兩種有機溶劑作為流動相對乙酸、丙酸和丁酸的分離效果進(jìn)行了比較。結(jié)果表明甲醇和乙腈均能對3種VFA有效分離，其差異只是體現(xiàn)在出峰時間的不同。這與孫緒順［10］利用甲醇作流動相的研究結(jié)果相一致。

流動相的pH是影響待分析物分離效果的另一個重要因素。趙景嬋等認(rèn)為流動相pH直接決定了VFA以何種形態(tài)存在，在檢測中只有使流動相pH控制在一定范圍內(nèi)，才能抑制溶質(zhì)的離子化，減少譜帶拖尾、改善峰形，提高分離的選擇性［8］。為了摸索最佳pH，宋永康等［11］曾分析了pH 為2.2、2.4、2.5、2.6、2.8、3.0幾種流動相對3種酸的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以pH＝2.4的流動相分離效果最好。在本研究中，根據(jù)實驗室前面研究的經(jīng)驗，設(shè)置了2.05和2.30兩個流動相pH，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在兩種pH條件下甲醇和乙腈分離效果相接近，這與白冬梅等［12］的發(fā)現(xiàn)是一致的，她們也發(fā)現(xiàn)流動相pH為2.2和2.5的流動相對混合酸的分離效果相近。

在液相和氣相色譜分析中，精密度和回收率是常用的評價檢測體系穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性的兩個指標(biāo)。精密度系指在規(guī)定的測定條件下，用同一個樣品，經(jīng)多次測定所得各個結(jié)果之間的接近程度。由此可見精密度越低檢測方法越穩(wěn)定。而回收率是加標(biāo)實測的結(jié)果減去未加標(biāo)所測的結(jié)果，其差值同加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的之比即為樣品加標(biāo)回收率。本研究對4種檢測體系的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性進(jìn)行了評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種檢測體系日內(nèi)精密度均小于2%；日間精密度均小于10%，回收率在92%～98%之間。就檢測的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性而言，4種檢測體系均可用于瘤胃液VFA的測定。

結(jié)果表明，以甲醇和乙腈做流動相，對3種有機酸均能很好分離，其區(qū)別主要體現(xiàn)在出峰時間不同。用乙腈作流動相時，3種酸的出峰時間均比甲醇作流動相時的要短，而且特別是丁酸的出峰時間比用甲醇作流動相時提前5min左右。但考慮到乙腈價格較高，且有毒性，本研究推薦在檢測3種有機酸時，如果時間允許，本著經(jīng)濟(jì)、安全、環(huán)保的考慮建議用甲醇做流動相；如果時間緊，經(jīng)費寬裕，環(huán)保設(shè)施到位，建議考慮用乙腈做流動相；與流動相的組成相比，流動相的pH 只要在一定范圍內(nèi)（2.0～2.5），對3種酸的分離效果影響不大。

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