奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定、血清型及耐藥性研究

王 鳳，宋 立，湯德元＊，張純萍，徐士新，魏蕊蕊

（1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550025；2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島266109）

奶牛乳房炎 （Bovine mastitis）是當(dāng)今世界各國奶牛生產(chǎn)中造成經(jīng)濟(jì)損失最多的一種疾病，成為嚴(yán)重制約奶產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要原因之一，是科研、生產(chǎn)領(lǐng)域都很關(guān)心的問題［1］。奶牛乳房炎不僅影響產(chǎn)奶量，而且影響乳的品質(zhì)，甚至危及人的健康［2］。因此，及時、準(zhǔn)確地掌握病區(qū)奶牛乳房炎病原菌的種類、流行血清型和耐藥性情況是治療該地區(qū)奶牛乳房炎的關(guān)鍵。本項(xiàng)研究對北京、河南、天津及廣西等地區(qū)奶牛乳房炎病原菌的流行情況進(jìn)行調(diào)查，分析這些地區(qū)奶牛乳房炎的主要致病菌，并對分離到的致病菌進(jìn)行了血清型鑒定及耐藥性研究，為這些地區(qū)奶牛乳房炎的有效防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 大腸埃希菌23株，金黃色葡萄球菌16株，鏈球菌38株，從北京、河南、天津及廣西等地區(qū)臨床型乳房炎的82份新鮮牛奶分離獲得。大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25922，金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC26085，鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 49619購于北京天壇中國藥品生物制品檢定所。

1.1.2 試劑 普通營養(yǎng)瓊脂、血瓊脂、麥康凱瓊脂，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所基礎(chǔ)保障室提供。金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基為青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；API試條為梅里埃生物公司產(chǎn)品；MIC藥敏板，參考美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（CLSI）推薦的方法［3］，將抗菌藥稀釋成不同測試濃度包被在96孔板里，委托天津市金章科技有限公司凍干制成；金黃色葡萄球菌血漿凝固酶分型血清為日本生研株式會社產(chǎn)品；大腸埃希菌菌體抗原分型血清為丹麥國家血清研究院產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌常規(guī)鑒定 大腸埃希菌：麥康凱瓊脂篩選，純化，API20E試條鑒定，再進(jìn)行O抗原血清型鑒定；金黃色葡萄球菌：金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基篩選，純化，API Staph試條鑒定，再進(jìn)行血漿凝固酶血清型鑒定；鏈球菌：綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基 篩選，API 20Strep試條鑒定、CAMP試驗(yàn)鑒定。

1.2.2 分子生物學(xué)鑒定 參考文獻(xiàn)［4］，根據(jù)大腸埃希菌phoA和金黃色葡萄球菌nuc基因；無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌16SrDNA基因，分別合成上下游引物（表1）。提取細(xì)菌基因組DNA，按常規(guī)PCR方法進(jìn)行檢測。

表1 基因擴(kuò)增引物Table 1 Primers of gene amplification

1.2.3 藥敏試驗(yàn)及耐藥率 菌液接種于MIC藥敏板，35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h～18h，參考美國CLSI折點(diǎn)判讀結(jié)果，ATCC25922，ATCC26085，ATCC49619質(zhì)控菌株結(jié)果在質(zhì)控范圍，則試驗(yàn)成立。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

從82份乳樣本中分離鑒定出細(xì)菌110株，其中大腸埃希菌23株，占分離菌的20.9%；金黃色葡萄球菌16株，占14.5%；鏈球菌38株（無乳鏈球菌（B群）16株、停乳鏈球菌10株、乳房鏈球菌12株），占34.5%；真菌1株，占0.9%；其余是弗氏檸檬酸桿菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌、陰溝桿菌等。分離的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌總數(shù)占分離菌株比例的70.0%。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌及乳房鏈球菌分別擴(kuò)增出622、484、162、264、451bp左右的基因片段，與目的片段大小一致（圖1～圖5）。

圖1 大腸埃希菌phoA基因PCR鑒定Fig.1 PCR identification of phoA gene of Escherichia coli

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

23株大腸埃希菌對利福平耐藥率最強(qiáng)，達(dá)100%，對氨芐西林等次之，耐藥率均低于17.40%，對其他5種藥物敏感；16株金黃色葡萄球菌除對青霉素和氨芐西林的耐藥率最強(qiáng)，達(dá)81.20%以上，對紅霉素等次之，耐藥率均低于31.30%，對萬古霉素等8種藥物敏感；38株鏈球菌對鏈霉素等耐藥率最強(qiáng)，達(dá)52.60%以上，對恩諾沙星等10種藥物次之，耐藥率均低于39.50%，對萬古霉素敏感?？傊?，此次分離的病原菌除對部分藥物100%敏感外，對其他藥物均表現(xiàn)出不同程度的耐藥（表2）。

圖2 金黃色葡萄球菌nuc基因PCR鑒定Fig.2 PCR identification of nuc gene of S.aureus

圖3 無乳鏈球菌16SRDNA基因PCR鑒定Fig.3 PCR identification of 16SrDNA of S.agalactiae

圖4 停乳鏈球菌16SRDNA基因PCR鑒定Fig.4 PCR identification of 16SrDNA of S.dysgalactiae

圖5 乳房鏈球菌16SrDNA基因PCR鑒定Fig.5 PCR identification of 16SrDNA of of S.uberis

表2 77株奶牛乳房炎病原菌耐藥試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The drug resistance results of 77strains of pathogenic bacteria of dairy cow mastitis

2.3 大腸埃希菌血清型鑒定結(jié)果

23株大腸埃希菌中有16株能定型，分屬9種血清型，優(yōu)勢血清型為O13、O17和O91，這3種血清型的菌株占已鑒定菌株的58.82%，少數(shù)菌株有2種以上血清型。北京地區(qū)的血清型有O126、O148；廣西地區(qū)的血清型有 O13、O17、O18ab、O68、O91、O93。另有7株菌株未能定型，占分離菌株的30.43%（7／23）（表3）。

2.4 金黃色葡萄球菌血漿凝固酶血清型鑒定

根據(jù)凝固酶血清型判定標(biāo)準(zhǔn)，得到16株金黃色葡萄球菌的凝固酶分型結(jié)果，Ⅴ 型（6.25%）、Ⅵ 型（43.75%）、Ⅶ 型（18.75%）、復(fù)合型（31.25%）為優(yōu)勢血清型，未分離到Ⅱ 型、Ⅲ 型和Ⅷ 型，分型率達(dá)到100%。其中Ⅵ 型、復(fù)合型占75.00%，且Ⅵ 型對16種抗生素耐藥率稍高于Ⅶ 型及復(fù)合型，Ⅴ 型對16種抗生素100.00%敏感（表4）。

表3 16株大腸埃希菌血清型分布Table 3 Serotype distribution of 16strains of E.coli

表4 優(yōu)勢凝固酶型菌株對16種藥物的耐藥試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The drug resistance results of S.aureus of prevalent staphylocoagulase serotypes

3 討論

奶牛乳房炎是一種以奶牛乳腺組織發(fā)生各種不同程度的炎癥反應(yīng)為主要特征的疾病，是奶牛的常見病。根據(jù)奶牛乳房及分泌的乳汁有無肉眼可見的變化，可以將奶牛乳房炎分為臨床型乳房炎和隱性乳房炎（其中隱性乳房炎又稱亞臨床型乳房炎或非臨床型乳房炎）兩種，二者可以隨著環(huán)境和體況的改變發(fā)生互相轉(zhuǎn)化。臨床型乳房炎癥狀較輕時造成產(chǎn)乳量和乳品質(zhì)下降，嚴(yán)重時患病乳區(qū)腫脹硬化，乳汁中帶血、帶膿、大量帶菌，甚至?xí)?dǎo)致乳房失去泌乳能力。每年會有大約10%的患病牛因乳房炎而被迫淘汰［2］。奶牛隱型乳房炎，乳汁的pH＞7.0，偏堿性；乳汁中有凝乳塊、絮狀物和纖維，無臨床癥狀表現(xiàn)，是臨床型乳房炎發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)。在乳汁檢查中的體細(xì)胞數(shù)量增加（體細(xì)胞數(shù)大于1.5×106個／mL），乳汁中可以檢出致病菌。相對而言，隱性乳房炎在奶牛群體中更加普遍，據(jù)統(tǒng)計(jì)能夠占發(fā)病數(shù)的75%～95%［3］，由于隱性乳房炎無臨床癥狀表現(xiàn)，并且乳汁無明顯異常肉眼可見變化，常被人們忽視。

3.1 細(xì)菌分離鑒定

引起奶牛乳房炎的病原菌有20多種［7］，由于區(qū)域不同，時間不同或飼養(yǎng)環(huán)境的不同，病畜所感染的病原微生物種類也不盡相同。根據(jù)病原微生物的傳播特點(diǎn)，大體可分為兩類，一類是接觸傳染性病原微生物，另一類為環(huán)境性病原體。周慶國等報道，臨床型乳房炎中鏈球菌的檢出率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他致病菌，其中以無乳鏈球菌為主［8］。鏈球菌通過鏈球菌溶血素和致熱外毒素對動物機(jī)體產(chǎn)生毒副作用［9－10］。也有學(xué)者研究稱臨床病例中，鏈球菌和金黃色葡萄球菌的出現(xiàn)具有一定的廣泛性，國內(nèi)占90%～95%，國外乳房炎病例中約占74%［11］。其次是大腸埃希菌和念珠菌［12］。本試驗(yàn)中總共分離到110株細(xì)菌，其中大腸埃希菌和鏈球菌61株，所占的比例為55.45%。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，牛場患臨床型乳房炎的病牛，其病原菌中鏈球菌的分離率相對較高，金黃色葡萄球菌分離率較低，其中大部分病例乳樣中都是2種或2種以上菌共同存在。而試驗(yàn)中所檢出的細(xì)菌以鏈球菌為主，包括無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌，占34.5%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于金黃色葡萄球菌的14.5%（表2），與已有報道一致。

3.2 大腸埃希菌血清型分析

奶牛乳房炎大腸埃希菌血清型較復(fù)雜，試驗(yàn)表明，23株致病性大腸埃希菌中，有16株已定型，包含9種血清型，其中O13、O17、O18ab、O91和O148較多，為本次分離致病性大腸埃希菌的優(yōu)勢血清型，占已定型菌株的81.25%，另有7株未定型，占分離菌株的30.04%。李玉等［13］對19株奶牛乳房炎致病性大腸埃希菌的血清型研究稱O91、O92、O101、O112、O142等為優(yōu)勢血清型，而本試驗(yàn)中鑒定出的O91血清型占定型菌株的18.75%，其余的均未檢出；斯木吉德等［14］對245株內(nèi)蒙古牛源致病性大腸埃希菌的血清型進(jìn)行鑒定，優(yōu)勢血清型為O60、O89、O119等8種。結(jié)果表明，不同地區(qū)奶牛大腸埃希菌血清型差異較大，同一奶牛場可存在多個血清型，大多數(shù)奶牛場有本場的優(yōu)勢血清型，不同來源的大腸埃希菌血清型也不同，部分菌株有2種以上血清型。

3.3 金黃色葡萄球菌凝固酶分型分析

在日本已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于金黃色葡萄球菌的流行病學(xué)研究，目前在我國相關(guān)研究報道還很少。本研究采用商品化的凝固酶分型血清確定分離株的血清型別，以了解我國動物源金黃色葡萄球菌的流行狀況。試驗(yàn)表明，本次金黃色葡萄球菌凝固酶血清分型率為100%，優(yōu)勢血清型為Ⅵ型與復(fù)合型，不同奶牛場優(yōu)勢血清型不盡相同。劉洋等［15］對牛源性金黃色葡萄球菌的凝固酶分型研究，其型別主要分布在Ⅶ型與復(fù)合型；有學(xué)者對人源革蘭陽性球菌耐藥監(jiān)測研究結(jié)果表明，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的優(yōu)勢血清型為復(fù)合型和Ⅲ型［16］，丹麥有研究表明Ⅶ型為優(yōu)勢血清型，日本對食物污染溯源的研究稱Ⅴ型占優(yōu)勢。本研究結(jié)果同時也表明，中國動物源金黃色葡萄球菌凝固酶血清型別的分布比較特殊，有著獨(dú)特的流行趨勢，和國內(nèi)醫(yī)源菌株以及國外分離株的差異較大。

3.4 耐藥性

從藥敏試驗(yàn)結(jié)果可知，不同細(xì)菌的耐藥情況不同，大腸埃希菌對利福平的耐藥性最強(qiáng)，耐藥率高達(dá)100%，但對奧格門丁、阿米卡星和多黏菌素E等敏感性較高；金黃色葡萄球菌對青霉素G和氨芐西林耐藥性嚴(yán)重，耐藥率在81.25%以上，而對頭孢噻呋、先鋒唑啉、阿米卡星等8種藥物100%敏感；鏈球菌的耐藥率較上述2種稍高，除對萬古霉素100%外，對其他15種藥物均有不同程度的耐藥，且對四環(huán)素、克林霉素、阿米卡星等5種藥物耐藥率在高達(dá)52.63%以上。表5中3種優(yōu)勢血清型菌株的耐藥情況表明不同凝固酶型的金黃色葡萄球菌耐藥狀況也有差異，凝固酶Ⅵ型和復(fù)合型菌株的耐藥情況比Ⅶ型菌株嚴(yán)重，Ⅶ型菌對青霉素G、頭孢西丁、氨芐西林和紅霉素的耐藥率在33% 以上，對其他12種藥物均表現(xiàn)100%敏感。凝固酶Ⅴ型菌株對所有測試藥物都敏感。所以筆者認(rèn)為有必要對奶牛乳房炎病原菌進(jìn)行分離鑒定，交叉用藥和有針對性地用藥，使之取得最佳治療效果且避免耐藥性的產(chǎn)生。

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